Summary
Elektrofizyoloji ve deneysel probların (yani nanosensörler, mikroelektrotlar) isteğe bağlı ilaç infüzyonu için tasarlanmış bir mikroenjekrode sistemi salıyoruz. Yaygın olarak bulunan mikroakışkan bileşenler, sondayı içeren bir kanülle birleştiğinde. Makak korteksindeki mussimol infüzyonu sırasında elde edilen sonuçlarla birlikte mikroenjekrode konstrüksiyonu için adım adım protokol dahildir.
Abstract
Bu mikroenjekrode sistemi ilaç infüzyonu için tasarlanmıştır, elektrofizyoloji, ve teslimat ve deneysel probların alınması, mikroelektrotlar ve nanosensörler gibi, uyanık tekrarlanan kullanım için optimize edilmiş, hayvanlar gibi davranan. Mikroenjekrode sistemi birden fazla amaç için yapılandırılabilir: (1) aksi takdirde dura mater nüfuz etmek için çok kırılgan olurdu deneysel bir prob yerleştirilmesi için kanül basit düzenleme, (2) bir ilacın mikroakışkan infüzyonu, ya bağımsız olarak veya deneysel bir prob (yani, mikroelektrot, nanosensor) içeren bir kanül ile birleştiğinde. Bu protokolde mikroenjekrodenin adım adım yapımını, mikroakışkan bileşenlere bağlantısını ve sistemin in vivo kullanımı için protokolü adım adım açıklıyoruz. Bu sistemin mikroakışkan bileşenleri, minimum penetrasyon hasarı ile nanolitre ölçekte hacimlerin teslimine olanak sağlar. İlaç infüzyonu, uyanık, hayvan gibi davranan mikroelektrotlar veya nanosensörler gibi deneysel problarla bağımsız veya eş zamanlı olarak yapılabilir. Bu sistemin uygulamaları kortikal elektriksel aktivite ve davranış üzerinde bir ilacın etkilerini ölçme, sonda veya nanosensör ölçümleri dayalı davranışsal performans bağlamında korteks belirli bir bölgenin işlevini anlamak için değişir. Bu sistemin bazı yeteneklerini göstermek için, bir çalışma bellek görevi sırasında rhesus makak ön göz alanı (FEF) ters inaktivasyonu için muscimol infüzyon bir örnek salıyoruz.
Introduction
Elektrofizyoloji ve ilaç enjeksiyon yöntemleri nöronbilimde nöronal aktivite ve davranışları incelemek için yaygın olarak kullanılır, in vivo, kemirgenlerde ve primatlarda. Son otuz yıl içinde, erken enjektör modellerinin iyileştirmeler daha hassas ve daha az invaziv tekniği izin, ve belirli beyin sitelerinde eşzamanlı kayıt ve ilaçenjeksiyonu 1,2,3. Özellikle primatlar için, teknik yüksek eğitimli hayvanlar gerektiren gelişmiş bilişsel fonksiyonların çalışması için kullanılacaksa, en az doku hasarı ile tam olarak küçük hacimler teslim yeteneği önemlidir. Son gelişmeler implante problar kullanarak stimülasyon ile birlikte kronik elektrofizyolojik ve kimyasal ölçümler içerir4, ve kombine kayıt ve mikroakışkan ilaç teslimat son zamanlarda kemirgenler pilot olmuştur5. Burada açıklanan enjektör sistemi elektrofizyolojik kayıt, stimülasyon ve hassas ilaç dağıtımı sağlar, ve zaten başarıyla birden fazla primat laboratuvarlarında uygulanmıştır6,7,8.
Nanosensors 9 gibi hassas, özel sensörlerin artan kullanılabilirliği9,10 nörolojik uygulamalar ile, kırılgan nanoölçekli cihazlar veya mikroelektrot ipuçları zarar vermeden dura mater yoluyla prob almak için güvenilir bir yöntem gerektirir.
Bu yöntemleri kolayca kullanılabilir, düşük maliyetli bileşenler kullanarak birleştirmenin teknik zorluklarının üstesinden gelen ve iki ana işlevi kolaylaştıran bir mikroenjekrode sistemi tasarladık: (i) Kırılgan bir deneysel sonda yerleştirme yeteneği, örneğin mikroelektrot veya nanosensör, dura mater ve sinir dokusu aracılığıyla, herhangi bir hasara karşı korunur. Bu işlevsellik, deneysel sondanın hedeflenen yerlere yerleştirilmesine olanak sağlar, kanül nöral dokuda bir rehber olarak kullanılarak teslim edilir. (ii) Elektrofizyoloji kayıtları ve elektriksel stimülasyon ile ilaç enjeksiyonunu birleştiren deneyler yapmak için mikroelektrot kullanma becerisi.
Sistemimiz durayı nüfuz etmek için bir kılavuz tüp kullanır, ilaç teslimatı için hem işlevleri bir kanül ile birlikte (mikro infüzyon için sistem kullanırken) ve mikroelektrot veya nanosensor için ek koruma sağlar (hem dura ve geçerken nöral doku). Bu sistem kolayca ucuz ve bulmak kolay yaygın olarak ticari olarak kullanılabilir bileşenleri ile inşa edilebilir. Küçük çaplı bir kanül (dış çap OD = 235 μm, iç çap KIMLIĞI = 108 μm) kullanarak penetrasyon hasarını en aza indiririz.
Burada mikroenjekrode konstrüksiyon ve mikroakışkan sistemin konfigürasyonu için adım adım talimatlar salıyoruz. Biz mikroenjekton kullanımı için gerekli adımları açıklamak, ya bağımsız ya da ilaç enjeksiyonu için mikroakışkan sistemi ile birleştiğinde. Benzer bir yaklaşım herhangi bir kırılgan deneysel prob ile uygulanabilir, nanosensor gibi9,10. Prob kanüle (tasarıma bağlı olarak) ön veya arkadan yüklenebilir ve dura ve nöral dokuya girerken hasardan korunur. Biz insan olmayan primatlar ile bir in vivo deney örnek veri sağlamak, hangi biz elektrik stimülasyon gerçekleştirmek için bir tungsten mikroelektrot kullanılan, ve daha sonra ön göz alanında mussimol enjekte (FEF) hayvan bir bellek güdümlü saccade (MGS) görev gerçekleştirirken.
Protocol
Deneysel prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi ve Nörobilim Yönergeleri ve Politikaları Derneği'ni takip etti. Deneysel ve davranışsal prosedürlere ilişkin protokoller Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Stimülasyon ve Kayıt için Mikroenjekrode İnşaatı (Şekil 1a)
- Kanülün ve sondanın uzunluğunu ölçün (bu örnekte bir nanosensör). Sonda, kanül ucundan çıkıntı yapabilmesi için (sonda tasarımına bağlı olarak) uzunluğuna göre kanülden daha uzun olmalı ve yaklaşık 2 cm olmalıdır.
- Bir büyüteç veya mikroskop (~10x büyütme) altında, sondayı kanüle yükleyin; mümkünse bir geri yükleme probun ucunu korumak için tercih edilir.
NOT: El ile gerçekleştirilen bu adım zordur. Gerçek bir deneysel sonda ile denemeden önce büyüteç altında bir mikroelektrot ile pratik önerilir. -
Kanül (prob içeren) üst ferrule, T-kavşak ve alt ferrule ile geçirin.
- Prob herhangi bir eki olmayan tek bir telse, kanulaya geri yükleyin ve tertibatı alt ferrule'den T-kavşağına takın. Kanül üst (düz uç tarafı) T-kavşak ortasında, alt içinde değil, üst ferrule konumlandırılmış olmalıdır. Deneysel prob veya biyosensör üst ferrule üst üzerinde çıkıntı gerekir.
NOT: Özel yapım ferrules da mikro matkap uçları kullanarak ferrule fişleri bir delik delme yapılabilir, T-kavşak için kanül sıkma için gerekli çapa dayalı delik boyutu.
- Prob herhangi bir eki olmayan tek bir telse, kanulaya geri yükleyin ve tertibatı alt ferrule'den T-kavşağına takın. Kanül üst (düz uç tarafı) T-kavşak ortasında, alt içinde değil, üst ferrule konumlandırılmış olmalıdır. Deneysel prob veya biyosensör üst ferrule üst üzerinde çıkıntı gerekir.
- T-kavşağının üst ve alt kısmındaki ferrules'ı sıkmak için ferrule anahtarını kullanın. Aşırı sıkmayın. Üst ferrule içinde elektrot desteği güçlendirmek için boru küçük bir parça eklenebilir.
- Sonda terminallerinin her birine (sinyal, zemin, vb.) lehim altın pimleri, sondanın özelliklerine göre.
- Sonda ve kanülün göreli konumunu ayarlayın. Probun büyütme altında kanülden çıkıntılı olduğu mesafeyi ölçün ve üst uçtan el ile ayarlayın (prob ferrules içinde serbestçe kaydırılabilir).
- Altiğneler ve üst ferrule arasında epoksi tutkal ekleyin ferrule için prob takmak için.
- Kanül içinde prob geri çekmek için üst ferrule çıkarın. Görsel olarak sondanın büyütülme altında kanüliçinde olduğunu doğrulayın.
- Enjektörü mikrosürücüye takın.
2. İlaç İnfüzyonu İçin Mikroenjektör Yapımı (Şekil 1b)
- Bir ferrule kullanarak T-kavşak altına "non-beveled" veya düz ucu kanül takın. Ferrule sıkın ferrule anahtarı kullanın.
- Standart ferrule ile geçerek T-kavşak üstüne kılcal boru (~ 1,5 cm) küçük bir parça takın. Bir ferrule anahtarı ile sıkın.
- Mikroelektrodu kapiller boru, T-kavşak, kanül ve ilgili ferrules ile geri yükleyin.
- Elektrotun arka ucunun kılcal borunun arkasından 1 cm'den daha az bir çıkıntı yaptığından ve elektrot ucunun kanülden alt tarafta istenilen mesafede çıkıntı yaptığından emin olun. Elektrot pozisyonu üst uçtan manuel olarak ayarlanabilir.
- Mikroelektrot terminaline altın bir iğnele lehim.
- Altın pin ve üst ferrule arasında epoksi tutkal ekleyin ferrule mikroelektrot eklemek için.
- Kanül içindeki sondayı geri çekmek için üst ferrule'yi sökün. Mikroelektrotun kanüle tamamen geri çekilen görsel olarak doğrulayın.
3. Mikroakışkan Devrenin İnşası (Şekil 2)
- Sabit bir yüzeye bir ekmek tahtası yerleştirin. İki üç yönlü vanaları ekmek tahtasının en uzun kenarlarına paralel olarak yerleştirin, yaklaşık 6 in. ayrı bir bağlantı noktası (her zaman açık olan) birbirine bakacak şekilde. Ekmek tahtası için vanaları düzeltmek için vida kullanın.
- Vanaların yanına bir cetvel yerleştirin (kılcal boru içindeki sıvıların hareketini ölçmek ve izlemek için).
- Gaz geçirmez şırınga ve Marker pompa yer içine 1:1 düşük viskozite yağı ve gıda boyama (marker) karışımı yükleyin. Bir parça kılcal boruyu kesin ve şırıngayı Giriş vanasındaki bağlantı noktalarından birine bağlamak için standart ferrules ve Luer-lock konektörleri kullanın. Bu "işaret satırı".
- "Cetvel hattı" için kılcal boru kısa bir parça kesin. Vanaların yüz yüze bağlantı noktalarına sıkılaştırmak için standart ferrules'ları kullanın.
- Çıkış valfini mikroenjekrode'ye bağlamak ve İlaç pompasını Giriş vanasına bağlamak için iki adet daha uzun kılcal boru parçası kesin (standart ferrules kullanın).
NOT: Bu iki hattın uzunluğu deneysel kurulum bağlıdır, bir hayvana infüzyon aparatı ulaşmak için yeterince uzun olmalıdır, ve giriş vanası ilaç pompası diğer. Kılcal boru kesmek için bir kesme taşı kullanın.
4. Mikroenjekrode'nin Mikrosürücüye Montajı (Şekil 3)
- Mikroelektrot/deneysel probun montajdan önce kanülde geri çekildiğinden emin olun.
NOT: Kılavuz tüp mikrosürücü pozisyonunda olmalıdır. - Mikroenjekrode için özel yapım bir adaptör takın.
- Mikroenjektomu kılavuz tüpten geçirin ve vidalar kullanarak adaptöre sabitle.
- Mikroenjekrode'un kılavuz tüpten çıkıntı yaptığı mikrosürücü pozisyonunu (derinliği) ölçün ve eklemeye hazırlanmak için ~1 cm geri çekin.
- Mikroinfüzyon deneyleri için, "beyin hattı" mikroenjekrode kullanılmayan T-kavşak açılış bağlayın. Standart bir ferrule kullanın ve ferrule anahtarı ile sıkın.
5. Mikroakışkan Sistemin Kızarma ve Hazırlanması
- Mikro sürücüyü bir atık kabının üzerine mikroenjektörle yerleştirin.
- Klorheksidini (örn. nolvasan; 20 g/L'de çözünmüş) 1 mL gaz geçirmez şırıngaya yükleyin ve İlaç pompasına yerleştirin. Bu sıvı vana hattı ve dışarı "beyin hattı" için vana yoluyla İlaç pompası gider gibi vanaların akış yönünü açın.
- En az 10 dk. Steril salin ve hava ile 5,2'den 5,3'e kadar düşük akış hızı (50-200 μL/dk) kullanarak devreyi klorheksidinle yıkayın.
NOT: Bu aşamada sızıntıları kontrol etmek önemlidir. Ferrules aracılığıyla herhangi bir sıvı sızıntıları ortaya yardımcı olmak için kavşaklarda hafifçe tüy bırakmayan mendil uygulayın. - İlacı 500°L gaz geçirmez şırıngaya yükleyin, havayı sıkıştırın ve ilaç pompasına yerleştirin. Mikroenjekrode birkaç damla akana kadar 50 μL/dk'da akış.
- Kılavuz tüpünü klorheksidin (20 g/L'de çözünmüş) 15 dakika bekletin.
- Çıkış valfinin yönünü "yıkama hattına" doğru çevirin. Marker pompasını, cetvel çizgisinde net bir renk ve yağ kenarı gözlemlenene kadar ilerletin. İki suda çözünen malzeme karıştırmamak ve aralarında keskin kenar kaybetmek için ilaç ve renk arasında her zaman yağ olduğundan emin olun. Bu yağ/boya hattının başlangıç konumunu (bir bant veya işaretleyici parçasıyla) işaretleyin.
- Çıkış valfinin yönünü beyin çizgisine doğru çevirin.
6. Kayıt veya İnfüzyon Deneyi Gerçekleştirme
NOT: Hayvan işleme adımları laboratuvar ve deneye bağlı olarak değişir. Aşağıdaki adımlar gerekli cerrahi kurulum ve hazırlık dura ortaya çıkarmak için yapıldıktan sonra yapılacak. Deneyden sonra, gerekli tüm prosedür sonrası adımlar kurumsal olarak onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirilmelidir.
- Mikro sürücüyü kayıt odasına takın. Dura nüfuz kılavuz tüp düşürün.
NOT: Kılavuz tüp kortekse zarar vermemek için dura dan daha fazla nüfuz etmemelidir. - Mikroenjekrode'u, beyinde kayıt/enjeksiyon için sitenin yaklaşık 2 mm yukarısına düşürün.
- Üst ferrule sıkın (mikroelektrot / biyosensör çıkıntılı) ve kayıt sistemine altın pimleri bağlayın. Mikroenjekrode'u hedef bölgeye doğru ilerletmeye devam et.
NOT: Mikroelektrotun hesaplamalarda kanülün ötesine kadar uzandığı mesafeyi eklemeyi unutmayın. - İnfüzyon deneyleri için, yağ sütununa her 3 dakikada bir (~60 nL/dk) 1 cm taşımak için manuel mikroşinga pompasını kullanın. İstenilen hacim aşılandıktan sonra Çıkış valfini yıkama hattına doğru çevirin.
NOT: Aşılanan hacim, hedeflenen model türlere ve beyin bölgesine göre değişir. Daha hızlı akış hızları nöral dokuya zarar verebilir. - Deneyler tamamlandığında, kılavuz tüp ün içindeki mikroenjekton'u geri çekin (sondayı çıkıntılı bırakın). Sonra yıkama için mikrosürücüyü çıkarın. 5.1-5.5 adımlarında açıklandığı gibi mikroakışkan sistemi temizle. yeniden kullanıma hazırlanmak için.
NOT: Deneyimlerimize göre, uygun bakım alınırsa mikroenjekrode birkaç kullanım için sürecek. Elektrofizyolojik kayıt kalitesi enjeksiyon kapasitesinden daha hızlı düşer.
Representative Results
Biz bir GABAa agonist enjeksiyonu yapıldı (muscimol) frontal göz alanı nın geri dönüşümlü inaktivasyonu için (FEF), hayvan bir bellek güdümlü saccade görev yapıldı11. Bu görevde, hayvan sabitler ve bir periferik görsel hedef sunulmaktadır. Hayvan, hedef yeri hatırlarken fiksasyon unu tutar ve fiksasyon noktası kaybolduğunda, ödül almak için hatırlanan yere saccadik göz hareketi uygular. Mikroenjekrode Şekil 1 b'dekitalimatlara göre inşa edilmiştir. Örnek deney için infüzyon hacmi 850 nL idi. Çeşitli yerlerde ve zamanlarda müscimol infüzyonuna göre bellek güdümlü saccade (MGS) görevindeki davranışsal performans Şekil 4'tegösterilmiştir. En büyük performans açıkları infüzyon sonrası 2-3 saat olarak gözlendi.
Şekil 1: Mikroenjekrode adım adım imalatı. (a) Mikroakışkan sistemden bağımsız kullanım yapılandırması. Kanül ve prob, sondanın ucunun istenilen uzunlukta (örn. 150 μm) çıkıntılı olabileceğini doğrulamak için ölçülür. Sonda ön kanüle yüklenmiş. Kanül T-kavşak geçer ve alt tarafında bağlı, T-kavşak ortasında düz ucu ile; sondanın arka ucu üst ferrule ile devam ediyor. Mikroenjekrode, sonda terminallerinin her birinde altın iğneler lehimleyerek ve aralarında tutkal ilave edilerek ve stabilite için üst ferrule ile tamamlanır. Satın alma sistemine bağlantı sondanın tasarımına bağlıdır. Bu örnekte, sondamız üç ipucuna sahip bir nanosensördür. (b) Mikroakışkan sistemile kullanım için yapılandırma. Mikroenjekrode'u mikroakışkan sisteme çift olarak, T-kavşağının üst tarafı için bir kılcal boru parçası kullanılır. Sonda ön veya arka yüklenmiş olabilir. Mikroakışkan hat daha sonra üçüncü T-kavşak açıklığına takılır. Bu örnekte bir mikroelektrot kullandık. Mikroelektrotun üst ferrule'yi sıkarak çıkıntılı olduğu bir kanülün ucunun yakınlaştırılmış resmine bakın. İnşaatta kullanılan öğelerin listesi için Malzemeler Tablosuna bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroakışkan sistem. İki valf konfigürasyonu, mikroenjektöre veya sorun giderme için yıkama hattına doğru akış yönünün kontrol altına sini sağlar. Devre, kılcal boru ve standart ferrules kullanılarak bağlanan iki 3 portlu valağa dayanır. Gaz geçirmez şırıngalar, infüzyon ilacını ve işaretleyiciyi taşımak ve enjekte etmek için kullanılır. Programlanabilir bir şırınga pompası sistemin otomatik kızarma ve ilacın yüklenmesi için izin verir. Manuel microsyringe pompa kontrollü enjeksiyon ve görselleştirme sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Enjeksiyon kapasitesi olan ve olmayan hidrolik bir mikrosürücüye mikroenjekrode montajı. Adım 4.1: Özel yapım adaptör mikroenjekrode'un mikrosürücüye bağlanmasını sağlar. Tek bir vida adaptörü mikrosürücüye bağlar; iki vida adaptöre mikroenjekrode emniyetini sağlar. Mikrosürücünün kılavuz tüpüne mikroenjektör yüklenirken mikroelektrot/deneysel probun ucunu korumak için üst ferrule en az 2 dönüş sökülmelidir. Adım 4.3: Yukarıdan kılavuz tüpüne mikroenjekton yerleştirin. Adım 4.4: Mikroinfüzyon uyguluyorsanız, ilaç hattını plastik bir ferrule kullanarak üçüncü T-kavşak açıklığına takın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FEF'de mussimol infüzyonu sırasında bellek güdümlü saccade görevi. (a)Mikroenjekrode sağ yarımkürede, FEF alana yerleştirildi. (b) Sekiz hedefin periferik olarak yerleştirildiği bir MGS görevi sırasında davranışsal performans. Biz mgs görev 4 blok koştu, önce ve enjeksiyondan sonra üç kez. Kutup çizimi, fiksasyon noktasına göre farklı konumlar için bu zamanların her birinde (renk) performans (eksantriklik) gösterir (kutup çizimine açı). Enjeksiyondan sonra sol görme hemifield 2 saat (mavi iz, kutup çiziminin sol yarısı) performansı açıkça azalmıştır. (c) FEF'de (sağ, 1 ve 3 saat post-infüzyon) mussimol enjeksiyonundan önce (solda) ve sonra 8 periferik bellek yeri için saccade izleri. Sol görme hemifield saccade doğruluğu (polar çizer sol yarısı) mussimol enjeksiyonu sonrası azaldı. Görme açısı (dva) derecelerinde ölçeklendirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Çeşitli yöntemler şu anda eşzamanlı ilaç teslimat ve elektrofizyoloji gerçekleştirmek için kullanılabilir. Sistemimiz, kayıtlarda bağımsız olarak veya ilaç enjeksiyonu ile birlikte kullanılabilme esnekliğine sahip olmak ve dura mater ve nöral doku yoluyla herhangi bir hasardan korunan nanosensör veya mikroelektrot gibi kırılgan deneysel probu tam olarak yerleştirme yeteneğine sahip olmak için tasarlanmıştır. Sistem çıplak gözle ilaç infüzyon hacimlerinin hassas kontrolünü sağlar (laboratuarımızda önceki çalışmalarda gösterilen 17 nLhassasiyeti 3).
Daha küçük çaplarda basınç enjeksiyonu için daha özel sistemler vardır12. Bu sistemler birden fazla kayıt sitesi için izin verir, ancak sistemin kontrolü için gerekli yazılım ve donanımkarmaşık kurulum bileşenlerinin her biri için daha yüksek maliyetler taşır ve henüz büyük bir ölçekte ticari olmayan deneysel problar ile arayüz için daha az esnekliğe sahiptir. Ayrıca, bizim enjektör kronik bir implant gerektirmez ve esneklik büyük ölçüde sağlar: kimyasal ve elektrofizyolojik sinyalleri ölçmek için biyosensörler ile uyumlu, ve de ilaç aşılama yeteneğine sahip, bu yanıtlar lokalize ilaç infüzyon etkisini ölçmek için potansiyel.
Tasarım, probun yapısına zarar vermemek için deneysel probun dura penetrasyonundan sonra çıkıntılı olmasını sağlar. Bu özellik cihazın çok işlevsellik sağlar, nanometre ölçekli nanosensors10gibi herhangi bir deneysel prob zarar riski olmadan dura nüfuz etmek. Ancak, standart ferrules için ~ 1 mm ile sınırlı, ferrule dönüş sayısı ile sınırlı, çıkıntılı olabilir uzunluğu bir sınırlama vardır. Küçük kanül çapına bağlı olarak en az doku hasarı vardır (228 μm).
Gösterdiğimiz deneyde, sistem FEF'nin geri dönüşümlü inaktivasyonu için müsimolün kontrollü teslimatını gerçekleştirmek için kullanıldı, aynı anda elektriksel stimülasyon veya hücre dışı kayıt (tek nöron, yerel alan potansiyeli) kullanılarak mikro elektrot. FEF'deki bu deney, inaktivasyondan önce saccade vektörlerini doğrulamak için FEF'nin mikrostimülasyonu gerektirir ve ilaç geri dönüşümlü FEF inaktivasyonu sırasında çalışma belleği üzerinde çalışmak için aşılandı. Bu aynı izole tek nöron bir kayıt önce ve ilaç enjeksiyonu sonra muhafaza edilebilir olası değildir; ancak, infüzyon öncesi ve sonrası yerel alan potansiyellerini kaydetmeyi başardık. Burada enjeksiyon, kayıt ve elektriksel stimülasyonun biraraya geldiği bir deney gösteriyoruz.
Kurulduktan sonra, yöntem çok güvenilir ve sağlamdır. Ancak, küçük tüp ve portlar içinde küçük moleküllerin (örneğin, tuz) yağış nedeniyle, mikroakışkanların tıkanıklık ve sızıntılardan uzak tutmak için her deneyden sonra iyice temizlenmesi gerekir. Tüm devrenin basitliği sayesinde, her bileşen kolay sorun giderme için bağımsız olarak değiştirilebilir.
Yöntem insan olmayan bir primat FEF alanında gösterilmiştir rağmen, ilke kemirgen boyutu veya daha büyük türlerde, elektrikstimülasyon, kayıt ve ilaç enjeksiyonu bazı kombinasyonu istenen başka bir beyin alanına uygulanabilir.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), EY026924 ve EY014800 (B.N.), Körlüğü Önlemek Için Araştırma, Inc. New York, NY Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne sınırsız hibe hibe finansmanı ile desteklenmiştir, Üniversite Utah ve Henry Samueli Mühendislik Okulu ve California Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Bölümü, Irvine tarafından R.E. sağlanan başlangıç fonları. Bu yöntem, Dr Tirin Moore'un laboratuvarında geliştirilen benzer bir yöntemin önceki raporuna dayanmaktadır, Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience Methods'de yayınlanmıştır. Yazarlar, dr. Kelsey Clark'a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
