Summary
Patient-härledda Organoid kulturer av bukspottskörteln duktal adenocarcinom är en snabbt etablerad 3-dimensionell modell som representerar epitelial tumör cell fack med hög trohet, möjliggör translationell forskning i denna dödliga malignitet. Här ger vi detaljerade metoder för att etablera och propagera organoider samt för att utföra relevanta biologiska analyser med hjälp av dessa modeller.
Abstract
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC) är bland de mest dödliga maligniteter. Nyligen, nästa generations Organoid kultur metoder som möjliggör 3-dimensionell (3D) modellering av denna sjukdom har beskrivits. Patient-härledda Organoid (sub) modeller kan isoleras från både kirurgiska prover samt små biopsier och bilda snabbt i kulturen. Viktigare, Organoid modeller bevara patogena genetiska förändringar upptäcks i patientens tumör och är prediktiva för patientens behandlingssvar, vilket möjliggör translationella studier. Här tillhandahåller vi omfattande protokoll för att anpassa arbetsflödet för vävnadskulturer för att studera 3D, Matrix Embedded, Organoid-modeller. Vi specificerar metoder och överväganden för att isolera och sprida primära PDAC-organoider. Dessutom beskriver vi hur skräddarsydda Organoid media är förberedd och kvalitetskontrollerad i laboratoriet. Slutligen beskriver vi analyser för nedströms karakterisering av Organoid modeller såsom isolering av nukleinsyror (DNA och RNA), och drogtester. Viktigt att vi ger kritiska överväganden för att implementera Organoid metodik i ett forskningslaboratorium.
Introduction
Pankreas duktal adenocarcinom (PDAC) är en dödlig sjukdom som kännetecknas av sen diagnos hos de flesta patienter, en brist på effektiva terapier, och en resulterande låg 5-års total överlevnad som förblir mindre än 10%1. Endast 20% av patienterna diagnostiseras med en lokaliserad sjukdom som lämpar sig för botande kirurgiska ingrepp2,3. De kvarvarande patienterna behandlas vanligen med en kombination av kemoterapeutiska medel som är effektiva hos en minoritet av patienterna4,5. För att hantera dessa akuta kliniska behov arbetar forskarna aktivt med tidiga detektions strategier och utveckling av effektivare terapier. För att påskynda klinisk översättning av viktiga upptäckter, forskare anställer genetiskt modifierade musmodeller, patient härrör xenografts, enskiktslager celler linjer, och, senast, Organoid modeller6.
Tredimensionell epitelial Organoid kultur med hjälp av tillväxtfaktor och WNT-ligand rika förhållanden för att stimulera spridningen av otransformerade progenitorceller beskrevs först för mus tarmen7 och var snabbt anpassas till normala mänskliga bukspottskörteln vävnad8. Förutom normal duktal vävnad, Organoid metodik möjliggör isolering, expansion, och studier av mänskliga PDAC8. Viktigt, metoden stöder inrättandet av organoider från kirurgiska prover, samt böter och kärna nål biopsier, så att forskarna att studera alla stadier av sjukdomen9,10. Intressant, patient-härledda organoider recapitulate väl beskrivna tumör transcriptomic subtyper och kan möjliggöra utveckling av precisionsmedicin plattformar9,11.
Aktuella Organoid-protokoll för PDAC möjliggör en lyckad expansion av mer än 70% av patientproverna från kemonaiva patienter9. Här presenterar vi de standardmetoder som används av vårt laboratorium för att isolera, expandera och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Andra PDAC Organoid metoder har beskrivits12,13 men ingen jämförelse av denna metod har utförts grundligt. Eftersom denna teknik är relativt ny och framåt snabbt, förväntar vi oss att dessa protokoll kommer att fortsätta att utvecklas och förbättras; men principerna för vävnads hantering och Organoid kultur kommer att fortsätta att vara användbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All insamling av mänskliga vävnader för forskningsbruk granskades och godkändes av vår interna granskningsnämnd (IRB). Alla följande protokoll utförs under aseptiska förhållanden i ett laboratorium miljö för däggdjur vävnad kultur.
1. förberedelse av media
- Konditionerade medier förberedelse.
Obs: den mänskliga bukspottskörteln Organoid Media kräver riklig tillväxtfaktorer och näringsämnen samt konditionerade Media tillskott för att ge tillräcklig tillväxtstimulering för Organoid expansion. Båda konditionerade medier som beskrivs nedan bereds från kommersiellt tillgängliga cellinjer (se tabell över material). För kompletta protokoll och material hänvisas till tillverkarens webbplatser.- Producera R-spondin1 konditionerade medier enligt tillverkarens protokoll.
- Först, expandera 293T celler som uttrycker R-spondin1 med lämpliga antibiotika (Zeocin) urvalsmetoder i närvaro av rikligt serum (10%). När du producerar konditionerade medier, dra tillbaka och tvätta bort antibiotika urvalet och serum så att inga antibiotika och serum finns i den slutliga konditionerade media. Viktigt, de konditionerade medierna måste vara filtersteriliserad efter uppsamling (0,2 μm) för att förhindra korskontaminering.
- Förvara aliciterat medium vid 4 ° c för kortvarig användning (inom 6 månader) eller vid-20 ° c för långtidsförvaring (mer än 6 månader). Frys-Tina cykler bör undvikas.
- Producera L-WNT-3A media enligt tillverkarens protokoll.
- Först, expandera L-M (TK-) celler som uttrycker L-WNT-3A med hjälp av lämpliga antibiotika (G-418) urvalsmetoder i närvaro av rikligt serum (10%). När de producerar konditionerade medier, dra tillbaka och tvätta bort antibiotika urvalet så att ingen antibiotika finns i den slutliga konditionerade medier; emellertid, underhålla serum i hela odling och konditionering. Huvudsakligen måste det insamlade villkorade massmedia vara filtrerar steriliserat (0,2 μm) för att förhindra korskontaminering.
- Förvara det aliciterade mediet vid 4 ° c för kortvarig användning, eller-20 ° c för långtidsförvaring. Frys-Tina cykler bör undvikas.
- För kvalitetskontroll, utföra en TOPFLASH-analys för att testa WNT aktiviteten av R-spondin1 och L-WNT-3A konditionerade Media ensam och i kombination enligt en tidigare publicerad protokoll14.
- Producera R-spondin1 konditionerade medier enligt tillverkarens protokoll.
- Basal Media beredning: Använd basal media för beredning av kompletta Organoid media samt tvättsteg för Organoid arbete. Komplettera avancerade DMEM/F-12 med glutamin vid en slutlig koncentration av 1x, HEPES (10 mM), och penicillin/streptomycin (100 U/mL). Förvara basala medier vid 4 ° c.
- Organoid komplett Media beredning: komplettera basal media med R-spondin1 konditionerade media vid en slutkoncentration av 10% v/v, L-WNT-3A konditionerade medier vid en slutkoncentration av 50% v/v, Human EGF (50 ng/mL), humant FGF (100 ng/mL), humant gastrin I (10 nM), mus noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27 tillägg (1x), nikotinamid (10 mM), N-acetylcystein (1,25 mM), och Primocin (100 μg/mL).
- För primära Organoid isoleringar, tinade Organoid kulturer, och kulturer som börjar med enstaka celler, inkluderar Rho kinashämmare Y-27632 vid en slutlig koncentration av 10,5 μM.
- Förbered den humana Organoid komplett media på is och förvara vid 4 ° c för användning inom en månad. Av denna anledning rekommenderar vi färsk veckovis beredning av media.
2. isolering av PDAC-Organoider
Anmärkning: Tina basalmembranet Extract (BME) lösning (tillväxtfaktor minskas; se tabell över material) på is i en 4 ° c miljö (kylskåp eller kylrum) för minst 12 h före användning. Inkubera vävnads odlings plattorna för Organoid kultur i en inkubator på 37 ° c i minst 12 timmar före användning.
- Samla in och transportera en kirurgiskt avlägsnas tumör prov för forskning i en buffrad lagringslösning för att bibehålla lönsamheten i vävnaden. Använda basala medier eller en kommersiellt tillgänglig vävnads lagringslösning.
- Fortsätt att isolera organoider så snart som möjligt efter att preparatet har tagits emot. Vävnad kan lagras i lagringslösning upp till 24 h efter operationen och ändå ge organoider.
- En gång i laboratoriet, överföra tumör till en 10 cm vävnad kultur skålen och ta bort lagringslösning.
- Medan hantering av vävnaden med metallisk tång, färs tumören med en #10 skalpell i små fragment av 1 mm3 eller mindre. Större fragment kommer att ta längre tid att smälta; Därför syftar till att generera homogena vävnad fragment storlekar. Om vävnaden redan är disaggregerad eller mindre än 1 mm3 fragment hoppar du över det här steget.
- Överför vävnads fragmenten till ett 15 mL koniskt rör som innehåller 10 mL basmaterial. Blanda genom att invertera röret flera gånger. Centrifugera röret vid 200 x g i 5 min. Efter spinn, ta bort basal Media noga för att undvika att förlora vävnads fragment.
- Till röret som innehåller vävnadfragment tillsätt 9 mL basala medier och 1 mL 10X mild kollagenas/hyaluronidase lösning. För att undvika klumpar av celler under matsmältningen, komplettera denna lösning med 20 μL av 10 mg/mL DNAse I lösning. Blanda genom att invertera röret flera gånger.
- Inkubera den enzymatiska matsmältningen vid 37 ° c på en nutator eller rotator. För adekvat blandning under matsmältningen måste vävnads fragmenten ständigt röra sig genom lösningen.
Obs: timing för denna enzymatiska dissociation av tumören måste bestämmas empiriskt för varje prov. En lyckad nedbrytning av tumören kännetecknas av minskningen i storlek av vävnadfragment tills de inte är klart märkbara för blotta ögat. Samtidigt kommer opaciteten hos lösningen att öka när mikroskopiska vävnads fragment frigörs. - Efter 30 min, ta bort det koniska röret från inkubatorn 37 ° c och observera. Om vävnads fragmenten fortfarande syns tydligt, Fortsätt dissociationen vid 37 ° c med konstant blandning. Upprepa observationen var 30: de minut tills de flesta eller alla vävnads fragment har separerats. Beroende på stränghet blandning samt storlek och mängd av tumörfragment, detta steg kan ta så lite som 30 min för små prover eller så länge 12 h för större tumör prover.
- När den enzymatiska dissociationen är klar, Centrifugera röret vid 200 x g i 5 min. Efter spinn, en cellpellet bör vara synlig och supernatanten bör vara tydlig, vilket indikerar att alla celler har spunnits ur lösning. Om så inte är fallet, upprepa snurrande.
- Ta försiktigt bort supernatanten för att undvika att förlora cellpelleten. Tvätta omedelbart cellerna med 10 mL basala medier genom att försiktigt blanda rören med inversion. Centrifugera röret vid 200 x g i 5 min. Ta försiktigt bort basala medier för att undvika att förlora celler och upprepa denna tvättsteg en gång för totalt två tvättar.
- Efter den andra tvätten, ta bort alla basala medier noggrant och placera röret på is i 5 min.
- Vid denna tid, placera en alikvot av Organoid kompletta medier i en 37 ° c vattenbad att förvärma.
- Blanda cellpelleten med iskallt BME samtidigt som röret bibehålls på isen. Sådd densitet bör vara hög för Organoid isolering. För en liten pellet (~ 50 μL volym) Använd 200 μL BME, medan en stor pellet (~ 200 μL volym) använder 800 μL BME. Blanda cellerna och BME på isen med hjälp av en P200 pipett tills lösningen verkar homogen samtidigt undvika att skapa bubblor i lösningen.
- Spot en 100 μL Dome i mitten av en brunn av en förvärmda 12 väl plattan med en P200 pipett. Upprepa detta tills alla BME-lösningar har dispenserats. Överför försiktigt plattan till inkubatorn 37 ° c så att BME-gelen stelnar.
- Efter 10 min, Hämta plattan och tillsätt 1 mL förvärmda Organoid komplett Media per brunn. Fördela media på sidan av brunnen för att undvika störningar i BME Dome.
- Observera cellfragment med hjälp av en inverterad vävnad kultur Mikroskop med hjälp av en 4x lins i brightfield.
Anmärkning: enstaka celler och mikroskopiska vävnads fragment bör vara tydligt synliga. En lyckad isolering kännetecknas av utseendet på mer än 10 organoider efter 24 – 48 h; kulturen bör vara konfluenta inom en vecka. Som tumör exemplar är heterogena, vissa Organoid isoleringar är mer utmanande eftersom endast ett fåtal organoider växa per brunn, som visas i figur 1. Låt i så fall kulturen fortsätta i upp till två veckor för att maximera antalet tillgängliga celler för passaging. För att redogöra för mediekonsumtion och avdunstning under kulturen, Fyll på kulturerna med 200 μL förvärmda Organoid kompletta medier var 5: de dag.
3. passaging av PDAC Organoider
- Hämta plattan från vävnads kulturen inkubator. Med en steril cell lyftare, försiktigt lyfta BME kupolen så att den flyter i hela mediet. Undvik skrapning botten av brunnen så att inte ta bort några enskiktslager celler knutna till plasten, eftersom dessa är typiskt fibroblaster.
- Med en P1000-pipett, överför försiktigt BME-kupolen och mediet till ett 15 mL koniskt rör. Upprepa detta steg för varje Organoid-innehållande brunn.
- Tvätta försiktigt varje brunn som skördats med 1 mL kallt basal media, och överför till 15 mL-röret som innehåller organoider.
- Blanda noggrant lösningen och organoider med en P1000 pipett och snurra ner på 200 x g i 5 min. Efter spinning, ett BME skikt som innehåller organoider i fjädring och en Organoid pellet kommer att visas på botten av röret. Ta försiktigt bort supernatanten, undvika förlust av BME/Organoid skiktet. Placera röret på is.
- Tillsätt 10 mL iskall cell återvinnings lösning (CRS) till röret och blanda grundligt med inversion. Detta kommer att depolymerisera proteinmatriser av den geléartad BME vid 4 ° c. Inkubera på isen i 30 min medan blanda var 3 min av inversion. Om tillgängligt, placera röret på en roterande mixer i ett kallt rum eller 4 ° c kylskåp i 30 min.
- Efter 30 min inkubering, snurra ner på 200 x g i 5 min. Den Organoid pelleten bör vara uppenbar medan BME skiktet bör vara borta. Om BME-skiktet har minskat i storlek men fortfarande är synligt, inkubera i ytterligare 30 min vid 4 ° c med mixning och upprepad dragning.
- När BME har depolymeriserats, ta bort det datoriserade bokningssystemet lämnar bakom Organoid pelleten. Tvätta organoider med 10 mL basala medier genom att blanda med inversion. Snurra ner på 200 x g i 5 min och ta bort supernatanten. Placera röret med den Organoid pelleten på is i minst 5 min.
- Alternativt, om en enda cell beredning önskas, inkubera organoiderna med 3 mL trypsin kompletterad med 30 μL 10 mg/mL DNAse I lösning för att undvika klumpar av celler under matsmältningen.
- Inkubera den enzymatiska reaktionen vid 37 ° c med mild inversion blandning varje 2 min i upp till 10 min. övervaka och bekräfta lyckad Enkelcell dissociation under brightfield Mikroskop.
- För att stoppa den enzymatiska reaktionen, tillsätt 10 mL iskallt basal media och snurra ner på 200 x g i 5 min.
- Tvätta celler med 10 mL basala medier genom att blanda med mild inversion. Snurra ner på 200 x g i 5 min och ta bort supernatanten och upprepa tvätten en gång till. Placera röret med cellpelleten på is i minst 5 min.
Obs: Vi rekommenderar att utföra detta steg varje 3-5 passager under regelbundet underhåll av organoider att generera homogen kultur med ett stort antal organoider.
- Tillsätt iskallt BME till cellpelleten och blanda försiktigt på isen tills lösningen är homogen med en P200-pipett. Samtidigt som man undviker att generera bubblor i blandningen, Pipettera upp och ner minst 5 – 10X, Placera spetsen på pipetten nära botten av röret för att hjälpa mekaniskt bryta upp organoider. Som en guide, Använd 4 – 6x volymen av BME/cellpelleten så att delningsförhållandet inte är mer än 1:2 från en passage till den andra.
- Spot en 100 μL Dome i mitten av en brunn av en förvärmda 12 väl plattan med hjälp av en P200 pipett; Upprepa tills all BME-lösning har dispenserats. Överför försiktigt plattan till inkubatorn 37 ° c så att BME-gelen stelnar. Efter 10 min, Hämta plattan och tillsätt 1 mL förvärmda Organoid komplett Media per brunn. Fördela media på sidan av brunnen för att undvika störningar i BME Dome.
- Organoider bör reformera och börja växa inom 24 h. Organoid kulturer är typiskt blint någonsin 7-10 dagar beroende på kultur täthet och cellproliferation. Om det behövs, fylla på kulturer med 200 μL av förvärmda Organoid kompletta medier var 5 dagar för att kompensera för tillväxtfaktor utarmning och avdunstning.
4. frysning och Upptinning av PDAC-Organoider
- För att frysa ner organoiderna, Fortsätt att skörda organoider och depolymerisera BME som beskrivs i steg 3.1 – 3.7.
- Till cellpelleten, tillsätt 1 mL frys medium, blanda försiktigt och överför blandningen till en förmärkt kryovial.
- Placera cryovial i en frys behållare för att bibehålla en säker konstant temperatur minskning och placera i en-80 ° c frys. Efter 24 till 48 h, överför de frysta injektionsflaskorna till flytande kväve lagring. Organoider kan vara kryopreserverade i månader till år med denna metod.
- För att Tina organoider, Hämta frysta cryovial från flytande kväve lagring. Transportera den frusna flaskan på torris till vävnads odlingsrummet.
- Placera den frusna kryoviden i vattenbadet 37 ° c för att snabbt Tina upp organoiderna och överföra innehållet i injektionsflaskan till ett 15 mL koniskt rör innehållande 9 mL basmedia som värms upp till rumstemperatur.
- Snurra ner på 200 x g i 5 min och ta bort supernatanten. Placera röret med den Organoid pelleten på is i minst 5 min.
- Fortsätt att Omsuspendera i BME och platta organoiderna enligt beskrivningen i steg 3.9 – 3.11.
Obs: Organoid kulturer återhämta sig långsamt efter en frysning/Tina cykel, därför kulturer kan odlas för upp till två veckor före passaging.
5. karakterisering av PDAC Organoider
Anmärkning: karakterisering av organoider bör utföras på en etablerad kultur efter flera passager för att minska risken för kontaminering från icke-epitelial celltyper såsom fibroblaster och immunceller.
- Nukleinsyrgasextraktion från PDAC-organoider
- Plåt organoider på en 12 väl tallrik tillägnad nukleinsyra utvinning. Inte mer än 100 μL BME per brunn. För adekvat DNA/RNA-avkastning, platta minst 2 – 4 brunnar per kultur. Odla organoider i upp till 5 dagar tills kulturer är nära att konflytande men saknar den överdrivna cell skräp som ackumuleras i längre sikt kulturer.
- Hämta plattan från 37 ° c inkubator och helt ta bort alla spår av Organoid kompletta medier, vilket innebär att endast BME Dome innehåller organoider på plattan.
- Tillsätt 900 μL syra-fenolreagens (se tabell över material) till varje brunn och blanda noggrant med en P1000 pipett tills lösningen blir homogen. BME kommer att vara helt upplöst i syran fenolreagens och organoider kommer lyse efter en kort 5 min inkubation.
Varning: Acid fenol är en farlig kemikalie som kan orsaka kemiska brännskador. Hantera med omsorg med hjälp av lämpliga skydd och teknik. - Överför den homogena lösningen till ett 2 mL-rör och tillsätt 200 μL kloroform. Inkubera 5 min och centrifugera vid 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Fortsätt till RNA och DNA-extraktion enligt tillverkarens protokoll. RNA kan extraheras från vattenfasen medan DNA kan extraheras från Interphase och organisk fas. När renat och kvantifierade, RNA och DNA isolerade från olika brunnar i samma kultur kan slås samman för att öka avkastningen.
Anmärkning: (1) medan vi rekommenderar starkt att använda denna nukleinsyra extraktionsmetod för RNA, det finns många bra metoder för att isolera DNA från odlade celler. (2) för att fastställa förekomsten av tumörceller inom Organoid kulturen, rekommenderar vi sekvensering av DNA med din föredragna nästa generations sekvenseringsmetod för att identifiera mutationer inom PDAC Hallmark gener (Kras, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmakotypning av PDAC-organoider
- Isolera enstaka celler från organoider enligt beskrivningen ovan i steg 3.1 – 3.8. För att maximera cell nummer, skörda minst 10 konflytande brunnar av en 12 brunn tallrik
- Omsuspendera enstaka celler i 1 mL Human Organoid komplett media. Närvaron av små cell klumpar (~ 2-10 celler) är acceptabelt, men större cell klumpar kommer att negativt påverka nedströms analys.
- Räkna celler med hjälp av en automatiserad cell räknare och rekord cell lönsamhet. Beräkna det totala antalet celler och livskraftiga celler som finns i 1 mL suspensionen.
- För terapeutiska tester, platta 1 000 livskraftiga celler per brunn av en 384 väl tallrik. För en 384 väl tallrik vi uppskattar att vi kommer att använda 400 000 livskraftiga celler (beräknat för 400 brunnar).
- Förbered celler för plätering genom att blanda på isen 800 μL av BME med 7,2 mL Organoid komplett media som innehåller cellerna. Håll blandningen på is och plattan 20 μL per brunn av en 384 väl plattan. Använd en 12-kanals pipett och reservoar hålls på is för att effektivt platta cellerna. För att undvika överdriven avdunstning från plattan, kan de yttre brunnarna användas som en reservoar (60 μL PBS eller vatten per brunn), men detta kommer att leda till en förlust av 76 experimentella brunnar.
- Snurra plattan ner på 100 x g i 1 min i en swing hink. Detta gör att de små 20 μL volym och organoider att bosätta sig på botten av plattan.
- Placera plattan i vävnads kulturinkubatorn 37 ° c så att organoider kan bildas. Efter 24 h, kontrollera förekomst av organoider med hjälp av ett brightfield Mikroskop.
- Fortsätt till dosering terapeutiska föreningar upplöst i DMSO på plattan med hjälp av en drog skrivare eller motsvarande instrument. Testa varje läkemedelsdos i minst tre exemplar brunnar. För att utföra en effektiv dos-respons analys, bestämma dosintervallet för varje läkemedel empiriskt, börjar med en låg, ineffektiv, dos och slutar med en hög dos där maximal effekt observeras. Exempel på dosintervall för kemoterapeutiska föreningar har nyligen publicerats9.
- Exponera cellerna för de terapeutiska föreningarna för 3 – 5 dagar.
- Alternativt, i slutet av analysen, bildplattan för att utvärdera den terapeutiska effekten på Organoid storlek, antal, och morfologi.
- Bedöma lönsamheten med 20 μL per brunn av luminisreagens för cellgenomförbarhet (se tabell över material) enligt tillverkarens protokoll. En luminometern kommer att behövas för datainsamling och en grafräknare programvara för dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera de utmaningar som är förknippade med att isolera organoider från PDAC, visar vi inrättandet av en patient som härrör Organoid kultur från en liten hypocellulära tumör prov. Efter inledande plätering, endast ett fåtal organoider var synliga per brunn, som visas i figur 1. Organoider tilläts växa större under loppet av 2 vecka och var blint enligt vårt protokoll för att etablera en mer robust kultur, som visas i början och slutet av passage 1 representativa bilder (figur 1). Det är viktigt att notera att de större cystisk organoider som observerats i det sena primära isolatet lätt bryts ned i mindre fragment under blandningen av organoider med iskalla BME, som beskrivs i steg 2,13.
För att påvisa resultatet av den farmakotyping protokoll, vi förberett enstaka celler från en etablerad och snabbt växande representativa PDAC Organoid som beskrivs i detta protokoll. 1 000 livskraftiga celler var pläterade per brunn och tilläts återhämta sig över 24 timmar innan cytotoxiska kemoterapeutiska medel, gemcitabin och paklitaxel, doserades. Vi utförde en 9-punkts dos Response assay i tre exemplar börjar med en låg dos av 100 pM och slutar med en hög dos av 2 μM. Efter 5 dagars behandling togs representativa bilder för vehikel (DMSO), 2 μM gemcitabin och 2 μM paklitaxel-behandlade brunnar (figur 2). Omedelbart efter att ha tagit bilderna, utvärderades cellernas lönsamhet med hjälp av luminiscens cell genomförbarhet reagens och plottas med hjälp av grafräknare programvara (figur 2).
Figur 1: representativa bilder visas för en PDAC Organoid isolering samt efter den första passagen. Både tidigt (1 – 3 dagar) och sena (7 – 10 dagar) tidpunkter visas för att illustrera Organoid tillväxt över tid. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av dos svar. Vänster Representativ dos svars analys erhålls med hjälp av en etablerad PDAC Organoid kultur, med standardavvikelse av tripletter visas som felstaplar. Rätten Bilder som illustrerar effekten vid slutet av analysen av fordonets (DMSO) behandling samt 2 μM gemcitabin och 2 μM paklitaxel. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi aktuella protokoll för att isolera, utvidga och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Vår nuvarande framgång för att etablera Organoid kultur är över 70%; Därför har dessa metoder ännu inte fulländat och förväntas förbättra och utvecklas med tiden. Viktigt övervägande bör ges till provstorlek, som PDAC har en låg neoplastisk cellularitet. Följaktligen, små prover kommer att innehålla några tumörceller, och kommer bara att generera en handfull organoider. Dessutom, många patienter får kemoterapi och/eller chemoradiation-baserad neoadjuvant behandling före kirurgiska ingrepp15. Om behandlingen är effektiv för en viss patient, tumörvävnad kan sakna livskraftiga celler. Förvärvet av Chemo-naiva patientprover föredras för initial optimering av dessa metoder, men detta är inte alltid möjligt. Intressant att vi har funnit att ischemi tid efter kirurgiskt avlägsnande av tumörvävnad är inte ett viktigt kriterium för framgångsrik Organoid isolering, så länge provet bearbetas inom 24 h.
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom är en sjukdom som kännetecknas av en stark desmoplastisk reaktion och avsättning av en tät stromacellstumörer matris. Även organoider är ett utmärkt verktyg för snabb isolering och utbyggnad av epitelial facket, inte recapitulate den komplexa stroma av PDAC. Andra metoder såsom patient härledda xenograft16 eller luft flytande gränssnitts kultur17 möjliggör en stromacellstumörer fack, men de kan vara utmanande att expandera snabbt. När du väljer ett modellsystem, bör forskaren noga överväga styrkor och svagheter i varje6.
Den heterogena biologi av denna sjukdom påverkar Organoid etablering som vissa patient-härledda organoider växa mycket bra i våra villkor medan andra är mycket långsammare i jämförelse. Protokollen ovan beskriver en WNT ligand rika villkor för att isolera och expandera alla patient-härledda organoider, men andra har visat att vissa patientens tumörer kan växa i avsaknad av WNT betingat Media11,12. Ytterligare tester kommer att krävas för att avgöra om användning av en rad medie förhållanden ökar framgångsrik etablering av organoider, som nyligen visades för äggstockscancer organoider18. Detta multiplex tillvägagångssätt begränsas dock av det låga antalet tumörceller som kan isoleras från små patientprover. Dessutom kan normala otransformerade duktal organoider uppstå från en Organoid isolering, särskilt om tumörvävnad är i anslutning till normal vävnad9. För att minska risken för normal Organoid förorening, större vävnadsprover kan delas upp i mindre oberoende fragment med hjälp av morfologiska skillnader såsom väl vaskulariserad (blod är synlig) kontra hypovaskulära regioner, och hårda knölar kontra mjuk vävnad.
De metoder och protokoll som beskrivs här är de nuvarande standardmetoder som används i vårt laboratorium för Organoid isolering och de bör testas och anpassas för varje laboratoriemiljö. Till exempel, den enzymatiska dissociation (steg 2,6 till 2,9) av tumör vävnad är särskilt viktigt att optimera. Små utrustnings skillnader (nutator vs rotator mixer) kan leda till betydligt olika timing för detta steg. Dessutom kan vävnads dissociationen finjusteras genom att öka eller minska koncentrationen av blandningen av kollagenas/hyaluronidas. Försiktighet måste iakttas för att inte behandla alla prover på samma sätt. Till exempel, i vissa fall kan organoider isoleras från ascitesvätska från avancerade PDAC-patienter utan mekanisk eller enzymatisk dissociation.
DNA-sekvensering är den nuvarande guldmynt-standarden för att bestämma närvaron eller frånvaron av tumör organoider som PDAC drivs av frekventa mutationer i KRAS, TP53, SMAD4 och CDKN2A. Transcriptomic analys kan avslöja olika tumör subtyper medan farmakotyping kan avslöja patientspecifika terapeutiska sårbarheter9. Dessa protokoll gör det möjligt för PDAC-forskare att utveckla sitt eget bibliotek av patient-härledda organoider och profilera biologin hos dessa modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för stöd av UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository och vävnadsteknik delad resurs, medlemmar av Lowy Laboratory, och UC San Diego Department of kirurgi, avdelningen för kirurgisk onkologi. AML stöds generöst av NIH CA155620, en SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), och givare till fonden för att bota pankreascancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
