Summary
Los cultivos organoides derivados del paciente de adenocarcinoma ductal pancreático son un modelo tridimensional rápidamente establecido que representa compartimentos de células tumorales epiteliales con alta fidelidad, lo que permite la investigación traslacional sobre esta malignidad letal. Aquí, proporcionamos métodos detallados para establecer y propagar organoides, así como para realizar ensayos biológicos relevantes utilizando estos modelos.
Abstract
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) se encuentra entre los tumores malignos más letales. Recientemente, se han descrito métodos de cultivo organoides de próxima generación que permiten el modelado tridimensional (3D) de esta enfermedad. Los modelos de organoides (DOP) derivados del paciente pueden aislarse tanto de muestras quirúrgicas como de pequeñas biopsias y formarse rápidamente en el cultivo. Es importante destacar que los modelos organoides preservan las alteraciones genéticas patógenas detectadas en el tumor del paciente y son predictivos de la respuesta al tratamiento del paciente, permitiendo así estudios traslacionales. Aquí, proporcionamos protocolos integrales para adaptar el flujo de trabajo de cultivo de tejidos para estudiar modelos de organoides 3D, matriz incrustada. Detallamos métodos y consideraciones para aislar y propagar organoides PDAC primarios. Además, describimos cómo se preparan los medios organoides a medida y se controla la calidad en el laboratorio. Por último, describimos los ensayos para la caracterización posterior de los modelos organoides, como el aislamiento de ácidos nucleicos (ADN y ARN), y las pruebas de fármacos. Es importante destacar que proporcionamos consideraciones críticas para implementar la metodología organoide en un laboratorio de investigación.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad letal caracterizada por un diagnóstico tardío en la mayoría de los pacientes, una falta de terapias eficaces y una tasa de supervivencia global de 5 años resultante que permanece inferior al 10%1. Sólo el 20% de los pacientes son diagnosticados con una enfermedad localizada adecuada para la intervención quirúrgica curativa2,3. Los pacientes restantes son típicamente tratados con una combinación de agentes quimioterápicos que son eficaces en una minoría de pacientes4,5. Para hacer frente a estas necesidades clínicas apremiantes, los investigadores están trabajando activamente en estrategias de detección temprana y el desarrollo de terapias más eficaces. Para acelerar la traducción clínica de descubrimientos importantes, los científicos están empleando modelos de ratón genéticamente diseñados, xenoinjertos derivados del paciente, líneas de células monocapa y, más recientemente, modelos organoides6.
Cultivo organoide epitelial tridimensional utilizando factor de crecimiento y condiciones ricas en Wnt-ligand para estimular la proliferación de células progenitoras no transformadas se describieron por primera vez para el intestino del ratón7 y se adaptaron rápidamente al tejido pancreático humano normal8. Además del tejido ductal normal, la metodología organoidea permite el aislamiento, expansión y estudio de PDAC8humano. Es importante destacar que el método apoya el establecimiento de organoides a partir de muestras quirúrgicas, así como biopsias finas y de agujas de núcleo, permitiendo a los investigadores estudiar todas las etapas de la enfermedad9,10. Curiosamente, los organoides derivados del paciente recapitulan subtipos transcriptómicos tumorales bien descritos y pueden permitir el desarrollo de plataformas de medicina de precisión9,11.
Los protocolos organoides actuales para PDAC permiten la expansión exitosa de más del 70% de las muestras de pacientes de pacientes quimio-nave9. Aquí presentamos los métodos estándar empleados por nuestro laboratorio para aislar, expandir y caracterizar los organoides PDAC derivados del paciente. Se han descrito otras metodologías de organoides de PDAC12,13, pero no se ha realizado a fondo ninguna comparación de estos métodos. Como esta tecnología es relativamente nueva y avanza rápidamente, esperamos que estos protocolos continúen evolucionando y mejorando; sin embargo, los principios del manejo de los tejidos y el cultivo organoide seguirán siendo útiles.
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Protocol
Toda la recolección de tejido humano para uso de investigación fue revisada y aprobada por nuestra Junta de Revisión Interna (IRB). Todos los siguientes protocolos se realizan en condiciones asépticas en un entorno de laboratorio de cultivo de tejido de mamíferos.
1. Preparación de medios
- Preparación de medios condicionados.
NOTA: El medio organoide pancreático humano requiere abundantes factores de crecimiento y nutrientes, así como suplementos de medios acondicionados para proporcionar suficiente estimulación del crecimiento para la expansión de los organoides. Ambos medios acondicionados descritos a continuación se preparan a partir de líneas celulares disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). Para obtener protocolos y materiales completos, consulte los sitios web de los fabricantes.- Producir medios acondicionados R-spondin1 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- En primer lugar, expanda las células 293T que expresan R-spondin1 utilizando métodos de selección de antibióticos apropiados (Zeocin) en presencia de abundante suero (10%). Cuando produzca medios acondicionados, retire y lave la selección de antibióticos y el suero de tal manera que no haya antibióticos ni suero en los medios acondicionados finales. Es importante destacar que el medio acondicionado debe esterilizarse después de la recolección (0,2 m) para evitar la contaminación cruzada.
- Almacene los medios acondicionados alícteados a 4 oC para uso a corto plazo (dentro de 6 meses) o a -20 oC para almacenamiento a largo plazo (más de 6 meses). Se deben evitar los ciclos de congelación-descongelación.
- Producir medios condicionados L-Wnt-3A de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- En primer lugar, expanda las células L-M (TK-) que expresan L-Wnt-3A utilizando métodos de selección de antibióticos apropiados (G-418) en presencia de suero abundante (10%). Al producir medios acondicionados, retirar y lavar la selección de antibióticos de tal manera que no haya antibióticos en los medios con condición final; sin embargo, mantenga el suero durante todo el cultivo y el acondicionamiento. Es importante destacar que los medios acondicionados recogidos deben esterilizarse por filtro (0,2 m) para evitar la contaminación cruzada.
- Almacene los medios acondicionados acondidos a 4 oC para su uso a corto plazo, o a -20 oC para el almacenamiento a largo plazo. Se deben evitar los ciclos de congelación-descongelación.
- Para el control de calidad, realice un ensayo TOPFLASH para probar la actividad Wnt de R-spondin1 y los medios acondicionados L-Wnt-3A solos y en combinación de acuerdo con un protocolo14publicado previamente.
- Producir medios acondicionados R-spondin1 de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Preparación de medios basales: Utilice medios basales para la preparación de medios organoides completos, así como pasos de lavado para el trabajo organoide. Suplemento avanzado DMEM/F-12 con glutamina a una concentración final de 1x, HEPES (10 mM), y penicilina/estreptomicina (100 U/ml). Almacene los medios basales a 4 oC.
- Organoid Preparación completa de medios: Complementar el medio basal con medios acondicionados R-spondin1 a una concentración final de 10% v/v, Medios acondicionados L-Wnt-3A a una concentración final de 50% v/v, EGF humano (50 ng/mL), FGF humano (100 ng/mL), Gastrina humana I (10 nM), Nggin de ratón (100 ng/mL), A83-01 (5 00n nM), suplemento B27 (1x), nicotinamida (10 mM), N-acetilcisteína (1,25 mM) y Primocina (100 g/ml).
- Para los aislamientos organoides primarios, cultivos organoides descongelados y cultivos que comienzan con células individuales, incluyen inhibidor de Rho quinasa Y-27632 a una concentración final de 10,5 M.
- Preparar el organoide humano en hielo y almacenara a 4oC para su uso en el plazo de un mes. Por esta razón, recomendamos la preparación semanal fresca de los medios de comunicación.
2. Aislamiento de los organoides PDAC
NOTA: Descongelar la solución de extracto de membrana del sótano (BME) (factor de crecimiento reducido; ver Tabla de materiales)sobre hielo en un entorno de 4 oC (nevera o cámara frigorífica) durante al menos 12 horas antes de su uso. Incubar las placas de cultivo de tejido para cultivo organoide en una incubadora de 37 oC durante al menos 12 h antes de su uso.
- Recoger y transportar una muestra tumoral extraída quirúrgicamente para su investigación en una solución de almacenamiento tamponada para mantener la viabilidad del tejido. Utilice medios basales o una solución de almacenamiento de tejidodisponible comercialmente.
- Proceda a aislar los organoides tan pronto como sea posible después de recibir el espécimen. El tejido se puede almacenar en la solución de almacenamiento hasta 24 horas después de la cirugía y todavía producir organoides.
- Una vez en el laboratorio, transfiera el tumor a un plato de cultivo de tejido de 10 cm y retire la solución de almacenamiento.
- Mientras manipula el tejido con fórceps metálicos, pique el tumor con un escalpelo #10 en pequeños fragmentos de 1 mm3 o menos. Los fragmentos más grandes tardarán más en digerirse; por lo tanto, tienen como objetivo generar tamaños de fragmentos de tejido homogéneos. Si el tejido ya está desagregado o en menos de 1 mm3 fragmentos, omita este paso.
- Transfiera los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de medios basales. Mezclar invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min. Después de girar, retire los medios basales cuidadosamente para evitar la pérdida de fragmentos de tejido.
- Al tubo que contiene los fragmentos de tejido añadir 9 ml de medios basales y 1 ml de 10x solución de colágeno suave/hialuronidasa. Para evitar el aglutinamiento de células durante la digestión, suplementar esta solución con 20 ml de 10 mg/ml de DNAse I solución. Mezclar invirtiendo el tubo varias veces.
- Incubar la digestión enzimática a 37oC en un nutator o rotador. Para una mezcla adecuada durante la digestión, los fragmentos de tejido deben moverse constantemente a través de la solución.
NOTA: El tiempo para esta disociación enzimática del tumor debe determinarse empíricamente para cada espécimen. Una digestión exitosa del tumor se caracteriza por la disminución en el tamaño de los fragmentos de tejido hasta que no son claramente discernibles a simple vista. Concomitantemente, la opacidad de la solución aumentará a medida que se liberen fragmentos de tejido microscópico. - Después de 30 min, retire el tubo cónico de la incubadora de 37oC y observe. Si los fragmentos de tejido siguen siendo claramente visibles, continúe la disociación a 37 oC con mezcla constante. Repita esta observación cada 30 minutos hasta que la mayoría o todos los fragmentos de tejido se hayan disociado. Dependiendo de la rigurosidad de la mezcla, así como el tamaño y la cantidad de fragmentos tumorales, este paso puede tomar tan poco como 30 minutos para muestras pequeñas o tan larga como 12 h para muestras de tumores más grandes.
- Una vez completada la disociación enzimática, centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min. Después del giro, un pellet celular debe ser visible y el sobrenadante debe ser claro, lo que indica que todas las células se han hilado fuera de la solución. Si ese no es el caso, repita el giro.
- Retire con cuidado el sobrenadante para evitar perder el pellet celular. Lave inmediatamente las células con medios basales de 10 ml mezclando suavemente los tubos con inversión. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min. Retire cuidadosamente los medios basales para evitar la pérdida de células y repita este paso de lavado una vez más para un total de dos lavados.
- Después del segundo lavado, retire todos los medios basales cuidadosamente y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos.
- En este momento, coloque una alícuota de medios completos organoides en un baño de agua de 37 oC para precalentar.
- Mezcle el pellet celular con BME helado mientras mantiene el tubo en hielo. La densidad de sembración debe ser alta para el aislamiento organoide. Para un pequeño pellet (volumen de 50 l) utilice 200 ml de BME, mientras que para un pellet grande (volumen de 200 l) utilice 800 s de BME. Mezcle las células y el BME sobre hielo con una pipeta p200 hasta que la solución parezca homogénea evitando crear burbujas en la solución.
- Detecte una cúpula de 100 l en el centro de un pozo de una placa de 12 pocillos precalentada utilizando una pipeta p200. Repita esto hasta que se haya dispensado toda la solución BME. Transfiera cuidadosamente la placa a la incubadora de 37oC para permitir que el gel BME se solidifique.
- Después de 10 min, recuperar la placa y añadir 1 ml de medios completos organoides precalentados por pozo. Dispensar los medios en el lado del pozo para evitar la interrupción de la cúpula BME.
- Observe los fragmentos celulares usando un microscopio de cultivo de tejido invertido usando una lente 4x en brightfield.
NOTA: Las células individuales y los fragmentos microscópicos de tejido deben ser claramente visibles. Un aislamiento exitoso se caracteriza por la aparición de más de 10 organoides después de 24–48 h; la cultura debe ser confluente dentro de una semana. Como las muestras tumorales son heterogéneas, algunos aislamientos organoides son más desafiantes, ya que solo unos pocos organoides crecen por pozo, como se muestra en la Figura 1. En este caso, permita que el cultivo continúe hasta dos semanas para maximizar el número de celdas disponibles para el passing. Para tener en cuenta el consumo de medios y la evaporación durante el cultivo, redondee los cultivos con 200 ml de medios completos organoides precalentados cada 5 días.
3. Passaging de PDAC Organoids
- Recuperar la placa de la incubadora de cultivo de tejidos. Con un elevador de células estéril, levante suavemente la cúpula BME de tal manera que esté flotando en el medio completo. Evite raspar la parte inferior del pozo para no eliminar ninguna célula monocapa unida al plástico, ya que se trata típicamente de fibroblastos.
- Con una pipeta p1000, transfiera cuidadosamente la cúpula y los medios BME a un tubo cónico de 15 ml. Repita este paso para cada pozo que contenga organoides.
- Lavar suavemente cada pocal que fue cosechado con 1 ml de medios basales fríos, y transferir al tubo de 15 ml que contiene los organoides.
- Mezcle a fondo la solución y los organoides con una pipeta p1000 y gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min. Después de girar, una capa de BME que contiene organoides en suspensión y un pellet organoide aparecerá en la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente el sobrenadante, evitando la pérdida de la capa BME/organoid. Coloque el tubo sobre hielo.
- Agregue 10 ml de solución de recuperación de células heladas (CRS) al tubo y mezcle completamente por inversión. Esto despolimerizará las matrices proteicas de la BME gelificada a 4oC. Incubar sobre hielo durante 30 min mientras se mezcla cada 3 minutos por inversión. Si está disponible, coloque el tubo en una mezcladora giratoria en una cámara frigorífica o a 4 oC durante 30 minutos.
- Después de la incubación de 30 minutos, gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min. El pellet organoide debe ser aparente mientras que la capa BME debe desaparecer. Si la capa BME se reduce en tamaño pero sigue siendo visible, incubar durante 30 minutos adicionales a 4 oC con la mezcla y repetir el giro.
- Una vez que el BME ha sido despolimerizado, retire el CRS dejando atrás el pellet organoide. Lave los organoides con medios basales de 10 ml mezclando con inversión. Gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min y retire el sobrenadante. Coloque el tubo con el pellet organoide sobre hielo durante al menos 5 minutos.
- Opcionalmente, si se desea una preparación de una sola célula, incubar los organoides con 3 ml de trippsina suplementada con 30 ml de 10 mg/ml de dnase I solución para evitar aglutinamiento de las células durante la digestión.
- Incubar la reacción enzimática a 37 oC con una suave inversión mezclando cada 2 minutos durante un máximo de 10 minutos.
- Para detener la reacción enzimática, agregue 10 ml de medios basales fríos y gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min.
- Lavar las células con medios basales de 10 ml mezclando con una inversión suave. Gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min y retire el sobrenadante y repita el lavado una vez más. Coloque el tubo con el pellet celular en hielo durante al menos 5 minutos.
NOTA: Recomendamos realizar este paso cada 3-5 pasajes durante el mantenimiento regular de los organoides para generar un cultivo homogéneo con un gran número de organoides.
- Agregue el BME helado helado al pellet celular y mezcle suavemente sobre hielo hasta que la solución sea homogénea usando una pipeta p200. Al evitar generar burbujas en la mezcla, pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos 5-10x, colocando la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del tubo para ayudar a romper mecánicamente los organoides. Como guía, utilice 4-6 veces el volumen del pellet BME/célula de tal manera que la relación de división no sea superior a 1:2 de un pasaje al otro.
- Detectar una cúpula de 100 l en el centro de un pozo de una placa de 12 pocillos precalentada utilizando una pipeta p200; repetir hasta que se haya dispensado toda la solución de BME. Transfiera cuidadosamente la placa a la incubadora de 37oC para permitir que el gel BME se solidifique. Después de 10 min, recuperar la placa y añadir 1 ml de medios completos organoides precalentados por pozo. Dispensar los medios en el lado del pozo para evitar la interrupción de la cúpula BME.
- Los organoides deben reformarse y comenzar a crecer dentro de las 24 h. Los cultivos organoides se pasan típicamente 7-10 días dependiendo de la densidad de cultivo y la proliferación celular. Si es necesario, redondee los cultivos con 200 ml de medios completos organoides precalentados cada 5 días para compensar el agotamiento y evaporación del factor de crecimiento.
4. Congelación y descongelación de organoides PDAC
- Para congelar los organoides, proceder a cosechar los organoides y despolimerizar el BME como se describe en los pasos 3.1–3.7.
- Al pellet celular, agregue 1 ml de medio de congelación, mezcle suavemente y transfiera la mezcla a un criovial preetiquetado.
- Coloque el criovial en un recipiente de congelación para mantener una disminución de temperatura constante y colocarlo en un congelador de -80 oC. Después de 24 a 48 h, transfiera los viales congelados al almacenamiento de nitrógeno líquido. Los organoides pueden ser crioconservados durante meses a años usando este método.
- Para descongelar los organoides, recupere el criovial congelado del almacenamiento de nitrógeno líquido. Transporte el vial congelado sobre hielo seco a la sala de cultivo de tejidos.
- Colocar el criovial congelado en el baño de agua de 37oC para descongelar rápidamente los organoides y transferir el contenido del vial a un tubo cónico de 15 ml que contenga 9 ml de medios basales calentados a temperatura ambiente.
- Gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min y retire el sobrenadante. Coloque el tubo con el pellet organoide sobre hielo durante al menos 5 minutos.
- Proceda a resuspender en BME y placar los organoides como se describe en los pasos 3.9–3.11.
NOTA: Los cultivos organoides se recuperan lentamente después de un ciclo de congelación/descongelación, por lo tanto, los cultivos pueden crecer hasta dos semanas antes del paso.
5. Caracterización de los organoides PDAC
NOTA: La caracterización de los organoides debe realizarse en un cultivo establecido después de varios pasajes para disminuir el riesgo de contaminación por tipos de células no epiteliales como fibroblastos y células inmunitarias.
- Extracción de ácido nucleico de organoides PDAC
- Placa organoides en una placa de 12 pozos dedicada a la extracción de ácido nucleico. Placa no más de 100 s de BME por pozo. Para un rendimiento adecuado de ADN/ARN, placa al menos 2-4 pozos por cultivo. Cultivar organoides hasta 5 días hasta que los cultivos estén cerca de confluentes pero carentes de los restos celulares excesivos que se acumulan en cultivos a largo plazo.
- Recuperar la placa de la incubadora de 37 oC y eliminar por completo todo rastro de medios completos organoides, dejando sólo la cúpula BME que contiene los organoides en la placa.
- Añadir 900 l de reactivo de fenol ácido (ver Tabla de Materiales)a cada pocal y mezclar bien con una pipeta p1000 hasta que la solución se vuelva homogénea. El BME se disolverá completamente en el reactivo de fenol ácido y los organoides se lejitas después de una incubación corta de 5 minutos.
ADVERTENCIA: El fenol ácido es un producto químico peligroso que puede causar quemaduras químicas. Manipule con cuidado utilizando las protecciones y la técnica apropiadas. - Transfiera la solución homogénea a un tubo de 2 ml y añada 200 ml de cloroformo. Incubar 5 min y centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.
- Proceda a la extracción de ARN y ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se puede extraer de la fase acuosa, mientras que el ADN se puede extraer de la fase interfasica y orgánica. Una vez purificados y cuantificados, el ARN y el ADN aislados de diferentes pozos de la misma cultura se pueden agrupar para aumentar el rendimiento.
NOTA: (1) Si bien recomendamos encarecidamente el uso de este método de extracción de ácido nucleico para el ARN, existen muchos buenos métodos para aislar el ADN de las células cultivadas. (2) Para determinar la presencia de células tumorales dentro del cultivo organoide, recomendamos secuenciar el ADN utilizando su método de secuenciación preferido de próxima generación para identificar mutaciones dentro de los genes distintivos de PDAC (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmacotipado de organoides PDAC
- Aísle las células individuales de los organoides como se describió anteriormente en los pasos 3.1–3.8. Para maximizar el número de celdas, cosecha al menos 10 pozos de confluente de un plato de 12 pocillos
- Resuspender células individuales en medios completos organoides humanos de 1 ml. La presencia de grupos de células pequeñas (2-10 celdas) es aceptable, sin embargo, los grumos de células más grandes afectarán negativamente al análisis descendente.
- Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado y registre la viabilidad de las celdas. Calcule el número total de células y células viables presentes en la suspensión de 1 ml.
- Para pruebas terapéuticas, placa 1.000 células viables por pozo de una placa de pozo 384. Para una placa de pozo 384 estimamos que usaremos 400.000 células viables (calculadas para 400 pozos).
- Preparar las células para el enchapado mezclando en hielo 800 l de BME con 7,2 ml de medios completos organoides que contienen las células. Conservar la mezcla en hielo y en la placa de 20 ml por pozo de una placa de 384 pocillos. Utilice una pipeta de 12 canales y un depósito mantenido en hielo para placar eficientemente las células. Para evitar la evaporación excesiva de la placa, los pozos exteriores se pueden utilizar como un depósito (60 ol PBS o agua por pozo), pero esto conducirá a una pérdida de 76 pozos experimentales.
- Gire la placa hacia abajo a 100 x g durante 1 min en un cubo de columpio. Esto permite que el pequeño volumen de 20 l y los organoides se asienten en la parte inferior de la placa.
- Coloque la placa en la incubadora de cultivos tisulares de 37oC para permitir la formación de organoides. Después de las 24 h, compruebe la presencia de organoides utilizando un microscopio de campo brillante.
- Proceder a la dosificación de compuestos terapéuticos disueltos en DMSO en la placa utilizando una impresora de drogas o un instrumento equivalente. Pruebe cada dosis de medicamento en al menos pozos triplicados. Para realizar un análisis eficaz de la dosis-respuesta, determine el rango de dosis de cada medicamento empíricamente, comenzando con una dosis baja, ineficaz, y terminando con una dosis alta donde se observa el máximo efecto. Ejemplos de rangos de dosis de compuestos quimioterápicos se han publicado recientemente9.
- Exponer las células a los compuestos terapéuticos durante 3-5 días.
- Opcionalmente, al final del ensayo, imagen de la placa para evaluar el efecto terapéutico sobre el tamaño, el número y la morfología organoides.
- Evalúe la viabilidad utilizando 20 ml por pozo de reactivo de viabilidad celular de luminiscencia (ver Tabla de materiales)de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se necesitará un luminómetro para la adquisición de datos y un software de gráficos para el análisis de datos.
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Representative Results
Para ilustrar los desafíos asociados con el aislamiento de los organoides de PDAC, mostramos el establecimiento de un cultivo organoide derivado del paciente a partir de una pequeña muestra de tumor hipocelular. Después del revestimiento inicial, sólo unos pocos organoides eran visibles por pozo, como se muestra en la Figura 1. A los organoides se les permitió crecer más grandes en el lapso de 2 semanas y se pasajeron de acuerdo con nuestro protocolo para establecer una cultura más robusta, como se muestra en el pasaje temprano y tardío 1 imágenes representativas(Figura 1). Es importante tener en cuenta que los organoides quísticos más grandes observados en el aislado primario tardío se descomponeron fácilmente en fragmentos más pequeños durante la mezcla de organoides con BME helado, como se describe en el paso 2.13.
Para demostrar el resultado del protocolo de farmacotipado, preparamos células individuales a partir de un organoide PDAC representativo establecido y de rápido crecimiento, tal como se describe en este protocolo. 1.000 células viables fueron chapadas por pozo y se les permitió recuperarse más de 24 h antes de que se dosificaban agentes quimioterapéuticos citotóxicos, Gemcitabina y Paclitaxel. Realizamos un ensayo de respuesta a la dosis de 9 puntos en triplicado comenzando con una dosis baja de 100 pM y terminando con una dosis alta de 2 M. Después de 5 días de tratamiento, se tomaron imágenes representativas para vehículos (DMSO), 2 M de Gemcitabina y 2 pozos tratados con Paclitaxel(Figura 2). Inmediatamente después de tomar las fotos, la viabilidad celular se evaluó utilizando el reactivo de viabilidad celular de luminiscencia y se traza batucitó utilizando un software de gráficos(Figura 2).
Figura 1: Se muestran imágenes representativas para un aislamiento organoide PDAC, así como después del primer pasaje. Tanto los puntos de tiempo tempranos (1-3 días) como tardíos (7-10 días) ilustran el crecimiento organoide con el tiempo. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la respuesta a la dosis. (Izquierda) Análisis representativo de la respuesta a la dosis obtenido utilizando un cultivo organoide PDAC establecido, con desviación estándar de los triplicados mostrada como barras de error. (Derecha) Imágenes que ilustran el efecto al final del tratamiento del vehículo (DMSO), así como 2 M de Gemcitabina y 2 M de Paclitaxel. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos protocolos actuales para aislar, expandir y caracterizar organoides PDAC derivados del paciente. Nuestra tasa de éxito actual de establecer el cultivo organoide es de más del 70%; por lo tanto, estos métodos aún no se han perfeccionado y se espera que mejoren y evolucionen con el tiempo. Se debe tener en cuenta el tamaño de la muestra, ya que PDAC tiene una celularidad neoplásica baja. En consecuencia, los especímenes pequeños contendrán pocas células tumorales, y sólo generarán un puñado de organoides. Además, muchos pacientes reciben quimioterapia y/o tratamiento neoadyuvante basado en quimioirradiación antes de la intervención quirúrgica15. Si el tratamiento es eficaz para un paciente en particular, el tejido tumoral puede estar desprovisto de células viables. Se prefiere la adquisición de muestras de pacientes quimio-nave para la optimización inicial de estos métodos, pero esto no siempre es posible. Curiosamente hemos encontrado que el tiempo de isquemia después de la extirpación quirúrgica del tejido tumoral no es un criterio importante para el aislamiento organoide exitoso, siempre y cuando la muestra se procese dentro de 24 h.
El adenocarcinoma ductal pancreático es una enfermedad caracterizada por una fuerte reacción desmasía y la deposición de una matriz estromática densa. Mientras que los organoides son una excelente herramienta para el rápido aislamiento y expansión del compartimiento epitelial, el modelo no recapitula el complejo estroma de PDAC. Otras metodologías como los xenoinjertos16 derivados del paciente o el cultivo de interfaz de líquido de aire17 permiten un compartimiento estroveral, sin embargo pueden ser difíciles de expandir rápidamente. Al elegir un sistema modelo, el investigador debe considerar cuidadosamente las fortalezas y debilidades de cada6.
La biología heterogénea de esta enfermedad afecta al establecimiento de organoides, ya que algunos organoides derivados del paciente crecen extremadamente bien en nuestras condiciones, mientras que otros son mucho más lentos en comparación. Los protocolos anteriores describen una condición rica en ligando wnt para aislar y expandir todos los organoides derivados del paciente, sin embargo, otros han demostrado que los tumores de algunos pacientes son capaces de crecer en ausencia de medios acondicionados Wnt11,12. Se requerirán más pruebas para determinar si el uso de una serie de condiciones de medios mejora el establecimiento exitoso de organoides, como se demostró recientemente para los organoides del cáncer de ovario18. Sin embargo, este enfoque multiplex está limitado por el bajo número de células tumorales que se pueden aislar de muestras de pacientes pequeños. Además, los organoides ductales normales no transformados pueden surgir de un aislamiento organoide, especialmente si el tejido tumoral es adyacente al tejido normal9. Para reducir el riesgo de contaminación organoidenormal normal, las muestras de tejido más grandes se pueden subdividir en fragmentos independientes más pequeños utilizando diferencias morfológicas como regiones vascularizadas (la sangre es visible) frente a las hipovasculares, y los nódulos duros frente al tejido blando.
Los métodos y protocolos descritos aquí son los enfoques estándar actuales utilizados en nuestro laboratorio para el aislamiento organoide y deben ser probados y adaptados para cada entorno de laboratorio. Por ejemplo, la disociación enzimática (pasos 2.6 a 2.9) del tejido tumoral es particularmente importante para optimizar. Las pequeñas diferencias de equipo (nutator vs mezclador de rotadores) pueden conducir a una sincronización significativamente diferente para este paso. Además, la disociación tisular se puede ajustar aumentando o reduciendo la concentración de la mezcla de colagenasa/hialuronidasa. Se debe tener cuidado de no tratar todas las muestras de la misma manera. Por ejemplo, en algunos casos, los organoides se pueden aislar del líquido ascitis de pacientes avanzados con PDAC sin disociación mecánica o enzimática.
La secuenciación del ADN es el estándar de oro actual para determinar la presencia o ausencia de organoides tumorales, ya que el PDAC está impulsado por mutaciones frecuentes en KRAS, TP53, SMAD4 y CDKN2A. El análisis transcriptomico puede revelar diferentes subtipos tumorales, mientras que la farmacotipación puede descubrir vulnerabilidades terapéuticas específicas del paciente9. Estos protocolos permiten a los investigadores de PDAC desarrollar su propia biblioteca de organoides derivados del paciente y perfilar la biología de estos modelos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo del UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, miembros del laboratorio Lowy, y el Departamento de Cirugía de UC San Diego, División de Oncología Quirúrgica. AML cuenta con el generoso apoyo de NIH CA155620, un su2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) y donantes al Fondo para Curar el Cáncer De Páncreas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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