Summary
당사는 전기 생리학을 위해 설계된 마이크로인로드 시스템을 제시하고 선택적 약물 주입과 함께 실험 프로브(즉, 나노센서, 마이크로전극)의 보조 전달을 지원합니다. 널리 이용 가능한 미세유체 성분은 프로브를 함유하는 캐뉼라에 결합된다. 마이크로 인젝트 로드 건설을위한 단계별 프로토콜이 포함되어 있으며, 마카크 피질에서 muscimol 주입 중 결과가 있습니다.
Abstract
이 마이크로 인젝트로드 시스템은 약물 주입, 전기 생리학 및 마이크로 전극 및 나노 센서와 같은 실험 프로브의 전달 및 검색을 위해 설계되었으며 깨어 있는 동물의 반복 사용에 최적화되어 있습니다. 마이크로 인젝트 로드 시스템은 여러 가지 목적을 위해 구성 될 수있다 : (1) 그렇지 않으면 dura mater를 관통하기에 너무 깨지기 쉬운 실험 프로브의 배치를위한 캐뉼라의 간단한 배열, (2) 약물의 미세 유체 주입, 중 하나 독립적으로 또는 실험 프로브 (즉, 마이크로 전극, 나노 센서)를 포함하는 캐뉼라에 결합. 이 프로토콜에서 우리는 마이크로 인젝트로드의 단계 적 구성, 미세 유체 구성 요소에의 결합 및 생체 내에서 시스템을 사용하기위한 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. 이 시스템의 미세 유체 구성 요소는 침투 손상을 최소화하면서 나노 리터 스케일에서 볼륨을 전달할 수 있습니다. 약물 주입은 깨어있는 동물에서 마이크로 전극 또는 나노 센서와 같은 실험 프로브와 독립적으로 또는 동시에 수행 될 수 있습니다. 이 시스템의 응용 분야는 약물이 피질 전기 적 활동 및 행동에 미치는 영향을 측정하는 것부터 프로브 또는 나노 센서 측정에 기반한 행동 성능의 맥락에서 피질의 특정 영역의 기능을 이해하는 것까지 다양합니다. 이 시스템의 기능 중 일부를 설명하기 위해, 우리는 작업 메모리 작업 동안 rhesus macaque에서 전두엽 안구 (FEF)의 가역적 인 비활성화에 대한 muscimol 주입의 예를 제시한다.
Introduction
전기 생리학 및 약물 주입 방법은 신경 활동 및 행동, 생체 내, 설치류 및 영장류를 연구하기 위해 신경 과학에서 널리 사용됩니다. 지난 3년간, 초기 인젝트로드 모델의 개선은 보다 정밀하고 덜 침습적인 기술을 허용했으며, 특정 뇌 부위에서 동시 기록 및 약물주사를1,2,3. 특히 영장류의 경우, 고도로 훈련된 동물을 필요로 하는 고급 인지 기능 연구에 이 기술을 사용하려면 최소한의 조직 손상으로 소량을 정확하게 전달하는 능력이 중요합니다. 최근 진보는 이식된프로브4를이용한 자극과 함께 만성 전기생리학적 및 화학적 측정을 포함하고 있으며, 결합된 기록 및 미세유체 약물 전달은 최근 설치류5에서시범적으로 시험되고 있다. 여기서 설명된 인젝트로드 시스템은 전기생리학적 기록, 자극 및 정밀한 약물 전달을 허용하며, 이미 여러 영장류실험실에서성공적으로 구현되어 있다6,7,8.
신경 과학 응용 분야가 있는 나노 센서9,10과 같은 섬세한 특수 센서의 가용성이 증가함에 따라 깨지기 쉬운 나노 스케일 장치 또는 마이크로 전극 팁을 손상시키지 않으면서 경질 미터를 통해 프로브를 얻을 수 있는 신뢰할 수 있는 방법이 요구됩니다.
우리는 쉽게 사용할 수있는 저렴한 구성 요소를 사용하여 이러한 방법을 결합하는 기술적 인 문제를 극복하고 두 가지 주요 기능을 용이하게하는 마이크로 인젝트 로드 시스템을 설계했습니다. 마이크로 전극 또는 나노 센서, 경막 미더 및 신경 조직을 통해, 어떤 손상으로부터 보호. 이 기능을 사용하면 대상 위치에 실험 프로브를 배치 할 수 있으며, 신경 조직을 통해 가이드로 캐뉼라를 사용하여 전달됩니다. (ii) 전기 생리학 기록 및 약물 주입과 전기 자극을 결합한 실험을 수행하기 위해 마이크로 전극을 사용하는 능력.
우리의 시스템은 경도를 관통하는 가이드 튜브를 사용, 약물 전달을 위해 모두 기능 캐뉼라와 함께 (미세 주입시스템을 사용하는 경우) 마이크로 전극 또는 나노 센서에 대한 추가 보호를 제공합니다 (둘 다 경막을 통과 할 때 및 신경 조직). 이 시스템은 저렴하고 쉽게 찾을 수있는 널리 상업적으로 사용할 수있는 구성 요소로 쉽게 구성 할 수 있습니다. 우리는 작은 직경 의 캐뉼라 (외경 OD = 235 μm, 내경 ID = 108 μm)를 사용하여 침투 손상을 최소화합니다.
여기서 우리는 미세 유체 시스템의 미세 주입 로드 구성 및 구성에 대한 단계별 지침을 제시합니다. 우리는 약물 주입을 위한 microfluidic 시스템에 독립적으로 또는 결합된 microinjectrode의 사용을 위해 필요한 단계를 설명합니다. 나노센서9,10과같은 깨지기 쉬운 실험 프로브에도 유사한 접근법을 적용할 수 있다. 프로브는 캐뉼라에 전면 또는 후적재(설계에 따라 다름)할 수 있으며, 경막및 신경 조직을 관통할 때 손상으로부터 보호됩니다. 우리는 비 인간 영장류를 이용한 생체 내 실험에서 예제 데이터를 제공하며, 이 실험에서 우리는 전기 자극을 수행하기 위해 텅스텐 마이크로 전극을 사용하고, 이어서 동물이 기억 유도 사카데 (MGS) 작업을 수행하는 동안 전두엽 안구 (FEF)에 muscimol을 주입했습니다.
Protocol
실험 절차는 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회 및 신경 과학 지침 및 정책을 위한 사회를 따랐습니다. 실험 및 행동 절차에 대한 프로토콜은 유타 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 자극 및 녹음을위한 마이크로 인젝트 로드의 건설(그림 1a)
- 캐뉼라와 프로브의 길이를 측정합니다(이 예에서는 나노센서). 프로브는 캐뉼라 팁(프로브 설계에 따라 다름)과 약 2cm의 길이로 캐뉼라보다 길어야 합니다.
- 돋보기 또는 현미경 (~ 10 배율)에서 프로브를 캐뉼라에 로드하십시오. 가능하면 프로브의 팁을 보호하는 것이 백 로딩이 바람직하다.
참고: 수동으로 수행되는 이 단계는 어려운 일입니다. 실제 실험 프로브를 시도하기 전에 돋보기 아래에 마이크로 전극으로 연습하는 것이 좋습니다. -
상단 페룰, T 접합부 및 하단 페룰을 통해 캐뉼라(프로브 포함)를 통과합니다.
- 프로브가 부착이 없는 단일 와이어인 경우 캐뉼라에 다시 로드하고 어셈블리를 하단 페룰에서 T 접합부에 삽입합니다. 캐뉼라 (플랫 엔드 측면)의 상단은 T 접합의 중간에 위치해야, 하단 내에서하지만 상단 ferrule. 실험 프로브 또는 바이오 센서는 상단 페룰의 상단 위로 돌출되어야합니다.
참고: 맞춤형 페룰은 마이크로 드릴 비트를 사용하여 페룰 플러그의 구멍을 드릴링하여 만들 수 있으며, 구멍의 크기는 캐뉼라를 T 접합부로 조이는 데 필요한 직경을 기반으로 합니다.
- 프로브가 부착이 없는 단일 와이어인 경우 캐뉼라에 다시 로드하고 어셈블리를 하단 페룰에서 T 접합부에 삽입합니다. 캐뉼라 (플랫 엔드 측면)의 상단은 T 접합의 중간에 위치해야, 하단 내에서하지만 상단 ferrule. 실험 프로브 또는 바이오 센서는 상단 페룰의 상단 위로 돌출되어야합니다.
- 페룰 렌치를 사용하여 T 접합부 의 상단과 하단의 페룰을 조입니다. 지나치게 조이지 마십시오. 튜브의 작은 조각은 상단 ferrule 내에서 전극 지원을 강화하기 위해 추가 될 수있다.
- 프로브의 사양에 따라 각 프로브 단자(신호, 접지 등)에 납땜 골드 핀이 있습니다.
- 프로브와 캐뉼라의 상대 위치를 조정합니다. 배율 하에서 캐뉼라에서 프로브가 돌출되는 거리를 측정하고 상단에서 수동으로 조정합니다(프로브는 페룰 내에서 자유롭게 미끄러질 수 있음).
- 골드 핀과 상단 페룰 사이에 에폭시 접착제를 추가하여 프로브를 페룰에 부착합니다.
- 상단 페룰을 풀고 캐뉼라 내부의 프로브를 철회합니다. 프로브가 배율 하에서 캐뉼라 내에 완전히 있는지 시각적으로 확인합니다.
- 인젝로드를 마이크로 드라이브에 부착합니다.
2. 약물 주입을위한 마이크로 인젝트 로드의 건설(그림 1b)
- 페룰을 사용하여 캐뉼라의 "비종" 또는 평평한 끝을 T 접합부 바닥에 부착합니다. 페룰 렌치를 사용하여 페룰을 조입니다.
- 표준 페룰을 통과하여 T 접합부 상단에 모세관 튜브 (~1.5 cm)의 작은 조각을 부착합니다. 페룰 렌치로 조입니다.
- 모세관 튜브, T 접합부, 캐뉼라 및 해당 페룰을 통해 마이크로 전극을 역하합니다.
- 전극의 백 엔드가 모세관 튜브의 뒤쪽에서 1cm 미만으로 돌출되고 전극의 끝이 캐뉼라에서 돌출되어 아래쪽의 원하는 거리에 있는지 확인하십시오. 전극 위치는 상단에서 수동으로 조정할 수 있습니다.
- 미세 전극 단자에 골드 핀을 납땜합니다.
- 골드 핀과 상단 페룰 사이에 에폭시 접착제를 추가하여 마이크로 전극을 페룰에 부착합니다.
- 상단 페룰을 풀고 캐뉼라 내부의 프로브를 철회합니다. 미세 전극이 캐뉼라로 완전히 후퇴되어 있는지 시각적으로 확인합니다.
3. 미세 유체 회로의 건설(그림 2)
- 브레드보드를 안정된 표면에 놓습니다. 두 개의 3방향 밸브를 브레드보드의 가장 긴 면에 평행하게 놓고, 약 6인치 떨어진 곳에 하나의 포트(항상 열려 있는 밸브)를 서로 마주보고 있습니다. 나사를 사용하여 밸브를 브레드보드에 고정합니다.
- 밸브 옆에 눈금자를 놓습니다(모세관 튜브 내부의 유체 움직임을 측정하고 추적하기 위해).
- 1:1 저점도 오일과 식품 착색제(마커)를 혼합하여 단단한 주사기에 넣고 마커 펌프에 넣습니다. 모세관 튜브 한 조각을 자르고 표준 ferrules 및 Luer-lock 커넥터를 사용하여 주사기를 입력 밸브의 포트 중 하나에 연결합니다. 이것은 "마커 선"입니다.
- "눈금자 라인"에 대한 모세관 튜브의 짧은 조각을 잘라. 표준 페룰을 사용하여 밸브의 마주보고 있는 포트를 조입니다.
- 출력 밸브를 마이크로 인젝트로드에 연결하고 약물 펌프를 입력 밸브에 연결하기 위해 모세관 튜브 의 두 개를 더 길게 자릅니다 (표준 ferrules 사용).
참고: 이 두 라인의 길이는 실험 설정에 따라 다르며, 하나는 주입 장치에서 동물로 도달할 수 있을 만큼 충분히 길어야 하며, 다른 하나는 약물 펌프에서 입력 밸브로 도달해야 합니다. 모세관 튜브를 잘라 절단 돌을 사용합니다.
4. 마이크로 드라이브에 마이크로 인젝드로드장착(그림 3)
- 장착하기 전에 마이크로 전극/실험 용 프로브가 캐뉼라에서 후퇴되었는지 확인하십시오.
참고: 가이드 튜브는 마이크로 드라이브의 위치에 있어야합니다. - 마이크로인젝트로드에 맞춤형 어댑터를 부착합니다.
- 마이크로인젝트로드를 가이드 튜브를 통해 적재하고 나사를 사용하여 어댑터에 고정합니다.
- 마이크로인로드가 가이드 튜브에서 돌출되는 마이크로드라이브 위치(깊이)를 측정한 다음 ~ 1cm를 리트랙트하여 삽입을 준비합니다.
- 미세 주입 실험의 경우, "뇌 라인"을 마이크로 인젝트로드의 사용되지 않는 T 접합 개구부에 연결하십시오. 표준 페룰을 사용하고 페룰 렌치로 조입니다.
5. 미세 유체 시스템의 플러싱 및 준비
- 마이크로드라이브에 마이크로드라이브가 낭비 비커 위에 놓습니다.
- 클로르헨시딘(예: 놀바산; 20 g/L에서 용해)을 1 mL 의 방제 주사기에 넣고 약물 펌프에 넣습니다. 유체가 약물 펌프에서 밸브를 통해 밸브 라인으로 이동하고 "브레인 라인"을 벗어나도록 밸브의 흐름 방향을 돌립니다.
- 최소 10분 동안 낮은 유량(50-200 μL/min)을 사용하여 클로르헨시딘으로 회로를 세척합니다.
참고: 이 단계에서 누출을 확인하는 것이 중요합니다. 접합부에서 보풀이 없는 물티슈를 부드럽게 발라 서서히 액체가 누출되는 것을 방지합니다. - 500 μL 의 단단한 주사기에 약물을 적재하고 공기를 압축한 다음 약물 펌프에 놓습니다. 마이크로인젝트로드에서 몇 방울이 흐를 때까지 50 μL/min에서 흐르게 됩니다.
- 가이드 튜브를 클로르헨시딘(20 g/L로 용해)에 15분 동안 담급니다.
- 출력 밸브의 방향을 "플러싱 라인"으로 돌립니다. 마커 펌프를 눈금자 선에서 선명한 색상과 오일 가장자리가 관찰될 때까지 진행합니다. 두 수용성 물질을 혼합하고 그들 사이의 날카로운 가장자리를 잃지 않기 위해 약물과 색상 사이에 항상 오일이 있는지 확인하십시오. 이 오일/염료 라인의 시작 위치를 테이프 또는 마커로 표시합니다.
- 출력 밸브의 방향을 뇌 선쪽으로 돌립니다.
6. 기록 또는 주입 실험 수행
참고: 동물 취급 단계는 실험실 및 실험에 따라 달라집니다. 다음 단계는 필요한 수술 설정 및 경도를 노출시키기 위해 준비를 수행 한 후 수행되어야한다. 실험 후, 필요한 모든 절차 후 단계는 제도적으로 승인 된 프로토콜에 따라 수행해야합니다.
- 마이크로 드라이브를 녹음 챔버에 부착합니다. 가이드 튜브를 낮추어 듀라를 관통합니다.
참고: 가이드 튜브는 피질을 손상시키지 않기 위해 경막보다 더 이상 침투해서는 안됩니다. - 뇌의 기록/주입을 위해 사이트 위 약 2mm로 마이크로 인젝로드를 낮춥습니다.
- 상단 페룰(돌출된 마이크로전극/바이오센서)을 조이고 골드 핀을 기록 시스템에 연결합니다. 마이크로인로드를 대상 부위로 계속 전진시다.
참고: 계산에서 마이크로 전극이 캐뉼라를 넘어 확장되는 거리를 포함해야 합니다. - 주입 실험의 경우 수동 마이크로시링기 펌프를 사용하여 3분마다 1cm(~60nL/min)씩 오일 열을 이동시면 됩니다. 원하는 부피가 주입되면 출력 밸브를 플러싱 라인으로 전환합니다.
참고: 주입된 부피는 표적 모델 종 및 뇌 영역에 따라 달라집니다. 빠른 유량은 신경 조직을 손상시킬 수 있습니다. - 실험이 완료되면 가이드 튜브 내의 마이크로 인젝드로드를 철회하십시오 (프로브가 돌출된 상태로 둡니다). 그런 다음 플러싱을 위해 마이크로 드라이브를 제거합니다. 단계 5.1-5.5에 설명된 대로 미세 유체 시스템을 플러시합니다. 재사용에 대비할 수 있습니다.
참고: 우리의 경험에서, microinjectrode 적절 한 치료를 촬영 하는 경우 몇 가지 사용에 대 한 지속 됩니다. 전기 생리학적 기록 품질은 주입 능력보다 빠르게 떨어집니다.
Representative Results
우리는 전두엽 안구(FEF)의 가역적 불활성화를 위해 GABAa 주작동근(muscimol)을 주입하는 것을 수행했으며, 동물이 기억 유도 사케이드작업(11)을수행하였다. 이 작업에서는 동물 고정 및 주변 시각적 대상이 표시됩니다. 동물은 대상 위치를 기억하면서 고정을 유지하고, 고정 지점이 사라지면, 보상을받을 기억에 남는 위치에 saccadic 눈 운동을 실행합니다. 마이크로인젝트로드는 그림 1b의지침에 따라 제작되었습니다. 실시예 실험에 대한 주입 부피는 850 nL이었다. muscimol 주입에 비해 다양한 위치 및 시간에 대한 메모리 유도 삭케이드(MGS) 태스크에 대한 행동 성능은 도 4에나타내고 있다. 가장 큰 성능 적자는 주입 후 2 ~ 3 시간에서 관찰되었다.
그림 1: 마이크로인젝트로드의 단계제작에 의해 단계별. (a)미세 유체 시스템과 무관한 사용 구성. 캐뉼라 및 프로브는 프로브의 팁이 원하는 길이(예를 들어, 150 μm)로 돌출될 수 있는지 확인하기 위해 측정된다. 프로브는 캐뉼라에 전면로드됩니다. 캐뉼라는 T 접합을 통과하고 하단측에 부착되며, T-접합부 중간에 평평한 끝이 있습니다. 프로브의 백 엔드는 상단 페룰을 통해 계속됩니다. 마이크로인로드는 각 프로브 단자에 골드 핀을 납땜하고 안정성을 위해 그(것)들과 최고 ferrule 사이 접착제를 추가하여 마무리됩니다. 수집 시스템에 대한 연결은 프로브의 설계에 따라 달라집니다. 이 예에서, 우리의 프로브는 3개의 리드가 있는 나노센서이다. (b)미세 유체 시스템과 함께 사용하기위한 구성. 미세 유체 시스템에 미세 주입을 결합하기 위해, 모세관 튜브의 조각은 T 접합의 상단 측에 사용된다. 프로브는 전면 또는 후면 로드될 수 있습니다. 그런 다음 미세 유체 라인을 세 번째 T 접합 개구부에 연결합니다. 이 예제에서는 마이크로 전극을 사용했습니다. 상단 페룰을 조여 마이크로 전극이 돌출된 캐뉼라 끝의 확대 된 그림을 참조하십시오. 건설에 사용되는 항목 목록은 재료 표를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 유체 시스템. 2밸브 구성을 통해 마이크로인젝트로드를 향한 유동 방향 또는 플러싱 라인을 통해 문제 해결을 위한 흐름을 제어할 수 있습니다. 이 회로는 모세관 튜브와 표준 페룰을 사용하여 연결된 두 개의 3포트 밸브에 의존합니다. 간수주사기는 주입 약물과 마커를 운반하고 주입하는 데 사용됩니다. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프는 시스템의 자동 플러싱 및 약물 로딩을 허용합니다. 수동 마이크로시링기 펌프는 제어된 주입 및 시각화를 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 사출 용량이 유무에 관계없이 유압 마이크로드라이브에 마이크로인로드를 장착합니다. 4.1 단계: 맞춤형 어댑터를 사용하면 마이크로 드라이브에 마이크로 인젝트로드를 부착할 수 있습니다. 단일 나사가 어댑터를 마이크로드라이브에 부착합니다. 두 개의 나사가 어댑터에 마이크로 인젝트로드를 고정시다. 마이크로 드라이브의 가이드 튜브에 마이크로 인젝트로로드를 로딩 할 때 마이크로 전극 / 실험 프로브의 끝을 보호하기 위해 상단 ferrule은 적어도 2 회전을 풀어야합니다. 4.3 단계 : 상단에서 가이드 튜브에 마이크로 인젝트를 삽입하십시오. 4.4 단계 : 미세 주입을 수행하는 경우 플라스틱 페룰을 사용하여 약물 라인을 세 번째 T 접합 개구부로 연결하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FEF에서 머시몰 주입 중에 기억 유도 사카데 태스크. (a)마이크로인로드를 오른쪽 반구, FEF 영역에 위치하였다. (b)8개의 대상이 주변에 배치되는 MGS 작업 중 행동 성능입니다. 우리는 실행 4 MGS 작업의 블록, 주입 전후 세 번. 극좌표 플롯은 고정점(극지 플롯의 각도)을 기준으로 서로 다른 위치에 대해 이러한 각 시간(색상)에서 성능(편심)을 표시합니다. 성능은 명확하게 주입 후 왼쪽 시각적 헤미 필드 2 시간 감소 (파란색 흔적, 극지 플롯의 왼쪽 절반). (c)Saccade 는 FEF에서 muscimol 주입 전(왼쪽) 및 후 8개의 주변 메모리 위치에 대한 추적(오른쪽, 1 및 3시간 주입 후). 왼쪽 시각적 헤미필드(극지 플롯의 왼쪽 절반)에서 사케이드 정확도는 muscimol 주입 후 감소했습니다. 시야각(dva)의 각도로 배율을 조정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
몇몇 방법은 현재 동시 약물 전달 및 전기 생리학을 능력을 발휘하기 위하여 유효합니다. 우리의 시스템은 독립적으로 또는 약물 주입과 함께 기록에 사용할 수있는 유연성을 가지고, 정밀하게 나노 센서 또는 마이크로 전극과 같은 깨지기 쉬운 실험 프로브를 배치 할 수있는 능력을 가지고, 어떤 손상으로부터 보호, 경구 마더 및 신경 조직을 통해. 이 시스템은 육안으로 약물 주입 볼륨을 정밀하게 제어 할 수 있습니다 (실험실3의이전 연구에서 나타난 17 nL 정밀도).
더 작은 직경12압력주입을 위한 더 전문화된 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 여러 기록 사이트를 허용하지만 시스템 제어에 필요한 소프트웨어 및 하드웨어의 복잡한 설정은 각 구성 요소에 대해 더 높은 비용을 수반하며 아직 대규모로 상용화되지 않은 실험 용 프로브와 인터페이스할 수 있는 유연성이 적습니다. 또한, 우리의 injectrode는 만성 임플란트를 필요로하지 않으며 유연성의 큰 정도를 제공합니다 : 화학 및 전기 생리 학적 신호를 측정하는 바이오 센서와 호환, 뿐만 아니라 약물을 주입 할 수있는, 이러한 응답에 국부적 인 약물 주입의 효과를 측정 할 수있는 가능성.
이 설계는 프로브의 구조에 손상을 방지하기 위해 듀라 침투 후 실험 프로브를 돌출 할 수 있습니다. 이 기능은 나노미터 규모의나노센서(10)와같은 임의의 실험 프로브의 손상을 위험없이, 장치의 다기능성, 경구를 관통할 수 있게 한다. 그러나, 표준 페룰에 대해 ~1 mm로 제한되는 페룰의 회전 수에 의해 제한되는 돌출될 수 있는 길이의 한계가 있다. 작은 캐뉼라 직경 (228 μm)으로 인한 최소한의 조직 손상이 있습니다.
우리가 보여 준 실험에서, 시스템은 FEF의 가역적 불활성화를 위한 muscimol의 통제된 전달을 능력을 발휘하기 위하여 이용되었습니다, 동시에 전기 자극 또는 세포외 기록 (단일 뉴런, 국부적인 필드 전위)를 사용하여 마이크로 전극. FEF에서의 이 실험은 불활성화 전에 삭케이드 벡터를 확인하기 위해 FEF의 미세 자극을 필요로 하며, 약물은 가역적 FEF 불활성화 동안 작업 기억을 연구하기 위해 주입되었다. 약물 주사 전후에 동일한 단하나 뉴런의 기록이 유지될 가능성은 희박합니다. 그러나 주입 전후에 로컬 필드 잠재력을 기록할 수 있었습니다. 여기서, 우리는 주입, 기록 및 전기 자극을 결합한 실험을 보여준다.
일단 설정되면 이 방법은 매우 안정적이고 견고합니다. 그러나, 작은 튜브 및 포트 내의 작은 분자 (예를 들어, 소금)의 침전으로 인해, 장애물과 누출의 미세 유체를 유지하기 위해 각 실험 후 철저한 플러싱이 필요합니다. 전체 회로의 단순성으로 인해 각 구성 요소를 독립적으로 교체하여 쉽게 문제를 해결할 수 있습니다.
이 방법은 인간이 아닌 영장류에서 FEF 영역에서 입증되었지만, 원리는 설치류 크기 또는 그 이상 종에서 전기 자극, 기록 및 약물 주입의 일부 조합이 바람직한 다른 뇌 영역에 적용될 수 있다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (NIH)의 자금 지원으로 지원되었으며, EY026924 및 EY014800 (B.N.에), 실명을 방지하기 위한 연구에서 무제한 보조금, Inc., 뉴욕, 뉴욕, 안과 및 시각 과학부에, 대학 헨리 사무엘리 공과대학과 캘리포니아 대학교 어바인 전기공학과에서 R.E.에 제공한 창업 기금. 이 방법은 Noudoost & 무어 2011, 신경 과학 방법의 전표에 간행된 Tirin Moore 박사의 실험실에서 개발된 유사한 방법의 이전 보고를 근거로 합니다. 저자들은 원고에 대한 그녀의 의견에 대해 켈시 클라크 박사에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
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