Summary
Pankreas duktal adenokarsinomun hasta kaynaklı organoid kültürleri, epitel aliskan kollektifini yüksek sadakatle temsil eden, bu öldürücü maligniteye çeviri araþtirici araþtýrýmý saýkan, hýzlýklý bir 3 boyutlu modeldir. Burada organoidlerin kurulması ve yayılması ve bu modelleri kullanarak ilgili biyolojik tahlillerin gerçekleþtirilen ayrýntýlý yöntemlerin yer alýnmasýný saýlýyor.
Abstract
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) en ölümcül maligniteler arasında yer alan. Son zamanlarda bu hastalığın 3 boyutlu (3D) modellemesini sağlayan yeni nesil organoid kültür yöntemleri tanımlanmıştır. Hasta kaynaklı organoid (PDO) modelleri hem cerrahi örneklerden hem de küçük biyopsilerden izole edilebilir ve kültürde hızla oluşabilir. Daha da önemlisi, organoid modeller hastanın tümöründe saptanan patojenik genetik değişiklikleri korur ve hastanın tedavi yanıtının öngörücül olduğunu, böylece çeviri çalışmalarının sağlanmasını sağlar. Burada, doku kültürü iş akışını 3D, matris gömülü, organoid modelleri çalışmaya uyarlamak için kapsamlı protokoller salıyoruz. Primer PDAC organoidlerinin izole edilmesi ve yayılması için yöntemleri ve dikkatleri ayrıntılı olarak anlatıyoruz. Ayrıca, ısmarlama organoid ortamın nasıl hazırlandığı ve laboratuvarda kalitenin nasıl kontrol altına alınabildiğini anlatıyoruz. Son olarak, nükleik asitlerin (DNA ve RNA) izolasyonu ve ilaç testi gibi organoid modellerin aşağı karakterizasyonu için tahliller açıklıyoruz. Daha da önemlisi, bir araştırma laboratuvarında organoid metodolojinin uygulanması için kritik hususlar ı savuruyoruz.
Introduction
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) çoğu hastada geç tanı ile karakterize ölümcül bir hastalıktır, etkili tedavilerin eksikliği, ve daha az kalır sonuç olarak düşük 5 yıllık genel sağkalım oranı 10%1. Hastaların sadece %20'si küratif cerrahi girişime uygun lokalize bir hastalık tanısı konur2,3. Kalan hastalar genellikle hastaların bir azınlık etkili olan kemoterapötik ajanların bir kombinasyonu ile tedavi edilir4,5. Bu acil klinik ihtiyaçları karşılamak için, araştırmacılar aktif erken teşhis stratejileri ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesi üzerinde çalışıyoruz. Önemli keşiflerin klinik çevirisini hızlandırmak için, bilim adamları genetiği değiştirilmiş fare modelleri, hasta türetilen ksenogreftler, monolayer hücre hatları ve en son organoid modelleri6istihdam ediyoruz.
Üç boyutlu epitel organoid kültür büyüme faktörü ve Wnt-ligand zengin koşulları kullanarak dönüştürülmemiş progenitor hücrelerinin çoğalmasını teşvik etmek için ilk fare bağırsağı için tarif edildi7 ve hızlı bir şekilde normal insan pankreasdokusunaadapte edildi 8 . Normal duktal dokuek olarak, organoid metodoloji izolasyon, genişleme sağlar, ve insan PDAC çalışma8. Daha da önemlisi, yöntem cerrahi örneklerden organoidlerin kurulmasını destekler, yanı sıra ince ve çekirdek iğne biyopsileri, araştırmacılar hastalığın tüm aşamalarında çalışma sağlayan9,10. İlginçtir, hasta kaynaklı organoidler iyi tanımlanmış tümör transkriptomik alt tipleri recapitulate ve hassas tıp platformları geliştirilmesini sağlayabilir9,11.
PDAC için mevcut organoid protokoller kemo-naif hastalardan alınan hasta örneklerinin %70'inden fazlasının başarılı bir şekilde genişlemesini sağlar9. Burada hasta kaynaklı PDAC organoidlerini izole etmek, genişletmek ve karakterize etmek için laboratuvarımız tarafından kullanılan standart yöntemleri salıyoruz. Diğer PDAC organoid metodolojileri12,13 tanımlanmıştır ancak bu yöntemin karşılaştırması tam olarak gerçekleştirilmiştir. Bu teknoloji nispeten yeni ve hızla ilerlerken, bu protokollerin gelişmeye ve gelişmeye devam etmesini bekliyoruz; ancak doku işleme ve organoid kültür ilkeleri yararlı olmaya devam edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma için tüm insan doku toplama gözden geçirildi ve İç İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı. Aşağıdaki protokollerin tümü memeli doku kültürü laboratuvar ortamında aseptik koşullarda yapılmaktadır.
1. Medya Hazırlama
- Koşullu ortam hazırlığı.
NOT: İnsan pankreas organoid medya bol büyüme faktörleri ve besin yanı sıra organoid genişleme için yeterli büyüme stimülasyonu sağlamak için şartlı medya takviyesi gerektirir. Aşağıda açıklanan her iki koşullu ortam da ticari olarak kullanılabilen hücre hatlarından hazırlanmıştır (bkz. Malzemeler Tablosu). Tam protokoller ve malzemeler için lütfen üreticilerin web sitelerine bakın.- Üreticinin protokolüne göre R-spondin1 şartlı ortam üretin.
- İlk olarak, bol serum varlığında uygun antibiyotik (Zeocin) seçim yöntemleri kullanarak R-spondin1 ifade 293T hücreleri genişletmek (%10). Koşullu ortam üretirken, antibiyotik seçimini ve serumu geri çekin ve yıkayın, son koşullu ortamda antibiyotik ve serum bulunamaz. Daha da önemlisi, çapraz kontaminasyonu önlemek için şartlı ortam toplama dan sonra (0,2 μm) sterilize edilmelidir.
- Kısa süreli kullanım için (6 ay içinde) 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de (6 aydan fazla) aliquoted koşullu ortam depolayın. Donma-çözülme döngüleri kaçınılmalıdır.
- Üreticinin protokolüne göre L-Wnt-3A şartlı ortam üretin.
- İlk olarak, bol serum (%10) varlığında uygun antibiyotik (G-418) seçim yöntemleri kullanarak L-Wnt-3A ifade Eden L-M(TK-) hücrelerini genişletin. Koşullu ortam üretirken, antibiyotik seçimini geri çekin ve yıkayın, son koşullu ortamda antibiyotik bulunmaz; ancak, culturing ve klima boyunca serum korumak. Daha da önemlisi, toplanan şartlı ortamçapraz kontaminasyonu önlemek için filtre sterilize edilmelidir (0.2 μm).
- Kısa süreli kullanım için aliquoted koşullu ortamı 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın. Donma-çözülme döngüleri kaçınılmalıdır.
- Kalite kontrol için, r-spondin1 ve L-Wnt-3A klimalı medya tek başına ve birlikte daha önce yayınlanan protokol14göre Wnt aktivitesini test etmek için bir TOPFLASH testi gerçekleştirin.
- Üreticinin protokolüne göre R-spondin1 şartlı ortam üretin.
- Bazal ortam hazırlığı: Tam organoid ortam hazırlanması nın yanı sıra organoid çalışma için yıkama adımları için bazal ortam kullanın. Ek gelişmiş DMEM/F-12 glutamin ile 1x son konsantrasyonda, HEPES (10 mM) ve Penisilin / Streptomisin (100 U / mL). Bazal medyayı 4 °C'de saklayın.
- Organoid Komple ortam hazırlığı: Bazal medyayı %10 v/v nihai konsantrasyonda R-spondin1 şartlı ortamla tamamlayın, %50 v/v'lik son konsantrasyonda L-Wnt-3A şartlı ortam, İnsan EGF (50 ng/mL), İnsan FGF (100 ng/mL), Human Gastrin I (10 nM), Mouse Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27 eki (1x), Nikotinamid (10 mM), N-asetilsistein (1.25 mM) ve Primocin (100 mL) ve Primocin (100/μL).
- Birincil organoid izolasyonlar için, çözülmüş organoid kültürler, ve tek hücrelerle başlayan kültürler, Rho kigaz inhibitörü Y-27632 10.5 μM son konsantrasyonda içerir.
- İnsan organoidinin komple ortamını buz üzerinde hazırlayın ve bir ay içinde kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın. Bu nedenle, medyanın haftalık taze hazırlanmasını öneriyoruz.
2. PDAC Organoidlerinin İzolasyon
NOT: 4 °C'lik bir ortamda (buzdolabı veya soğuk oda) kullanılmadan önce en az 12 saat boyunca bodrum membran ekstresinin (BME) çözeltisini (büyüme faktörü azaltıldı; bkz. Organoid kültür için doku kültür plakalarını kullanmadan önce en az 12 saat süreyle 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Toplayın ve doku canlılığını korumak için bir tamponlu depolama çözeltisi araştırma için cerrahi olarak çıkarılan tümör örneği taşıma. Bazal ortam veya ticari olarak kullanılabilen doku depolama solüsyonu kullanın.
- Örneği aldıktan sonra organoidleri mümkün olan en kısa sürede izole etmeye devam edin. Doku, ameliyat sonrası 24 saate kadar depolama solüsyonunda saklanabilir ve hala organoidler verebilir.
- Laboratuvara başladıktan sonra tümörü 10 cm'lik doku kültürü kabına aktarın ve depolama solüsyonu çıkarın.
- Metalik forceps ile doku işleme sırasında, 1 mm3 veya daha küçük küçük parçalar halinde #10 neşter ile tümör kıyma. Daha büyük parçaların sindirimi daha uzun sürer; bu nedenle homojen doku parçaları boyutları oluşturmayı amaçlamaktadır. Doku zaten parçalanmışsa veya 1 mm3'ten küçük parçalar halindeyse, bu adımı atlayın.
- Doku parçalarını 10 mL bazal ortam içeren 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 5 dk için 200 x g tüp santrifüj. Döndükten sonra, doku parçalarını kaybetmemek için bazal ortamı dikkatlice çıkarın.
- Doku parçalarını içeren tüp için bazal ortam 9 mL ve 1 mL 10x Nazik Kollajenaz / Hyaluronidase çözeltisi ekleyin. Sindirim sırasında hücrelerin kümelenmesini önlemek için, bu çözeltiyi 20 μL 10 mg/mL DNAse I çözeltisi ile tamamlayın. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
- Enzimatik sindirimi 37 °C'de bir besleyici veya rotatör üzerinde kuluçkaya yatırın. Sindirim sırasında yeterli karıştırma için, doku parçaları sürekli çözüm ile hareket edilmelidir.
NOT: Tümörün bu enzimatik dissosiyatasyonunun zamanlaması her örnek için ampirik olarak belirlenmelidir. Tümörün başarılı bir sindirim açıkça çıplak gözle ayırt edilemeyene kadar doku parçalarının boyutunun azalması ile karakterizedir. Mikroskobik doku parçaları serbest bırakıldıkça çözeltinin opaklığı da artacaktır. - 30 dakika sonra konik tüpü 37 °C kuluçka makinesinden çıkarın ve gözlemleyin. Doku parçaları hala açıkça görülebiliyorsa, sürekli karıştırma ile 37 °C'de bölünmeye devam edin. Doku parçalarının çoğu veya tümü ayrıştırılıncaya kadar bu gözlemi her 30 dakikada bir tekrarlayın. Karıştırma nın sıkılığına ve tümör parçalarının büyüklüğüne ve miktarına bağlı olarak, bu adım küçük numuneler için 30 dakika kadar az veya daha büyük tümör örnekleri için 12 saat kadar sürebilir.
- Enzimatik dissosilasyon tamamlandıktan sonra tüpü 200 x g'de 5 dk santrifüj edin. Spin sonra, bir hücre pelet görünür olmalı ve supernatant açık olmalıdır, tüm hücrelerin çözelti dışında bükülmüş olduğunu gösteren. Bu durumda değilse, spin tekrarlayın.
- Hücre peletini kaybetmemek için supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpleri ters çevirme ile hafifçe karıştırarak hücreleri hemen 10 mL bazal ortamla yıkayın. Tüpü 5 dk için 200 x g'de santrifüj edin.
- İkinci yıkamadan sonra, tüm bazal ortamı dikkatlice çıkarın ve tüpü 5 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin.
- Şu anda, önceden ısınmak için 37 °C'lik bir su banyosuna organoid tam ortamın bir aliquot yerleştirin.
- Buz üzerinde tüp korurken buz gibi BME ile hücre pelet karıştırın. Organoid izolasyon için tohumlama yoğunluğu yüksek olmalıdır. Küçük bir pelet için (~50°L hacim) 200 μL BME, büyük bir pelet (~200°L hacim) için 800 μL BME kullanın. Çözelti homojen görünene kadar p200 pipet kullanarak hücreleri ve BME'yi buz üzerinde karıştırın ve çözeltide kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
- P200 pipetkullanarak önceden ısıtılmış 12 kuyu plakalı bir kuyunun ortasında 100 μL'lik bir kubbe yerleştirin. Tüm BME çözümü dağıtılana kadar bunu tekrarlayın. BME jelinin katılaması için plakayı dikkatlice 37 °C'lik kuluçka makinesine aktarın.
- 10 dakika sonra, plakayı alın ve kuyu başına önceden ısıtılmış organoid komple medya 1 mL ekleyin. BME kubbesinin bozulmasını önlemek için kuyunun yan tarafına medya dağıtın.
- Brightfield bir 4x lens kullanarak ters doku kültürü mikroskop kullanarak hücre parçaları gözlemleyin.
NOT: Tek hücre ve mikroskobik doku parçaları açıkça görülmelidir. Başarılı bir izolasyon 24-48 saat sonra 10'dan fazla organoidgörünümü ile karakterizedir; kültür bir hafta içinde enfluent olmalıdır. Tümör örnekleri heterojen olduğundan, şekil 1'degösterildiği gibi, sadece birkaç organoid in well başına büyüdükçe bazı organoid izolasyonlar daha zordur. Bu durumda, kültürün geçiş için kullanılabilir hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için iki haftaya kadar devam etmesine izin verin. Kültür sırasında medya tüketimini ve buharlaşmayı hesaba katmak için, her 5 günde bir 200 μL önceden ısıtılmış organoid komple ortam ile kültürleri doldurun.
3. PDAC Organoidlerinin Geçişi
- Doku kültürü kuluçka makinesinden plakayı alın. Steril bir hücre kaldırıcı ile, yavaşça tüm ortamda yüzen gibi BME kubbe kaldırın. Bu genellikle fibroblastlar olduğu gibi, plastik bağlı herhangi bir monolayer hücreleri kaldırmak için kuyunun alt kazıma kaçının.
- P1000 pipetile BME kubbesini ve ortamını dikkatlice 15 mL konik tüpe aktarın. Her organoid içeren kuyu için bu adımı tekrarlayın.
- 1 mL soğuk bazal ortam la hasat edilen her kuyuyu hafifçe yıkayın ve organoidleri içeren 15 mL tüpe aktarın.
- Çözeltiyi ve organoidleri p1000 pipetle iyice karıştırın ve 5 dk boyunca 200 x g'da aşağı doğru döndürün. Döndükten sonra tüpün alt kısmında organoidler ve organoid pelet içeren bir BME tabakası belirir. BME/organoid tabakasının kaybını önleyerek supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpü buza yerleştirin.
- Tüpe 10 mL buz gibi hücre kurtarma çözeltisi (CRS) ekleyin ve ters çevrilerek iyice karıştırın. Bu 4 °C'de jellenmiş BME protein matrisleri depolimerize olacaktır. Her 3 dakika yıkarken 30 dakika buz üzerinde kuluçka. Varsa, tüpü soğuk bir odaya veya 4 °C buzdolabına 30 dakika boyunca dönen bir mikserüzerine yerleştirin.
- 30 dk kuluçkadan sonra, 5 dk için 200 x g aşağı spin. BME tabakası gitmiş olmalıdır ise organoid pelet belirgin olmalıdır. BME tabakası nın boyutu azalmış ancak hala görünürse, 4 °C'de 30 dk daha karıştırıp tekrarlı spin ile kuluçkaya yatırın.
- BME depolimerize edildikten sonra, organoid pelet geride bırakarak CRS çıkarın. Organoidleri 10 mL bazal ortamla yıkayın. 5 dk için 200 x g aşağı spin ve supernatant çıkarın. En az 5 dakika boyunca buz üzerinde organoid pelet ile tüp yerleştirin.
- İsteğe bağlı olarak, tek bir hücre hazırlığı isteniyorsa, sindirim sırasında hücrelerin kümelenmesini önlemek için 30 μL 10 mg/mL DNaAse I çözeltisi ile takviye 3 mL tripsin ile organoidleri kuluçkaya yatırın.
- Enzimatik reaksiyonu 37 °C'de, her 2 dakikayı 10 dakikaya kadar karıştırarak hafif bir inversiyonla kuluçkaya yatırın.
- Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 10 mL buz gibi bazal ortam ekleyin ve 5 dk boyunca 200 x g'da aşağı doğru döndürün.
- Hücreleri 10 mL bazal ortamla hafif ters çevirme ile karıştırarak yıkayın. 5 dk için 200 x g aşağı spin ve supernatant çıkarın ve yıkama bir kez daha tekrarlayın. En az 5 dakika buz üzerinde hücre pelet ile tüp yerleştirin.
NOT: Çok sayıda organoidle homojen bir kültür oluşturmak için organoidlerin düzenli bakımı sırasında her 3-5 pasajda bir bu adımı atmanızı öneririz.
- Hücre peletine buz gibi BME ekleyin ve çözelti p200 pipetkullanılarak homojen olana kadar buz üzerinde hafifçe karıştırın. Karışımda kabarcıklar üretmeyi önlerken, pipet en az 5-10x yukarı ve aşağı, mekanik organoidler kırmaya yardımcı olmak için tüpün altına yakın pipet ucu yerleştirerek. Kılavuz olarak, BME/hücre peletinin hacminin 4-6kat kısmını kullanın, çünkü bölme oranı bir pasajdan diğerine 1:2'den fazla olamaz.
- P200 pipetkullanarak önceden ısıtılmış 12 kuyu plakalı bir kuyunun ortasında 100 μL'lik bir kubbe yerleştirin; Tüm BME çözeltisi dağıtılana kadar tekrarlayın. BME jelinin katılaması için plakayı dikkatlice 37 °C'lik kuluçka makinesine aktarın. 10 dakika sonra, plakayı alın ve kuyu başına önceden ısıtılmış organoid komple medya 1 mL ekleyin. BME kubbesinin bozulmasını önlemek için kuyunun yan tarafına medya dağıtın.
- Organoidler 24 saat içinde reform ve büyümeye başlamalıdır. Gerekirse, büyüme faktörü tükenmesi ve buharlaşma telafi etmek için her 5 günde bir önceden ısıtılmış organoid komple medya 200 μL ile kültürleri doldurun.
4. PDAC Organoidlerinin Donması ve Erimesi
- Organoidleri dondurmak için, organoidleri hasat etmeye ve 3.1-3.7 adımlarında açıklandığı gibi BME'yi depolimerize etmeye devam edin.
- Hücre peletine, 1 mL dondurucu ortam ekleyin, hafifçe karıştırın ve karışımı önceden etiketlenmiş bir cryovial'a aktarın.
- Cryovial'ı dondurucu bir kapta yerleştirin ve -80 °C'lik bir dondurucuya sabit bir sıcaklık düşüşü yaşa. 24 ila 48 saat sonra, dondurulmuş şişeleri sıvı nitrojen depolamasına aktarın. Organoidler bu yöntemle aylarca kriyopreserved edilebilir.
- Organoidleri eritmek için, donmuş cryovial'ı sıvı nitrojen deposundan alın. Donmuş şişeyi kuru buzdaki doku kültür odasına taşıyın.
- Dondurulmuş cryovial'ı 37 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve şişenin içeriğini oda sıcaklığına ısıtılmış 9 mL bazal ortam içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- 5 dk için 200 x g aşağı spin ve supernatant çıkarın. En az 5 dakika boyunca buz üzerinde organoid pelet ile tüp yerleştirin.
- BME'de yeniden askıya almaya devam edin ve 3.9-3.11 adımlarında açıklandığı gibi organoidleri plakalayın.
NOT: Organoid kültürler donma/çözülme döngüsünden sonra yavaş yavaş iyileşirler, bu nedenle kültürler geçişten önce iki haftaya kadar büyüyebilir.
5. PDAC Organoidlerinin Karakterizasyonu
NOT: Fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri gibi epitel hücre tiplerinden kaynaklanan kontaminasyon riskini azaltmak için çeşitli pasajlardan sonra organoidlerin karakterizasyonu yerleşik bir kültür üzerinde yapılmalıdır.
- PDAC organoidlerinden nükleik asit ekstraksiyonu
- Nükleik asit ekstraksiyonuna adanmış 12 kuyuluk plakalı levha organoidleri. Her kuyuda en fazla 100 μL BME plakası. Yeterli DNA/RNA verimi için, kültür başına en az 2-4 kuyu plate. Kültürler confluent yakın ama uzun vadeli kültürlerde birikir aşırı hücre enkaz yoksun kadar 5 güne kadar organoidler büyümek.
- Plakayı 37 °C inkübatörden alın ve plakaüzerinde sadece Organoidleri içeren BME kubbesi bırakarak tüm organoid komple ortam izlerini tamamen çıkarın.
- Her kuyuya 900 μL asit fenol reaktifi ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve çözelti homojen hale dönene kadar p1000 pipetkullanarak iyice karıştırın. BME asit fenol reaktifinde tamamen çözülecek ve organoidler 5 dk'lık kısa bir kuluçkadan sonra lyse olacaktır.
DİkKAT: Asit fenol kimyasal yanıklara neden olabilir tehlikeli bir kimyasaldır. Uygun korumave tekniği kullanarak özenle işleyebilir. - Homojen çözeltiyi 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve 200 μL kloroform ekleyin. 4 °C'de 15 dk için 12.000 x g'de 5 dk ve santrifüj de inkübat.
- Üreticiprotokolüne göre RNA ve DNA çıkarma işlemlerine devam edin. Dna interfaz ve organik faz dan ayıklanabilir ise RNA sulu faz dan ayıklanabilir. Bir kez saflaştırılmış ve nicel, RNA ve DNA aynı kültürün farklı kuyulardan izole verimi artırmak için havuzlu olabilir.
NOT: (1) Bu nükleik asit çıkarma yöntemini RNA için kullanmanızı şiddetle tavsiye etsek de, kültürlü hücrelerden DNA'yı izole etmek için birçok iyi yöntem vardır. (2) Organoid kültür içinde tümör hücrelerinin varlığını tespit etmek için, PDAC damgası genleri(KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A)içindeki mutasyonları belirlemek için tercih ettiğiniz yeni nesil sıralama yöntemini kullanarak DNA'nın dizilenmesini öneririz.
- PDAC organoidlerinin farmakotiplemesi
- 3.1-3.8 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi organoidlerden tek hücreleri ayırın. Hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için, 12 kuyu plakasının en az 10 kuyusu hasat
- 1 mL insan organoid komple ortamda tek hücreleri resuspend. Küçük hücre kümelerinin varlığı (~2-10 hücre) kabul edilebilir, ancak daha büyük hücre kümeleri downstream analizini olumsuz etkileyecektir.
- Hücreleri otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayve hücre canlılığını kaydedin. 1 mL süspansiyonda bulunan toplam hücre ve canlı hücre sayısını hesaplayın.
- Terapötik testler için, 384 kuyu plakası kuyusu başına 1.000 canlı hücre yitirin. 384 kuyu plakası için 400.000 canlı hücre (400 kuyu için hesaplanır) kullanacağımızı tahmin ediyoruz.
- Hücreleri içeren organoid komple ortam 7,2 mL ile bME 800 μL bme üzerinde karıştırarak kaplama için hücreleri hazırlayın. Karışımı buzda ve 384 kuyu plakasının kuyusu başına 20°L'de saklayın. Hücreleri verimli bir şekilde kaplamak için buzüzerinde tutulan 12 kanallı pipet ve rezervuar kullanın. Plakadan aşırı buharlaşmayı önlemek için, dış kuyular bir rezervuar olarak kullanılabilir (kuyu başına 60 μL PBS veya su), ancak bu 76 deneysel kuyu kaybına yol açacaktır.
- Bir salıncak kovasında 1 dk için 100 x g aşağı plaka spin. Bu küçük 20 μL hacim ve organoidler plakanın alt yerleşmek için izin verir.
- Organoidlerin oluşmasını sağlamak için plakayı 37 °C doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. 24 saat sonra, brightfield mikroskop kullanarak organoidlerin varlığını kontrol edin.
- DMSO'da çözünmüş terapötik bileşikleri bir ilaç yazıcısı veya eşdeğer alet kullanarak plaka üzerine dozlama devam edin. En azından triplicate kuyularda her ilaç dozu test edin. Etkili bir doz-yanıt analizi yapmak için, ampirik her ilaç için doz aralığı belirlemek, düşük ile başlayan, etkisiz, doz ve maksimum etki gözlenen yüksek bir doz ile biten. Kemoterapötik bileşikler için doz aralıkları örnekleri son zamanlarda yayınlanmıştır9.
- Hücreleri 3-5 gün boyunca terapötik bileşiklere maruz bırakın.
- İsteğe bağlı olarak, tetkik sonunda, görüntü plaka organoid boyutu üzerinde terapötik etkisini değerlendirmek için, sayı, ve morfoloji.
- Lumineskence hücre canlılık reaktifinin kuyusu başına 20 μL 'yi kullanarak canlılığı değerlendirin (bkz. Malzeme Tablosu)üreticinin protokolüne göre. Veri toplama için bir luminometre ve veri analizi için bir grafik yazılımı gerekecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDAC organoidlerin izole ile ilgili zorlukları göstermek için, küçük bir hiposellüler tümör örneği bir hasta türetilmiş organoid kültür kurulması nı göstermektedir. İlk kaplamadan sonra, Şekil 1'degösterildiği gibi, her kuyuda sadece birkaç organoid görülebilir. Organoidler 2 haftalık süre içinde daha büyük büyümeye izin verildi ve daha sağlam bir kültür kurmak için protokolümüze göre geçit edildi, erken ve geç geçiş gösterildiği gibi 1 temsili resimler(Şekil 1). Geç primer izolede gözlenen daha büyük kistik organoidlerin, 2.13 adımda açıklandığı gibi, organoidlerin buz gibi BME ile karıştırılması sırasında kolayca daha küçük parçalara ayrıldığı unutulmamalıdır.
Farmakotipleme protokolünün sonucunu göstermek için, bu protokolde açıklandığı gibi, yerleşik ve hızlı büyüyen bir temsilci PDAC organoidinden tek hücre hazırladık. 1.000 canlı hücre kuyu başına kaplandı ve sitotoksik kemoterapötik ajanlar, Gemsitabin ve Paklitaksel dosed önce 24 saat üzerinde kurtarmak için izin verildi. Düşük doz100 pM ile başlayan ve 2 μM yüksek dozile biten triplicate 9 noktalı doz yanıtı titreti yaptık. 5 günlük tedaviden sonra araç (DMSO), 2 μM Gemcitabine ve 2 μM Paclitaxel tedavi kuyuları için temsili fotoğraflar çekilmiştir(Şekil 2). Fotoğrafları çektikten hemen sonra, hücre canlılığı lüminesans hücre canlılık reaktifi kullanılarak değerlendirildi ve grafik yazılımı kullanılarak çizildi (Şekil 2).
Şekil 1: Temsili resimler, ilk geçişten sonra pdac organoid izolasyonu için gösterilmiştir. Hem erken (1-3 gün) hem de geç (7-10 gün) zaman içinde organoid büyümeyi göstermek için zaman içinde zaman puanları gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doz yanıt analizi. (Sol) Temsili doz yanıt analizi, standart triplit sapması ile hata çubukları olarak gösterilen, yerleşik bir PDAC organoid kültürü kullanılarak elde edilmiştir. (Sağ) Araç (DMSO) tedavisinin yanı sıra 2 μM Gemcitabine ve 2 μM Paclitaxel'in tetkik sonundaki etkisini gösteren resimler. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, hasta kaynaklı PDAC organoidlerinin izole, genişletme ve karakterizasyonu için mevcut protokolleri sıyoruz. Organoid kültürü oluşturmadaki mevcut başarı oranımız %70'in üzerindedir; bu nedenle, bu yöntemler henüz mükemmel olmamıştır ve geliştirmek ve zaman içinde gelişmeye bekleniyor. PDAC düşük neoplastik hücreselliğe sahip olduğu için örnek boyutuna önemli önem verilmelidir. Sonuç olarak, küçük örnekler birkaç tümör hücresi içerecek ve sadece bir avuç organoid üretecektir. Ayrıca, birçok hasta cerrahi müdahale öncesinde kemoterapi ve / veya kemoradyasyon tabanlı neoadjuvan tedavi alırsınız15. Tedavi belirli bir hasta için etkili ise, tümör dokusu canlı hücrelerden yoksun olabilir. Bu yöntemlerin ilk optimizasyonu için kemo-naif hasta örneklerinin alınması tercih edilir, ancak bu her zaman mümkün değildir. İlginçtir ki, tümör dokusunun cerrahi olarak çıkarılmasından sonraki iskemi süresi, numune 24 saat içinde işlendiği sürece başarılı organoid izolasyon için önemli bir kriter değildir.
Pankreas duktal adenokarsinom güçlü bir desmoplastik reaksiyon ve yoğun stromal matriks birikimi ile karakterize bir hastalıktır. Organoidler epitel kompartmanının hızlı izolasyonu ve genişlemesi için mükemmel bir araç olsa da, model PDAC'ın kompleks stromasını özetlemez. Hasta türetilmiş ksenogreftler16 veya hava sıvı arabirimi kültürü17 gibi diğer metodolojiler bir stromal bölmesi için izin, ancak hızlı bir şekilde genişletmek zor olabilir. Bir model sistemi seçerken, araştırmacı dikkatle her6güçlü ve zayıf yönlerini düşünmelisiniz.
Bazı hasta kaynaklı organoidler bizim koşullarımızda son derece iyi büyürken, diğer karşılaştırma çok daha yavaş olduğu için bu hastalığın heterojen biyolojisi organoid kurulmasını etkiler. Yukarıdaki protokoller izole etmek ve tüm hasta kaynaklı organoidler genişletmek için bir Wnt ligand zengin durumu tarif, henüz diğerleri bazı hastanın tümörleri Wnt klimalı medya yokluğunda büyümek mümkün olduğunu göstermiştir11,12. Daha fazla test medya koşulları bir dizi kullanarak organoidlerin başarılı kurulması artırır olup olmadığını belirlemek için gerekli olacak, son zamanlarda yumurtalık kanseri organoidler için gösterildiği gibi18. Bu multipleks yaklaşım ancak küçük hasta örneklerinden izole edilebilir tümör hücrelerinin düşük sayıda sınırlıdır. Ayrıca, normal dönüşümsüz duktal organoidler organoid izolasyon ortaya çıkabilir, tümör dokusu normal doku bitişik ise9. Normal organoid kontaminasyon riskini azaltmak için, daha büyük doku örnekleri hipovasküler bölgelere karşı vasküler (kan görünür) ve sert nodüller yumuşak doku gibi morfolojik farklılıklar kullanılarak daha küçük bağımsız parçalara ayrılabilir.
Burada açıklanan yöntem ve protokoller, laboratuarımızda organoid izolasyon için kullanılan güncel standart yaklaşımlardır ve her laboratuvar ortamı için test edilmeli ve uyarlanmalıdır. Örneğin, tümör dokusunun enzimatik dissociasyonu (adım 2.6-2.9) optimize etmek için özellikle önemlidir. Küçük ekipman farklılıkları (nutator vs rotator karıştırıcı) bu adım için önemli ölçüde farklı zamanlamayol açabilir. Ayrıca, doku dissociation artan veya Kollajenase / Hyaluronidase karışımıkonsantrasyonu azaltarak ince ayarlı olabilir. Tüm numunelerin aynı şekilde tedavi edilmemeye özen denilmelidir. Örneğin, bazı durumlarda organoidler mekanik veya enzimatik dissosilasyon olmadan ileri PDAC hastalarından asit sıvısı izole edilebilir.
PDAC KRAS, TP53, SMAD4 ve CDKN2A'da sık mutasyonlar nedeniyle DNA dizilimi tümör organoidlerinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için geçerli altın standarttır. Transkriptomik analiz farklı tümör alt tiplerini ortaya çıkarırken, farmakotipleme hastaya özgü terapötik zayıflıkları ortaya çıkarabilir9. Bu protokoller, PDAC araştırmacılarının hasta kaynaklı organoidlerden oluşan kendi kitaplıklarını geliştirmelerine ve bu modellerin biyolojisini profillemelerine olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz UC San Diego Moores Kanser Merkezi Biyorepozitory ve Doku Teknolojisi Paylaşılan Kaynak, Lowy laboratuvar üyeleri ve UC San Diego Cerrahi Bölümü, Cerrahi Onkoloji Bölümü desteği için minnettarız. AML cömertçe NIH CA155620, bir SU2C CRUK Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Dream Team Ödülü (SU2C-AACR-DT-20-16) tarafından desteklenir ve Fon Için Bağış Pankreas Kanseri Cure için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
