Summary
水合体摩尔是异常的人类怀孕与异质的异质性，可以根据其形态特征和父母对摩尔基因组的贡献进行分类。本文详细介绍了多路微卫星DNA基因分型和形式固定石蜡嵌入摩尔组织的流式细胞测定方案，以及结果的解释和集成。
Abstract
水合体摩尔（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是营养性过度增殖和胚胎发育异常。有两种类型的HM基于微观形态学评估，完整的HM（CHM）和部分HM（PHM）。这些可以根据父母对摩尔基因组的贡献进一步细分。通过形态学和基因型分析，HM的这种特征对于患者管理和对这种有趣的病理学的基本理解至关重要。据大量记录，HM 的形态分析受到广泛的观察者间变异性的影响，本身不足以准确分类 HM 到 CHM 和 PHM，并将其与水性非摩尔流产区分开来。基因分型分析主要针对受孕的正规固定石蜡嵌入（FFPE）产物的DNA和组织，其质量低于最佳质量，因此可能导致错误的结论。本文提供了FFPE摩尔组织的多路基因分型和流细胞学分析的详细方案，以及这些方法结果的解释、故障排除和与形态评估的集成，p57KIP2免疫组织化学，荧光原位杂交（FISH）达到正确可靠的诊断。在这里，作者分享了过去10年从大约400种受孕产物的分析中学到的方法和教训。
Introduction
水合体摩尔（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是胚胎发育异常、营养素增殖和胆汁性分裂（CV）的水分退化。从历史上看，HM过去分为两种类型，即完全HM（CHM）和部分HM（PHM），仅基于形态学评估1。然而，已经表明，仅仅形态学评估不足以将HM分类为两个亚型（CHM和PHM），并将其与非摩尔流产2、3、4区分开来。
由于 CHM 和 PHM 具有不同的恶性肿瘤倾向，因此必须准确确定 HM 的基因性类型，以便为患者提供适当的随访和管理。因此，在过去几十年中，为了确定父母对摩尔组织的贡献，并得出正确的HM分类，已经制定并发展了几种方法。其中包括核糖核代分析、染色体带状多态性、人类白细胞抗原（HLA）血清类型、限制片段长度多态性、可变串联重复数、微卫星基因分型、流动细胞学和p57KIP2免疫性化学。这允许根据父母对其基因组的贡献对HM概念进行准确的细分，如下所示：CHM，这是双倍体和共生单精子或双倍体和共基因破坏，和PHM，这是三倍体，在99%和在1%的病例中，单精子5，6，7，8。此外，在过去二十年中出现了另一种基因性类型的HM，即双亲双亲。后者大多反复发生，可能影响一个家庭成员（单例病例）或至少两个家庭成员（家庭案件）。这些双亲摩尔主要是由NLRP7或KHDC3L在患者9，10，11，12的隐性突变引起的。在NLRP7中隐性突变的患者中双亲HM可以通过形态分析诊断为CHM或PHM，这似乎与患者13、14突变的严重程度有关。除了根据基因型对HM进行分类外，采用和使用几种基因分型方法，使各种摩尔实体与非摩尔流产（如非倍体双亲概念和其他类型的概念5，15。这种概念可能有一些营养性增殖和异常的绒布形态，在一定程度上模仿HM的一些形态特征。
本文的目的是为形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织的多路基因分型和流式细胞学提供详细的方案，并全面分析这些方法的结果及其与其他方法的集成。对摩尔组织的正确和结论性诊断。
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Protocol
这项研究得到了麦吉尔机构审查委员会的批准。所有患者提供书面同意参加研究，并让他们的FFPE产品受孕（POCs）从不同的病理部门检索。
注：虽然通过流式细胞测定方法有几种方法进行基因分型和策略测定，但此处提供的协议描述了一种分析方法，每种方法都使用一个平台。
1. 基因分型
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选择最佳 FFPE 块
- 对于每个受孕的FFPE产物（POC），制备4μm厚的血氧林和eosin（H&E）染色部分，如第1.2节和1.3节所述，每个可用块一个，用于显微镜形态学评估。
- 使用 H&E 幻灯片和光学显微镜，选择具有最大数量的胆汁绒 （CV） 的 FFPE 块，如果可能，选择具有 CV 与母体组织分离且不与母体组织混合的块块。
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切片
- 将所选方块放在冰上 15 分钟，以方便切片。
- 调整微图，切割4μm厚的部分，用于微观形态评估，10μm厚用于DNA提取。
- 将冷块放入微体中，从每个块中切出一个截面用于 H&E 染色，从所选块中切出 10-30 个截面，具体取决于块中的 CV 量，用于提取 DNA。
注：对于充满CV的块，10个截面足以提取DNA。如果只有约10%的块含有CV，而其余的是母体组织，那么需要20-30个切片，以确保足够的DNA量。 - 使用钳子，将每个部分转移到45°C的水浴。用带正电荷的幻灯片（材料表）从水浴中拾起部分，该幻灯片以前用铅笔标有样品识别号。
- 将包含各部分的幻灯片置于 65°C 的烤箱中，以使这些部分粘附在幻灯片上。将 H&E 的幻灯片保存在烤箱中 25 分钟，将幻灯片保存在烤箱中，以便提取 DNA 20 分钟。
注：潜伏时间越短，组织对幻灯片的粘附度就小一些，因此有利于切除母体组织。
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H&E 染色
- 让幻灯片冷却到室温（10 分钟）。
- 试剂制备
- 准备 Eosin Y 工作解决方案 （0.25%）如表1。混合良好，在室温下储存。
- 通过在水中稀释血氧林 5x 的库存溶液（即将 80 mL 的水与 20 ml 的血氧林混合）来制备工作血氧林溶液。
注：将血氧林的原料包装在箔中储存。
- 根据表2，在烟罩下用正确的试剂制备染色罐。
- 根据表2，通过将幻灯片浸入适当的染色罐中，在正确的时间段内执行H&E染色。
- 安装 4 μm 部分，以便使用安装介质进行形态分析，用玻璃盖玻片安装盖玻片（材料表）。
注：基因分型的 10 μm 部分不应盖上。 - 将 10 μm 部分留在烟罩下至少 3 小时，以便散去有毒的二甲苯气味。
警告：所有染色步骤需要在烟罩下执行。二甲苯产品需要时刻保存在罩下，因为二甲苯的气味是有毒的。此外，二甲苯和二甲苯需要丢弃在特殊容器中。一旦这些容器装满，它们需要根据实验室的安全组织的建议被丢弃。
| 试剂 | 数量 |
| Eosin Y 库存溶液 （1%） | 250 mL |
| 80%乙醇 | 750 mL |
| 冰川醋酸（浓缩） | 5 mL |
表1：Eosin Y工作溶液（0.25%）制备。
| 使用的试剂（每箱 100 mL） | 时间 |
| 1） 二甲苯 | 5分钟 |
| 2） 二甲苯 | 5分钟 |
| 3） 100%乙醇 | 2分钟 |
| 4） 95%乙醇 | 2分钟 |
| 5） 70%乙醇 | 2分钟 |
| 6） 50% 乙醇 | 2分钟 |
| 7） 蒸馏水 | 5分钟 |
| 8） 血氧林 | 4分钟 |
| 9） 蒸馏水 | 5分钟 |
| 10） 欧辛 | 1 分钟 |
| 11） 95% 乙醇 | 5分钟 |
| 12） 100%乙醇 | 5分钟 |
| 13） 二甲苯 | 5分钟 |
| 14） 二甲苯 | 5分钟 |
表2：H&E染色协议的试剂和持续时间。
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CV 隔离
- 在光学立体显微镜下，使用钳子和小片水湿纸擦拭（材料表）刮掉H&E染色10μm厚的部分不需要的母体组织。
注：最终目标是在幻灯片上保留除CV或胎膜（当存在时）的任何东西，从而去除所有其他组织。此步骤可能需要大量的时间和耐心，具体取决于块，因为它需要一丝不苟地注意细节。 - 让第二个人在清洁后仔细检查幻灯片，以确保它们没有母体组织。
- 拍摄清洁幻灯片或记录以下照片以帮助进行数据解释：1） 组织是否难以清洁、出血或非常清洁，2） 使用的部分数量，以及 3） 清洁组织的大致数量。
注：图 1提供了易于清洁的幻灯片示例。对于包含大约此数量 CV 的块，10 个切片足以提取 DNA。图 2中的幻灯片中很少有与母体组织混合的 CV，因此清洁非常困难且耗时。对于含有大约此数量CV的块，DNA提取需要30个截面。 - 使用小湿巾收集 CV。使用钳子，从湿润的纸巾中撕下一小块，并用它来收集简历。
- 将带有附件的 CV 的纸片放入标有 1.5 mL 的管子中。
- 尽量减少此步骤中使用的纸巾量，因为过多的纸巾可能会堵塞 DNA 提取柱，从而减少最终收集的 DNA 数量。平均而言，每个样品使用少于七小块纸擦拭。如果由于存在大量 CV 而无法这样做，则将样品分成两个管，以方便提取。
- 在光学立体显微镜下，使用钳子和小片水湿纸擦拭（材料表）刮掉H&E染色10μm厚的部分不需要的母体组织。
图 1：用于基因分型的代表性幻灯片。顶部：需要"清洁"才能摆脱母体组织的幻灯片。底部：在清理后显示的相同幻灯片，现在只包含用于提取 DNA 的 CV。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：用于基因分型的代表性幻灯片。顶部：需要"清洁"才能摆脱母体组织的幻灯片。底部：在清理后显示的相同幻灯片，现在只包含用于提取 DNA 的 CV。请点击此处查看此图的较大版本。
- 遵循从FFPE试剂盒（材料表）提取DNA的协议，执行DNA提取。
注：某些试剂盒建议使用 15~20 μL 的洗脱缓冲液进行最终洗脱。根据经验，使用15μL洗脱缓冲液的洗脱对大多数样品都有效。根据需要，可以从库存DNA中制备稀释液。
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DNA定量
- 使用实验室分光光度计设备，加载 1 μL DNA 并在 260 nm 处测量吸光度进行定量。
- 在 2% 的甘蔗凝胶上加载 1 μL DNA，并在 80–100 V 电压下运行凝胶电泳，用于定性评估。
- 根据步骤 1.6.1 和 1.6.2 的结果，选择用于多路复用短串联重复 （STR） 聚合酶链反应 （PCR） 扩增的 DNA 体积。在随后的PCR扩增中，使用至少1000纳克的DNA。
注：图3展示了凝胶的代表性示例以及DNA的浓度（基于分光光度计结果），以及推荐用于以下多路STR PCR的DNA溶液的体积。
图3：DNA定量代表凝胶。包括使用分光光度计测量的每个DNA的浓度，以及用于多倍PCR的数量。请点击此处查看此图的较大版本。
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PCR 扩增
- 使用多路STR系统（材料表）执行荧光微卫星基因分型。
- 使用多路STR系统（材料表）使用图4所示的PCR条件进行PCR扩增。
注：此多路STR系统使用以下引体：D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、五角E、FGA、TPOX、D8S179、vWA、阿美美根、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818和五角D。
图 4：多路复用 STR 系统的 PCR 循环条件。请点击此处查看此图的较大版本。
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通过毛细管电泳解决PCR产物。
- 在多路复用系统内部标准通道的 0.5 μL 和 9.5 μL 高度脱离子化形式酰胺（材料表）中，将每个放大样品的 1 μL 悬浮。
- 使用仪器和多路复用系统的染料集使用适当的分离矩阵（材料表）通过毛细管电泳仪（材料表）运行样品。
- 数据分析
- 使用 DNA 片段分析软件分析数据，并将 POC 等位位子与父等位子进行比较，以确定其来源。
- 设置大小标准。
注：这允许软件识别多路复用 STR 系统中使用的梯形图，并根据梯体将基对分配给放大器。以下步骤适用于一个特定的软件（材料表），但也可能有助于设置其他类型的软件。- 打开软件。单击"开始新项目"，然后单击"新大小标准"。
- 为大小标准指定名称（例如，ABI=600）。
- 在名为"输入新大小标准定义"的框中： 输入以下内容： 60， 80， 100， 120， 140， 160， 180， 200， 225， 250， 275， 300， 325， 350， 375， 400， 425， 450， 475， 500， 550， 600。然后单击"添加大小"。
注： 输入的数字将显示在右侧的框下，该框名为"当前大小标准定义"（参见图 5）。 - 单击"保存"。
- 要导入和分析文件，请单击"添加文件"，然后选择要分析的 fsa 文件。单击"添加选定文件"，然后单击"确定"。然后按照以下步骤操作：
- 找到"大小标准"列并选择 ABI_600（或为大小标准指定的名称）。
- 在"分析方法"下，单击"大小调整默认 - NPP"，然后单击绿色"分析"按钮。
- 该文件现已准备就绪，可供查看。调整查看选项以根据需要查看数据。
- 故障排除 - 分析方法
注：软件有时可能无法识别峰值并正确对齐它们。当峰值过低或过高时，就会发生这种情况。以下两种分析方法可以纠正此问题，应在重新测试样本之前进行试验。- 用于高峰的分析方法 1：
- 单击"新分析方法"并将其命名为"峰值"（或根据个人偏好使用的另一个名称）。
- 单击"范围"，然后单击"部分范围"以进行分析和调整大小。然后键入起始点和起始大小 100。
- 对于止损点，输入 10，000。对于止损大小，输入 1000。
- 然后点击最小峰值高度并更改数字，使颜色的峰值阈值如下：蓝色：50;绿色： 50;黄色： 20;红色： 100;橙色：5000。
- 保存新的分析方法。
- 低峰值分析方法 2：
- 单击"新分析方法"并将其命名为"低峰值"（或根据个人偏好使用的另一个名称）。
- 单击"范围"，然后单击"部分范围"以进行分析和调整大小。然后键入起始点和起始大小 100。
- 对于止损点，输入 10，000。对于止损大小，输入 1000。
- 然后单击质量标志并更改通过范围，使其读取从 0.5 到 1。更改低质量范围，使其读取从0.0 到 0.0。将假设线性更改为以下内容：从（bp） 100.0 更改为 （bp） 800.0。
- 保存新的分析方法。
注：现在可以通过在"分析方法"下选择"低峰值"或"峰值"，然后单击绿色"分析"按钮来重新分析文件。
- 用于高峰的分析方法 1：
图 5：显示大小标准编辑器的屏幕截图。请点击此处查看此图的较大版本。
2. 流动细胞测定
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选择理想的 FFPE 模块
- 使用 H&E 幻灯片和光学显微镜，选择由 CV 组成的大约 50-70% 组织的 FFPE 块。
注：图6是流动细胞学分析的适当块的代表性示例，因为它由大约50%的CV（部分的右半部分）和50%的母体组织（左半部分）组成。母体组织的存在是重要的，因为它们是双倍体峰的内部控制。 - 对于没有理想数量的 CV 的块，在执行切片时为 CV 进行丰富。为此，请根据相应的 H&E 幻灯片，确定新切割部分的哪一侧包含更多 CV。在此基础上，使用刀片来切断另一半，需要丢弃，以丰富CV。
注：图 7显示了一个块，该模块没有足够的 CV 进行流量细胞测定分析。对于此类块，需要剪切部分，以便丢弃包含较少 CV 的一半，以便增加与母体组织有关 CV 的数量，如图所示。请务必剪切更多部分，以补偿丢弃的部分。
- 使用 H&E 幻灯片和光学显微镜，选择由 CV 组成的大约 50-70% 组织的 FFPE 块。
图 6：H&E 部分表示 POC 块，是流动细胞学的理想选择。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：H&E部分表示流式细胞测量的一个更困难的块。此具有代表性的 H&E 部分显示，仅应使用本节的下半部分进行流式细胞测定分析，目的是丰富 CV。标有"CV"的概述区域主要由简历组成。请点击此处查看此图的较大版本。
- 切片
- 将方块留在冰上15分钟，以方便切片。
- 使用最佳 FFPE 块，使用微缩体切割四个厚度为 50 μm（或两个 100 μm 厚的部分）的截面。
注：对于流式细胞测定，最好有较厚的部分。 - 在缺乏理想的FFPE块的情况下，为了保持CV与母组织的比例。例如，如果只有30%的块由CV组成，而其余的有母体组织，则删除至少一半的包含母体的部分，并使用更多的部分进行补偿（见图7）。
- 将部分置于标有 15 mL 的管中。
注：请务必在标签上贴上胶带，因为下一步中使用的有机试剂可以溶解和去除墨水。
- FFPE 组织的流式细胞测定方案
- 脱蜡和补液
- 在烟罩下进行以下的抽油 （表 3）.
- 按照表 3 中提供的顺序，在 15 mL 管中填充 6 mL 的相应试剂，将部分留在试剂中，持续一段时间，然后使用真空吸液器和玻璃巴斯德移液器取出试剂。
- 在每一步之间，先将巴斯德移液器浸入70%乙醇中，然后浸入蒸馏水中，然后进入下一步。
- 小心不要与试剂一起取出组织。将 15 mL 管倾斜至 60 度角，以方便吸吸液体试剂，而无需绘制组织。
警告：丢弃的液体含有二甲苯，应弃置在二甲苯废物容器中。
- 解决方案准备
- 在1L双蒸馏水中溶解2克柠檬酸，制备柠檬酸盐溶液。将 pH.储存在4°C。
- 在 2 mL 中溶解 0.01 克的胰蛋白素，每千 NaCl 9 个部件，pH 1.64，制备胰蛋白素溶液。这是一个示例。
警告：胰蛋白蛋白是有毒的，很容易分散和成为空气中。在以粉末形式处理 pepsin 时，请戴上口罩，使用后擦拭所有工作区。 - 碘化钠（PI）-核糖酸酶一种溶液制备。
- 将 50 μL 的 PI 与 450 μL 的 PBS 混合（稀释 10 倍）。
- 在混合物中加入50 μL的核糖酸酶A（1毫克/升L）。始终保持用铝箔包裹。
- 消化和染色
- 将4°C酸盐溶液加入15 mL管中，然后放入80°C水浴2小时。
- 让溶液冷却至室温（15分钟）。取出酸盐溶液。
- 加入 6 mL 的 1x PBS、涡流，等待 1⁄2 分钟，让组织稳定到底部。使用真空吸液器和玻璃巴斯德移液器取出 1x PBS。
- 加入1mL的胰蛋白酶溶液（预热至37°C），并放入37°C干浴中30分钟，每10分钟Vortex。
- 加入 6 mL 的 1x PBS、涡流，等待 1⁄2 分钟，让组织稳定到底部。使用真空吸液器和玻璃巴斯德移液器取出 1x PBS。
- 加入550 μL的PI-核糖酸酶A溶液，并将样品放入37°C干浴中30分钟。
注：此时，样品可以包裹在铝箔中，并在4°C下过夜，直到第二天早上。 - 通过 48 μm 过滤网过滤溶液。将滤液收集在聚苯乙烯圆底管中，可与流式细胞计一起使用。使用钳子在管的顶部放置一个 5 厘米乘 5 厘米的过滤网，使液体可以通过网管移液并进入管中。
注：样品现在已准备好使用流量细胞仪运行。将它们包裹在铝箔中，直到它们准备好运行。
- 在组织的流式细胞测量平台技术人员的帮助下，使用流式细胞计运行样品。
注：PE 通道用于检测 PI 染色 DNA，在采集过程中，流速应设置为"慢"。确保选择电压，使双倍体峰值沿 PE-A x 轴大致为 200，以便进行分析和解释。目标是记录每个样本至少 20，000 个事件。
- 脱蜡和补液
| 使用的试剂（每剂 6 mL） | 时间 |
| 1） 二甲苯 | 2 x 10 分钟 |
| 2） 100%乙醇 | 2 x 10 分钟 |
| 3） 95%乙醇 | 10分钟 |
| 4） 70%乙醇 | 10分钟 |
| 5） 50% 乙醇 | 10分钟 |
| 6） 蒸馏水 | 2 x 10 分钟 |
表3：脱蜡和补液的试剂和持续时间。
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流式细胞分析
- 使用流式细胞测定分析软件（材料表）分析数据。
注：以下步骤适用于一个特定的软件（材料表），但也可能有助于设置其他类型的软件。- 在流式细胞仪上运行样本后，下载 FCS 2.0 文件进行分析。
- 打开流式细胞测定分析软件，点击文件 |新文档.
- 单击直方图图标 （
），然后拖动指针以制作矩形。 - 浏览 FCS 文件，然后单击"打开"。沿着 x 轴，单击FCS-A，然后选择PE-A。
- 单击"点图"图标
（ ），然后拖动指针以在直方图图下创建另一个矩形。然后浏览为直方图选择的相同 FCS 文件。 - 将点图的 x 轴更改为PE-A，将 y 轴更改为PE-W。
注：图 8A演示了此时绘图的外观。 - 单击"区域"图标
（ ）， 并在点图上绘制一个框，该框在双倍数峰之前开始（图 8B中 x 轴上约 100 个），并在 x 轴上结束约 700，如图8中的点图所示B. .
注：图 8中的二倍体峰值在 x 轴上大约为 200。这是任意选择的，因为样品是通过流式细胞仪记录的，只是为了便于分析和解释结果。 - 点击绘图 |编辑区域/门，然后在"策略"下 G0 单元格旁边的单元格中键入R0。 然后单击"关闭"。
- 单击直方图上的任意位置，然后在绘图 |格式绘图/叠加。在"门"下，选择G0 = R0，然后单击"确定"。
注：这是门控步骤，允许人们更好地可视化策略峰。直方图现在应类似于图 8B中的直方图。可以玩一下创建的门（通过移动步骤 2.4.1.7 中绘制的框），以便专注于点图的特定区域。 - 要标记绘图，请单击"文本区域"图标（
），然后拖动指针在文档顶部创建一个框，然后键入以下信息：患者 ID、POC ID 和使用的数据块（因为一个 POC 可能有多个块），块上存在的 CV 百分比、用于运行样本的电压以及日期。
- 使用流式细胞测定分析软件（材料表）分析数据。
），然后拖动指针以制作矩形。
（ ），然后拖动指针以在直方图图下创建另一个矩形。然后浏览为直方图选择的相同 FCS 文件。
（ ）， 并在点图上绘制一个框，该框在双倍数峰之前开始（图 8B中 x 轴上约 100 个），并在 x 轴上结束约 700，如图8中的点图所示B. .
），然后拖动指针在文档顶部创建一个框，然后键入以下信息：患者 ID、POC ID 和使用的数据块（因为一个 POC 可能有多个块），块上存在的 CV 百分比、用于运行样本的电压以及日期。
图 8：显示直方图和已清除 （A） 和门控 （B） 的代表性样本的点图的屏幕截图。请点击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
摩尔组织的复杂性和它们可能具有各种基因型的事实需要严格的分析和使用几种方法，如形态评估、p57免疫组织化学、微卫星基因分型、流式细胞测定和FISH。例如，一名患者（1790）被转诊了两个PHM，仅通过POCs的微阵列分析发现是三元组。因此，患者被诊断为复发性PHM。微型卫星基因分型她的两个"PHM"以及病人的DNA和她的伴侣发现，虽然病人的第一摩尔是三毛虫分虫（图9A），但她的第二个"PHM"有一个三倍的神基因型（图9 B），因此不是PHM，而是非摩尔流产。
图 9 A中的第一个标记（黑色）显示了 POC 中的两个峰值。第一个高峰来自母亲，因为只有母亲有这种大小的高峰。遵循相同的推理，第二个峰值来自父亲，因为他共享相同的等位基因。请注意，第二个峰值比第一个峰值高得多，表明该峰值中可能有两个剂量的相同父位基因。母体污染，稍后将更详细地解释，这是非常小的这个POC，因为POC显示一个非常小的峰值在第二个母体等位基因的位置。
图 9 A中的第二个标记（蓝色）显示了 POC 中的三个峰值。其中两个山峰来自父亲，一个来自母亲。因此，从这个标记中可以再次发现，在POC中存在三个等位数，两个来自父亲，一个来自母亲。图 9A中的第三个和第四个标记与第一个标记相似，还显示了来自父亲的两个等位体和一个来自母亲的等位体。
由于所有四个标记始终显示三个等位位子（通过剂量或存在三个不同大小的等位子），两个来自父亲，一个来自母亲，人们可以得出结论，这个POC是三分位体，并确认PHM的诊断。
图 9B中的所有四个标记再次显示三个等位点：第一个标记显示来自母亲的第一个峰值中的两个剂量，在第二个峰值中显示一个来自父亲的剂量。第二个和第四个标记显示三个不同的峰（即三个不同的等位数），其中两个来自母亲。第三个标记显示来自父亲的第一个峰值中的一个剂量和来自母亲的第二个峰值的两个剂量。因此，这POC是三联体在起源，因为两组染色体来自母亲，一组来自父亲。因此，这是一种非摩尔流产。
图9：患者1790的代表性基因分型结果。（A） 选择患者第一个受孕基因分型结果，显示三叶虫分型基因型。（B） 从患者的第二个受孕中选择基因分型结果，显示三叶虫基因型。x 轴位于基对中;为了简单起见，省略了标签和基双大小。y 轴表示峰值高度，为了简单起见，图形中同样省略了 y 轴。请点击此处查看此图的较大版本。
该患者最初被误诊为两个 PHM，并担心增加的风险更多的摩尔，而她有一个单一的 PHM.此案例强调了 SNP 微阵列仅在 POC 上的局限性。SNP微阵列是一种强大的方法，是检测任何染色体（三联体、单体体或非双发基因型）的异常的最佳方法;然而，当单独在POC上执行而不分析父母的DNA时，不能确定三叶虫的起源。有关基因型分析和解释的进一步解释，请参阅 Murphy 等人16的研究。
图10A所示的代表性结果为三倍概念。x 轴的值表示核 DNA 含量。例如，200 是提供给含有一定量核 DNA 含量的细胞的任意数字。因此，400的峰值表示含有核DNA含量的细胞量比200的峰值高一倍。300 左右的小峰表示核DNA含量在 200 到 400 峰值之间，因此是三元峰。请注意，二倍体概念（图10B）在300值时不包含任何峰值。
在某些情况下，三倍峰是非常微妙的 （图 10C）。每当注意到几乎明显的三元峰时，首先考虑用于流式细胞测定分析的部分中的 CV 量非常重要。如果部分的CV低于20%，那么它很可能是一个真正的三重奏，因为它预计将是一个非常低的峰值。如果所采集的部分有大量的CV，POC就会怀疑马赛克主义，因为存在另一个双倍体细胞群。这可以通过重新审查基因分型结果来检查，看看它们是否适合一个完美的三重体切除术，或者也可以由FISH用X、Y和18条染色体的探针进行确认。此外，使用本文中描述的软件，可以设置特定的大门，如第 2.4.1 节所述，允许用户专注于特定区域，以丰富三元细胞（如果它们确实存在）。
图10：代表性流式细胞学结果，证明在（A）和（C）中的三倍体概念，以及（B）中的二倍体概念。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
HM是具有异质病因的异常人类妊娠，具有不同的组织学和基因类型，这使得其准确的分类和诊断具有挑战性。组织形态学评估往往被证明是不准确的，因此本身是不可靠的，将HM分类为CHM和PHM，并将其与非摩尔流产区分开来。因此，对HM的准确诊断需要使用其他方法，如多路微卫星DNA基因分型、流式细胞测定策略分析、FISH的多向分析以及p57KIP2免疫血症分析。这些方法各有其局限性和优势。
多路基因分型和流式细胞仪的局限性和优点
在使用 FFPE 组织时，母体污染是最常见的问题之一，可能导致误诊，从而突出将产妇与 POC 组织分离的重要性。重要的是要确定母体污染，以便了解基因分型峰的预期，并帮助解释它们。如果污染程度过大，妨碍对结果的可靠解释，则重复DNA分离和提取，在去除所有可能的母体组织时格外小心。在组织形态不明确的地区，最好清除这些区域，以尽量减少产妇污染的可能性。除了成本较低之外，该协议中描述的方法的第一个优点是，从幻灯片中取出母体组织，而其他方法包括收集 POC 组织（通过覆盖在暴露于空气中时聚合的溶液）和解除组织），而不去除母体组织。因此，这里描述的方法允许人们重新审视剩余的POC组织，必要时重新清洁它们，就像通常的情况一样，然后从它们那里收集和提取DNA。第二个优点是，我们清洁在发现H&E染色部分的纸巾，这极大地方便了母体组织的去除，而不是使用未染色的部分和盖贴地图幻灯片。然而，额外的染色可能进一步降解DNA，这可以通过添加更多部分来弥补。
父母DNA的可得性是另一个挑战。父母双方的存在大大有助于对基因分型结果进行分析和解释。然而，不幸的是，父亲的DNA往往不可用，这有时可能使分析复杂化，特别是在POC DNA质量由于事先固定或长期储存而较差的情况下（工作时更频繁与经常性HM）。此外，母体血液可能并不总是可用于DNA提取。在这种情况下，产妇DNA可以从FFPE块中存在的母体子宫内膜组织中提取，如前所述16。此外，使用辅助生殖技术产生的摩尔组织特征可能使微卫星基因型分析复杂化，因为在大多数情况下，通常无法从捐赠者（男性或女性）获得DNA。
最后，在峰值高度方面，较大的峰往往较短，这是另一个可能的混淆来源，特别是当需要使用峰值高度来确定单个峰值中是否存在两个剂量或一个剂量时。克服这种情况的一个方法是始终记住，由于 FFPE 组织 DNA 的降解性质，大等位基因大小（碱基对数）的峰值往往较短，这使得用于放大较大等位基因的 DNA较少。此外，较短的PCR片段扩增时间比较大的片段要短，DNA的指数放大导致较大等位子的量减少。
流式细胞学的主要缺点是，有时可能会错过三叶虫的概念，这可能是由于块中CV量不足。然而，三叶虫峰的存在是三叶虫的决定性迹象。请注意，此方法不够敏感，无法检测使用此协议的三联体、四倍体概念或其他方案。四倍体概念不能被该协议检测，因为四倍体峰对应于细胞周期的G2相中相同的二倍体细胞峰值。
了解这些限制和挑战有助于减少错误。因此，用不同的方法分析同一组织，比较结果，并确保它们彼此一致，这一点很重要，有时也是必要的。如果结果不是，需要重新考虑结果，需要重复分析。对于显示结果冲突的几个案例，只需重复实验并适当注意避免原始问题即可解决差异。在其他情况下，通过执行其他方法（如在组织部分的 FISH）或使用适当的标记执行额外的单体基因分型来解决差异。
产妇污染的鉴定
在识别 POC DNA 与母体 DNA 的污染方面，除了传输到 POC 的母体等位基因外，POC 中所有位点的所有母体等位基因的存在都会反映或识别污染程度。
在图11A中，源自母体DNA污染的峰值被贴上"c"的标签。请注意，每个标有"c"的峰值在母形中也存在，我们看到所有三个标记中的这些"c"峰。请注意，对于第二个标记（蓝色），以"c"表示的母体污染峰值高于第一个标记处的每个"c"峰值，因为母体是第二个标记的同源值;因此，此标记的污染物高度加倍。在此 POC 中，没有母性派生的峰。换句话说，这个POC没有从母亲那里继承任何等位基因。每个标记上只有一个真正的峰值，这个峰值在母亲中不存在。因此，我们知道，真正的高峰一定来自父亲。通过来自岩型或流式细胞学分析的多分信息，可以得出该POC在起源和二倍体中既是遗传的，也是二倍体。
此外，图 11A中的这三个标记表明，每个标记始终只有一个实际峰值。这里只说明了三个标记，但是，多路复用套件通常附带更多的标记，这些标记也会显示相同的模式。由于此 POC 是二倍体，每个峰值必须有两个剂量。有了这些信息，我们可以得出结论，这个POC是共基因单体，是同源在每个标记。
图 11B表示双亲 POC。穿过第一个标记的第一个峰值（绿色）的小黑条表示此实际峰值中存在的估计污染量。"R"表示此峰值的真实部分来自 POC DNA;"c"代表这个峰的污染物部分来自母体DNA。如何识别污染程度？在这种情况下，当一个标记在母亲中是杂音时，有可能，因为一个产妇等位子在POC中不存在。例如，第一个标记中标有"c"的小峰表示，这是预期其他母性继承峰的污染程度。因此，由于少量增加的污染，所有来自母体的POC峰都略高于父系继承的峰值。对于图11B中的第三个标记（黑色），污染水平预计将是通常量的两倍（因为母亲是这个特定标记的同源体），因此可以推断，在第一个峰值中只有一个剂量在POC中。
图 11C显示了三倍的去孔波C。第一个标记（绿色）在 POC 中显示三个峰值。由于这三个峰值具有相似的高度，因此可以得出此 POC 可能是三元位的可能性。请注意，此标记中的第三个峰值比第一个峰值短。这是预料之中的，因为作为一般趋势，较大的峰值往往较短。第二个峰值略高于第一个峰值，这可以由少量的母体污染来解释，如柱和"c"所示。此外，这三个山峰中的两个不在母亲中，因此一定来自父亲。到目前为止，该标记表明POC可以是三联体（或三体），并且额外的染色体集的起源是父系的。它也表明，这是一个不孕的受孕概念，因为POC继承了两个不同的等位基因从父亲。
图 11C中的第二个标记（蓝色）只有两个峰值。在考虑污染程度后，第二个峰值似乎高于第一个峰值，尽管较大的峰值呈较小趋势（在分析过程中必须始终牢记这一趋势）。因此，很可能在那个大峰中有两个剂量。这还支持的事实，即第一个标记是指示三叶。
最后，图 11C中的第三个标记（黑色）显示了三个峰值，再次指示三峰。由于多路复用试剂盒中的大多数标记来自不同的染色体，因此在观察多个不同标记的三个等位位位的相同趋势后，可以自信地得出结论，即 POC 是三倍体。另请注意，从这个标记，三个山峰中的两个来自父亲，确认分裂的起源。
图11：说明母体污染影响的基因分型结果。顶部面板显示属于 POC 的等位子，底部面板显示属于母亲的等位参数。在 （A） 中，POC 是共和单体，污染程度由箭头和字母"c"突出显示。在 （B） 中，POC 是双亲双亲，污染程度由字母"c"突出显示。在 （C） 中，POC 是三元组，污染程度由字母"c"突出显示。小黑条显示有多少峰值高度来自母体污染，因此在比较峰值高度时应考虑。x 轴位于基对中;为了简单起见，省略了标签和基双大小。y 轴表示峰值高度，为了简单起见，图形中同样省略了 y 轴。请点击此处查看此图的较大版本。
具有挑战性的案例示例
对于许多情况，只有同时进行所有三个评估（即流量、p57KIP2和多路基因分型），才能得出结论。例如，一个病例（808例）被称为非摩尔流产。组织病理学评估导致怀疑摩尔概念和基因分型分析的POC揭示了一个标记，清楚地显示三个峰值（两个来自父亲，一个来自母亲）。p57KIP2结果没有定论。流式细胞学分析揭示了一个小的三倍虫峰，这一点通过FISH分析得到证实，这也排除了另一个双倍体细胞群的存在。经FISH确认，可以断定POC确实是一种三分位分裂鼠。
另一例（1192例）也称为非摩尔流产。此 POC 的 CV 与母体组织混合在一起，并且具有很高的坏死性，使得清洁过程极具挑战性。因此，第一次基因分型分析表明，孕产妇污染程度很高，因此，在POC中可以看到每个产妇等位基因（这是可能污染的良好迹象）。此外，p57KIP2不幸没有定论，很可能是由于组织的坏死性质，也许是因为延迟固定。然而，流式细胞学的结果表明三叶虫，这也得到了FISH的证实。重新提取DNA的目的是降低污染水平，去除形态不明的组织。分析新的基因分型结果，虽然考虑到母体污染的可能存在，使我们能够得出结论，POC是一个三联体脱血XY PHM。
表 4概述了用于分析的典型方法。建议对所有怀疑HM的组织和至少一种基因分型方法使用形态评估和p57KIP2免疫组织化学。在基因分型方法中，信息最丰富的是多路DNA基因分型。当不同方法之间的结果不一致或某些结果不确定时，需要使用其他基因分型方法。该表演示了每种可能的 HM 类型的预期协调结果，以及罕见的异常和解决这些问题的建议。
表 4：典型的分析顺序、预期结果和罕见的异常以及解决这些问题的建议。P57KIP2免疫性化学旨在检测p57KIP2的表达，p57 KIP2是CDKN1C基因编码的蛋白质。这种基因在细胞生长体和妊娠期前三个月胎盘的绒带频闪中被父系地印记，并且仅从母体基因组表达。因此，它被用作辅助标记，以简单和廉价的方式检测在POC中的母体基因组的存在。建议对所有怀疑为HM的POCs进行p57KIP2免疫性化学，同时进行形态学评估。在作者的实验室中，使用了材料表中所示的p57KIP2抗体和平台，作者对结果的质量非常满意。缩写：IHC+免疫性化学;滴和 = 双倍体和遗传;滴比普 = 双亲;时间 = 染色体;MC = 流产;和TP = 营养器增殖。
据作者所知，本文首次为流式细胞仪以及FFPE POC组织的低成本、高质量多路微卫星DNA基因分型提供了详细的方案。还介绍了对结果的解释，以及其故障排除和与其他方法的集成，以得出 POC 和 HM 的准确结论和诊断。作者真诚地希望本文能够有助于研究人员试图理解这个复杂的实体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢索菲·帕特里亚尔和玛丽安·帕雷西分享了原始的流式细胞测定方案，以及Promega和Qiagen提供用品和试剂。这项工作得到了生殖研究和加拿大卫生研究所（MOP-130364）到R.S.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
