Summary
Hydatidiform modermærker er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier, der kan klassificeres efter deres morfologiske egenskaber og forældrenes bidrag til molære genomer. Her beskrives protokoller for multiplex-DNA-genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret molarvæv i detaljer sammen med resultaterne ' tolkning og integration.
Abstract
Hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved overdreven trofoblastiske proliferation og unormal fosterudvikling. Der er to typer af HM baseret på mikroskopisk morfologisk evaluering, komplet HM (CHM) og partiel HM (PHM). Disse kan opdeles yderligere på grundlag af forældrenes bidrag til molære genomer. En sådan karakterisering af HM, af morfologi og genotype analyser, er afgørende for patienthåndtering og for den grundlæggende forståelse af denne spændende patologi. Det er veldokumenteret, at morfologisk analyse af HM er underlagt bred interobserver variabilitet og er ikke tilstrækkelig i sig selv til præcist at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra hydropic ikke-molære aborter. Genotyping analyse udføres for det meste på DNA og væv fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) produkter af undfangelse, som har mindre end optimal kvalitet og kan derfor føre til forkerte konklusioner. I denne artikel gives der detaljerede protokoller for multiplex-genotypebestemmelse og flowcytometri-analyser af FFPE molarvæv sammen med fortolkningen af resultaterne af disse metoder, deres fejlfinding og integrationen med den morfologiske evaluering , P57KIP2 Immunhistokemi og fluorescens in situ-hybridisering (fisk) for at nå frem til en korrekt og robust diagnose. Her, forfatterne deler de metoder og erfaringer i de seneste 10 år fra analysen af ca. 400 produkter af undfangelse.
Introduction
En hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved unormal fosterudvikling, hyperproliferation af trophoblast, og hydropic degeneration af choriongonadotropin villi (CV). Historisk, HM plejede at være opdelt i to typer, komplet HM (CHM) og delvis HM (PHM) baseret kun på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist sig, at morfologisk evaluering alene ikke er tilstrækkelig til at klassificere HM i de to undertyper (chm og PHM) og skelne dem fra ikke-molære aborter2,3,4.
Da CHM og PHM har forskellige tilbøjeligheder til maligniteter, er det derfor vigtigt præcist at bestemme den genotypiske type HM for at give patienterne passende opfølgning og ledelse. Derfor er der i de seneste årtier blevet udviklet og udviklet flere metoder med henblik på at identificere forældrenes bidrag til molarvæv og opnå en korrekt klassificering af HM. Disse omfatter karyotype analyse, kromosom banding polymorfi, humant leukocytantigen (HLA) serologisk indtastning, begrænsning fragment længde polymorfi, varierende antal tandem gentagelser, microsatellite Geno Typing, flow cytometry, og P57 KIP2 immun histokemi. Dette har gjort det muligt nøjagtig underinddeling af HM forestillinger baseret på forældrenes bidrag til deres genomer, som følger: chm, som er diploide androgenetisk mono spermisk eller diploide androgen dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% af tilfældene5,6,7,8. Desuden er der en anden genotypisk type HM, der opstod i de sidste to årtier, som er diploide biparental. Sidstnævnte er for det meste tilbagevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simpleks tilfælde) eller mindst to familiemedlemmer (familiær tilfælde). Disse diploide biforældres modermærker er for det meste forårsaget af recessive mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterne9,10,11,12. Diploid biparental HM hos patienter med recessive mutationer i NLRP7 kan diagnosticeres som chm eller PHM ved morfologisk analyse, og dette synes at være forbundet med sværhedsgraden af mutationer i patienterne13,14. Ud over klassificeringen af HM i henhold til deres genotyper tillod indførelsen og brugen af flere genotypebestemmelse at skelne mellem de forskellige molære enheder fra ikke-molære aborter, såsom aneuploide diploide biforældres forestillinger og andre typer af forestillinger5,15. Sådanne forestillinger kan have nogle trofoblast spredning og unormal villøs morfologi, der efterligner, til en vis grad, nogle morfologiske træk af HM.
Formålet med denne artikel er at tilvejebringe detaljerede protokoller for multiplex genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv, og omfattende analyser af resultaterne af disse metoder og deres integration med andre metoder til korrekt og endegyldig diagnose af molære væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af McGill institutions revisions bestyrelse. Alle patienter gav skriftligt samtykke til at deltage i undersøgelsen og til at have deres FFPE produkter af undfangelse (POCs) hentet fra forskellige patologiske afdelinger.
Bemærk: Selv om der findes flere metoder til genotypebestemmelse og Ploidi bestemmelsen af flowcytometri, beskriver protokollerne her en analysemetode, der anvender én platform til hver.
1. genotypebestemmelse
-
Udvælgelse af den bedste FFPE blok
- For hvert FFPE produkt af undfangelse (POC), forberede 4 μm-tyk hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvede sektioner som beskrevet i punkt 1,2 og 1,3, en for hver tilgængelig blok, for morfologiske evaluering af mikroskopi.
- Brug af H & E slides og en lys mikroskop, skal du vælge FFPE blok, der har den største mængde choriongonadotropin villi (CV), og hvis det er muligt, blokken, der har CV adskilt fra, og ikke sammenblandes med, mødres væv.
-
Skæring
- Placer den valgte blok på is i 15 minutter for at lette sektions opdelingen.
- Juster mikrotomen for at skære sektioner, der er 4 μm tykke, til mikroskopisk morfologisk evaluering og 10 μm tyk til DNA-ekstraktion.
- Placer den kolde blok i mikrotomen og skær en sektion fra hver blok for H & E farvning og 10 − 30 sektioner fra den valgte blok, afhængigt af mængden af CV i blokken, til DNA-ekstraktion.
Bemærk: For blokke, der er fulde af CV, er 10 sektioner tilstrækkelige til DNA-ekstraktion. Hvis kun ca. 10% af blokken indeholder CV, mens resten er mødrevæv, er der behov for 20 − 30 sektioner for at sikre tilstrækkelige mængder DNA. - Brug pincet, Overfør hver sektion til et 45 °C vandbad. Afhente afsnittet fra vandbad med en positivt ladet slide (tabel over materialer), der tidligere er mærket med prøve identifikationsnummeret ved hjælp af en blyant.
- Placer de slides, der indeholder sektionerne i en ovn, ved 65 °C, så afsnittene kan overholde diasene. Opbevar diasene til H & E i ovnen i 25 min. Opbevar gliderne til DNA-ekstraktion i ovnen i 20 minutter.
Bemærk: Den kortere inkubationstid gør vævene lidt mindre klædes til rutsjebanerne og letter derfor fjernelsen af mødres væv.
-
H & E farvning
- Lad diasene køle ned til stuetemperatur (10 min).
- Reagens præparat
- Forbered eosin Y-arbejdsopløsning (0,25%) pr. tabel 1. Bland godt og opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered arbejder hematoxylinlegemer opløsning ved fortynding stamopløsning af hematoxylinlegemer 5x i vand (dvs., bland 80 mL vand med 20 mL hematoxylinlegemer).
Bemærk: Wrap stamopløsning af hematoxylinlegemer i folie til opbevaring.
- Forbered farvnings krukker med de korrekte reagenser under en stinkhætte i henhold til tabel 2.
- Udfør H & E-farvning ved at nedsænke slidene i de relevante farvnings glas for den korrekte tidsperiode i henhold til tabel 2.
- Monter de 4 μm sektioner til morfologiske analyser med monterings medium og dækslip med glas dæksedler (tabel over materialer).
Bemærk: De 10 μm-sektioner til genotypebestemmelse bør ikke dækkes. - Efterlad de 10 μm sektioner under røghætten i mindst 3 timer, for at de giftige xylen lugte skal spredes.
Forsigtig: Alle farvnings trinene skal udføres under en stinkhætte. Xylen produkter skal hele tiden holdes underkøler hjelmen, fordi xylen lugt er giftige. Desuden skal xylen og hematoxylinlegemer kasseres i særlige beholdere. Når disse beholdere er fulde, skal de kasseres som anbefalet af laboratoriets sikkerhedsorganisation.
| Reagens | Mængde |
| Eosin Y stamopløsning (1%) | 250 mL |
| 80% ethanol | 750 mL |
| Iseddike (koncentreret) | 5 mL |
Tabel 1: eosin Y-arbejdsopløsning (0,25%) Under forberedelse.
| Anvendt reagens (100 mL pr. beholder) | Varighed |
| 1) xylen | 5 min |
| 2) xylen | 5 min |
| 3) 100% ethanol | 2 min |
| 4) 95% ethanol | 2 min |
| 5) 70% ethanol | 2 min |
| 6) 50% ethanol | 2 min |
| 7) destilleret vand | 5 min |
| 8) hematoxylin | 4 min |
| 9) destilleret vand | 5 min |
| 10) eosin | 1 min |
| 11) 95% ethanol | 5 min |
| 12) 100% ethanol | 5 min |
| 13) xylen | 5 min |
| 14) xylen | 5 min |
Tabel 2: reagenser og varigheder for H & E farvnings protokol.
-
Isolering af CV
- Under et let stereomicroskop skal du bruge pincet og små stykker vand fugtet papirservietter (tabel over materialer) til at skrabe uønskede mødrevæv fra H & E-farvede 10 μm tykke sektioner.
Bemærk: Det endelige mål er at holde intet andet end CV eller føtal membraner (når de er til stede) på slides og dermed fjerne alle andre væv. Dette trin kan have brug for en masse tid og tålmodighed, afhængigt af blokken, da det kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer. - Har en anden person dobbelt-kontrollere slides efter rengøringen for at sikre, at de er fri for mødres væv.
- Tag billeder af de rensede slides eller dokument følgende for at hjælpe med data fortolkning: 1) om vævet var vanskeligt at rengøre, hæmoragisk, eller meget ren, 2) antallet af anvendte sektioner, og 3) den omtrentlige mængde renset væv.
Bemærk: figur 1 giver et eksempel på et dias, der er let at rengøre. For en blok, der indeholder omtrent denne mængde CV, er 10 sektioner tilstrækkelige til DNA-ekstraktion. Diaset i figur 2 har meget få CV, der er sammenblandet med mødres væv, hvilket gør det meget vanskeligt og tidskrævende at rengøre. For en blok, der indeholder omtrent denne mængde CV, er der brug for 30 sektioner til DNA-ekstraktion. - Saml CV'ET ved hjælp af små fugtet stykker papirservietter. Brug pincet til at rive et lille stykke ud af de fugtet papirservietter og bruge det til at indsamle CV'ET.
- Anbring stykker papirservietter med deres vedlagte CV i et mærket 1,5 mL rør.
- Minimer mængden af papirservietter, der anvendes i dette trin, da alt for meget kan tilstoppe DNA-ekstraktions søjlen og dermed reducere den endelige mængde af indsamlet DNA. I gennemsnit har til formål at bruge mindre end syv små stykker papir klude pr prøve. Hvis dette ikke er muligt på grund af tilstedeværelsen af store mængder CV, opdeles prøven blandt to rør for at lette ekstraktionen.
- Under et let stereomicroskop skal du bruge pincet og små stykker vand fugtet papirservietter (tabel over materialer) til at skrabe uønskede mødrevæv fra H & E-farvede 10 μm tykke sektioner.
Figur 1: repræsentativt dias til genotypebestemmelse. Top: et dias, der skal "rengøres" for at blive fri for mødres væv. Nederst: det samme dias vist efter det er blevet rengjort og indeholder nu intet andet end CV til DNA-ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt dias til genotypebestemmelse. Top: et dias, der skal "rengøres" for at blive fri for mødres væv. Nederst: det samme dias vist efter det er blevet rengjort og indeholder nu intet andet end CV til DNA-ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Følg protokollen af DNA udvinding fra FFPE Kit (tabel over materialer) til at udføre DNA-ekstraktion.
Bemærk: Nogle kits anbefaler at bruge 15 − 20 μL elueringsbuffer til den endelige eluering. Fra erfaring, eluering med 15 μL elueringsbuffer fungerer godt for de fleste prøver. Fortyndinger kan tilberedes fra bestanden DNA efter behov.
-
DNA-kvantificering
- Brug en laboratorie spektrofotometriske anordning til at indlæse 1 μL DNA og måle absorbans ved 260 nm til kvantificering.
- Læg 1 μL DNA på en 2% agopstået gel og Kør gel elektroforese ved en spænding på 80 − 100 V for kvalitativ evaluering.
- På grundlag af resultaterne af trin 1.6.1 og 1.6.2 vælges den mængde DNA, der skal anvendes i multiplex-amplificeringen af den korte tandem gentagelse (STR) polymerase-kædereaktion (PCR). Formål at bruge et minimum på 1000 ng af DNA i PCR-amplificeringen, der følger.
Bemærk: figur 3 viser repræsentative eksempler på GELER sammen med DNA-koncentrationerne (baseret på spektrofotometrets resultater) og mængden af den DNA-opløsning, der anbefales til multiplex Str PCR, der følger efter.
Figur 3: repræsentativ gel til DNA-kvantificering. Koncentrationerne af hvert DNA, målt ved hjælp af et spektrofotometer, og de mængder, der anvendes til multiplex-PCR, er inkluderet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
PCR amplifikation
- Udføre fluorescerende mikrosatellitgenotype bestemmelse ved hjælp af et multiplex STR-system (tabel over materialer).
- Brug de PCR-betingelser, der er vist i figur 4 til PCR-amplificeringen, ved hjælp af MULTIPLEX Str-systemet (tabel over materialer).
Bemærk: Følgende primere anvendes i dette multiplex Str-system: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, tpox, D8S1179, VWA, amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 og Penta D.
Figur 4: PCR-cyklus betingelser for multiplex Str-systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
PCR-produkterne kan løses ved kapillær elektroforese.
- 1 μL af hver forstærket prøve suspenderes i 0,5 μL af multiplex-systemets interne standard Lane og 9,5 μL af stærkt deioniseret formamid (tabel over materialer).
- Kør prøver gennem et kapillar elektroforese instrument (tabel over materialer) ved hjælp af en passende separations matrix (tabel over materialer) til instrumentet og multiplex-systemets farve sæt.
- Data analyse
- Analysér data med en DNA-fragment analyse software og Sammenlign POC alleler med forældre alleler for at bestemme deres oprindelse.
- Konfigurer en størrelses standard.
Bemærk: Dette gør det muligt for softwaren at genkende stigen, der bruges i multiplex Str-systemet, og at tildele basepairs til amplikoner baseret på stigen. Følgende trin er for en bestemt software (tabel over materialer), men kan være til hjælp for at oprette andre typer software samt.- Åbn softwaren. Klik på Start nyt projekt og derefter på ny størrelse standard.
- Giv standardstørrelsen et navn (f. eks. ABI_600).
- I boksen Indtast ny størrelse standard definition: Indtast følgende: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Klik derefter på Tilføj størrelse (r).
Bemærk: de indtastede tal vises under boksen til højre, som er standard definition for aktuel størrelse (Se figur 5). - Klik på Gem.
- For at importere og analysere en fil, klik på Tilføj filer, og vælg FSA-filen, der skal analyseres. Klik på Tilføj valgte filer og derefter på OK. Følg derefter disse trin:
- Find standard kolonnen størrelse , og vælg ABI_600 (eller det navn, som blev givet til størrelses standarden).
- Under analysemetode, klik på dimensionering default-NPP og klik derefter på den grønne Analysér knap.
- Filen er nu klar til visning. Juster visningsindstillingerne for at få vist dataene som ønsket.
- Fejlfinding-analysemetode
Bemærk: Softwaren kan nogle gange undlade at identificere toppe og justere dem korrekt. Dette sker, når toppene enten er for lave eller for høje. De følgende to analysemetoder kan korrigere for dette og bør prøves, før en prøve testes igen.- Analysemetode 1 for høje toppe:
- Klik på ny analysemetode og navngiv det høje toppe (eller et andet navn som pr personlige præferencer).
- Klik på Range og derefter på delområde for analyse og dimensionering. Skriv derefter 100 for startpunktet og startstørrelsen.
- Indtast 10.000 for stop punktet. Indtast 1000 for stop-størrelsen.
- Klik derefter på minimum peak højder og ændre tallene sådan, at peak tærskel for farverne er som følger: blå: 50; Grøn: 50; Gul: 20; Rød: 100; Orange: 5000.
- Gem den nye analysemetode.
- Analysemetode 2 for lave toppe:
- Klik på ny analysemetode og navngiv den lave toppe (eller et andet navn som pr personlige præferencer).
- Klik på Range og derefter på delområde for analyse og dimensionering. Skriv derefter 100 for startpunktet og startstørrelsen.
- Indtast 10.000 for stop punktet. Indtast 1000 for stop-størrelsen.
- Klik derefter på kvalitet flag og ændre pass Range sådan, at det lyder fra 0,5 til 1. Ændre den lave kvalitet rækkevidde , således at det lyder fra 0,0 til 0,0. Skift Antag linearitet til følgende: fra (BP) 100,0 til (BP) 800,0.
- Gem den nye analysemetode.
Bemærk: Det er nu muligt at reanalysere en fil ved at vælge lav toppe eller høje toppe under analysemetode og derefter klikke på den grønne Analysér knap.
- Analysemetode 1 for høje toppe:
Figur 5: skærmbillede, der viser størrelsen standard editor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. strømnings cytometri
-
At vælge den ideelle FFPE blok
- Ved hjælp af H & E slides og et let mikroskop, skal du vælge en FFPE blok, der har omkring 50 − 70% af dens væv består af CV.
Bemærk: figur 6 er et repræsentativt eksempel på en passende blok til flow cytometri-analyse, da den består af ca. 50% CV (højre halvdel af sektionen) og 50% mødrevæv (venstre halvdel). Tilstedeværelsen af mødres væv er vigtig, fordi de tjener som en intern kontrol for diploide Peak. - For blokke, der ikke har den ideelle mængde CV, berige for CV som skæring udføres. For at gøre dette skal du finde ud af, hvilken side af de nyskårne sektioner der indeholder mere CV i henhold til det tilsvarende H & E-dias. Baseret på dette, skal du bruge en klinge til at afskære den anden halvdel, der skal kasseres for at berige for CV.
Bemærk: figur 7 viser en blok, der ikke har tilstrækkeligt CV til flow cytometri-analyse. For blokke som denne, skal afsnittene skæres sådan, at den halve, der indeholder mindre CV bliver kasseret for at øge mængden af CV med hensyn til mødrevæv, som vist i figuren. Sørg for at skære flere sektioner for at kompensere for, hvad der kasseres.
- Ved hjælp af H & E slides og et let mikroskop, skal du vælge en FFPE blok, der har omkring 50 − 70% af dens væv består af CV.
Figur 6: H &Amp; E sektion, der repræsenterer en POC-blok, som er ideel til strømnings cytometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: H &Amp; E sektion, der repræsenterer en vanskeligere blok for flow cytometri. Denne repræsentant H & E afsnit viser, at kun den nederste halvdel af dette afsnit bør anvendes til flow flowcytometri analyse, med det formål at berige for CV. Det skitserede område, mærket "CV", består for det meste af CV. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Skæring
- Lad blokkene på is i 15 min for at lette skæring.
- Brug den bedst mulige FFPE-blok til at klippe fire sektioner, der er 50 μm tykke (eller 2 100 μm tykke sektioner) ved hjælp af en mikrotom.
Bemærk: For strømnings cytometri foretrækkes det at have tykkere sektioner. - I tilfælde af, at en ideel FFPE blok ikke er til rådighed, til formål at opretholde forholdet mellem CV til mødrevæv alligevel. For eksempel, hvis kun 30% af blokken består af CV, mens resten har mødrevæv, så fjern mindst halvdelen af det afsnit, der indeholder mødres væv og bruge flere sektioner til at kompensere (Se figur 7).
- Placer sektionerne i mærkede 15 mL rør.
Bemærk: Sørg for at tape over etiketterne, fordi de organiske reagenser, der anvendes i næste trin, kan opløse og fjerne blæk.
- Flow cytometri-protokol fra FFPE-væv
- Deparaffinization og rehydrering
- Udfør følgende skyller (tabel 3) under en Røghætte.
- Fyld 15 mL røret med 6 mL af det relevante reagens efter den i tabel 3 viste rækkefølge, lad sektionerne i reagenserne være i den respektive varighed, og fjern derefter reagenset med vakuum sugning og en glas Pasteur-pipette.
- Mellem hvert trin, dyp Pasteur-pipetten først i 70% ethanol, derefter i destilleret vand, og fortsæt derefter til næste trin.
- Vær meget omhyggelig med ikke at fjerne stykker af væv sammen med reagenset. VIP 15 mL røret til en 60-graders vinkel for at lette indsugning af det flydende reagens uden at tegne væv.
Forsigtig: De Kasserede væsker indeholder xylen og skal bortskaffes i beholdere til xylen affald.
- Klargøring af opløsningen
- Forbered citratopløsning ved at opløse 2 g citronsyre i 1 liter dobbeltdestilleret vand. Bring pH til 6. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered pepsinopløsning ved at opløse 0,01 g pepsin i 2 mL af 9 dele pr. tusind NaCl, pH 1,64. Dette er for en prøve.
Forsigtig: Pepsin er giftig og kan nemt sprede og blive luftbårne. Bær en maske, når du håndterer pepsin i pulverform og aftør alle arbejdsområdet efter brug. - Propidium iodide (PI)-ribonuclease en opløsning præparat til en prøve.
- Bland 50 μL PI med 450 μL PBS (til fortynding af 10x).
- Der tilsættes 50 μl ribonuklease a (1 mg/ml) til blandingen. Hold indpakket i folie på alle tidspunkter.
- Fordøjelse og farvning
- Tilsæt 4 °C citratopløsning til de 15 mL rør og Placer derefter i et 80 °C vandbad i 2 timer.
- Lad opløsningen køle ned til stuetemperatur (15 min). Fjern citrat opløsningen.
- Tilsæt 6 mL 1x PBS, vortex, og vent 1 − 2 min for at lade vævene bosætte sig i bunden. Fjern 1x PBS ved hjælp af vakuum sugning og en glas Pasteur-pipette.
- Der tilsættes 1 mL pepsinopløsning (forvarmet til 37 °C) og placeres i et 37 °C tørt bad i 30 min. vortex hver 10 min. Forbered PI-ribonuclease en opløsning i de sidste 10 min af denne inkubation.
- Tilsæt 6 mL 1x PBS, vortex, og vent 1 − 2 min for at lade vævene bosætte sig i bunden. Fjern 1x PBS ved hjælp af vakuum sugning og en glas Pasteur-pipette.
- Tilsæt 550 μL af PI-ribonuclease en opløsning og Placer prøverne i et 37 °C tørt bad i 30 min.
Bemærk: På dette tidspunkt, prøverne kan pakkes i folie og venstre natten over ved 4 °C indtil næste morgen. - Opløsningen filtreres gennem et 48-μm filtreringsnet. Filtratet opsamles i polystyren rund bund rør, som kan bruges med flow cytometer. Brug pincet til at placere en 5 cm af 5 cm stykke filtreringsnet i den øverste del af røret, således at væsken kan pipetteres gennem mesh og ind i røret.
Bemærk: Prøverne er nu klar til at blive kørt med flow cytometer. Opbevar dem pakket i folie, indtil de er klar til at blive kørt.
- Kør prøver med et flow-flowcytometer ved hjælp af organisationens flow flowcytometri-platforms tekniker.
Bemærk: PE-kanalen bruges til at detektere det PI-farvede DNA, og strømningshastigheden skal indstilles til langsom under erhvervelse. Sørg for, at spændingen er valgt således, at diploide peak er omtrent på 200 langs PE-A x-aksen for at lette analyse og fortolkning. Til formål at registrere mindst 20.000 hændelser pr. prøve.
- Deparaffinization og rehydrering
| Anvendt reagens (6 mL hver) | Varighed |
| 1) xylen | 2 x 10 min |
| 2) 100% ethanol | 2 x 10 min |
| 3) 95% ethanol | 10 min |
| 4) 70% ethanol | 10 min |
| 5) 50% ethanol | 10 min |
| 6) destilleret vand | 2 x 10 min |
Tabel 3: reagenser og varigheder for deparaffinisation og rehydrering.
-
Analyse af flow cytometri
- Analysér data med en flowcytometry Analysis-software (tabel over materialer).
Bemærk: Følgende trin er for en bestemt software (tabel over materialer), men kan være til hjælp for at oprette andre typer software samt.- Efter at have kørt prøverne på et flow cytometer, download FCS 2,0 filer til analyse.
- Åbn flow flowcytometri Analysis software, klik på fil | Nyt dokument.
- Klik på histogram ikonet (
), og træk derefter markøren for at oprette et rektangel. - Søg efter FCS-filen, og klik derefter på Åbn. Langs x-aksen skal du klikke på FCS-a og derefter vælge PE-a.
- Klik på ikonet for prik plot (
), og træk derefter markøren for at oprette et andet rektangel under histogram plottet. Søg derefter efter den samme FCS-fil, der blev valgt til histogrammet. - Skift x-aksen i dot-plottet til PE-A og y-aksen til PE-W.
Note: figur 8A demonstrerer udseendet af observationsområderne på dette tidspunkt. - Klik på ikonet region (
) og tegne en boks på prik plot, der starter før diploide Peak (omkring 100 på x-aksen i figur 8B), og der slutter omkring 700 på x-aksen, som vist i dot plot i figur 8 B.
Bemærk: Diploide Peak i figur 8 er omtrent på 200 på x-aksen. Dette vælges vilkårligt, da prøverne registreres gennem flow cytometer, blot for at lette analyse og fortolkning af resultaterne. - Klik på plot | Rediger områder/porte, og skriv derefter R0 i cellen, der er ved siden af cellen G0 under strategi. Klik derefter på Luk.
- Klik et vilkårligt sted på histogrammet og derefter på plot | Formatér plot/overlay. Under Gateskal du vælge G0 = R0 og derefter klikke på OK.
Bemærk: Dette er den gating skridt, der giver en til bedre at visualisere Ploidi toppe. Histogrammet skal nu se ud som histogrammet i figur 8b. Det er muligt at spille rundt med porten oprettet (ved at flytte boksen trukket i trin 2.4.1.7) for at fokusere på specifikke områder af dot plot. - Hvis du vil mærke plottet, skal du klikke på tekstområde ikonet (
) og derefter trække markøren for at oprette en boks øverst i dokumentet og derefter skrive følgende oplysninger: patient-id, POC-id og den anvendte blok (da der kan være flere blokke for en POC) , procent CV til stede på blokken, spænding bruges til at køreprøven, og datoen.
- Analysér data med en flowcytometry Analysis-software (tabel over materialer).
), og træk derefter markøren for at oprette et rektangel.
), og træk derefter markøren for at oprette et andet rektangel under histogram plottet. Søg derefter efter den samme FCS-fil, der blev valgt til histogrammet.
) og tegne en boks på prik plot, der starter før diploide Peak (omkring 100 på x-aksen i figur 8B), og der slutter omkring 700 på x-aksen, som vist i dot plot i figur 8 B.
) og derefter trække markøren for at oprette en boks øverst i dokumentet og derefter skrive følgende oplysninger: patient-id, POC-id og den anvendte blok (da der kan være flere blokke for en POC) , procent CV til stede på blokken, spænding bruges til at køreprøven, og datoen.
Figur 8: skærmbillede, der viser et histogram og en prik plot af en repræsentativ prøve, som er ubevogtede (a) og gated (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kompleksiteten af molære væv og det faktum, at de kan have forskellige genotyper nødvendiggør streng analyse og anvendelse af flere metoder såsom morfologiske evaluering, P57 immunhistochemistry, microsatellite genotypebestemmelse, flow cytometri, og fisk. For eksempel, en patient (1790) blev henvist med to PHM, der blev fundet at være triploide ved mikroarray analyse af POCs kun. Patienten blev derfor diagnosticeret med recidiverende PHM. Microsatellite genotype bestemmelse af hendes to "PHM" sammen med DNA af patienten og hendes partner afslørede, at mens patientens første mole er triploide dispermic (figur 9A), hendes anden "PHM" har en triploide digynic genotype (figur 9 B) og er derfor ikke en PHM, men en ikke-molær abort.
Den første markør i figur 9A (i sort) viser to toppe i POC. Den første top stammer fra moderen, da kun moderen har et højdepunkt af denne størrelse. Efter samme ræsonnement stammer den anden top fra Faderen, da han deler samme allel. Bemærk, hvordan den anden top er en meget højere end den første, hvilket indikerer, at der sandsynligvis er to doser af samme faderlige allel i denne Peak. Maternel kontaminering, som vil blive forklaret mere detaljeret senere, er meget minimal i denne POC, fordi POC viser en meget lille top på positionen af den anden maternel allel.
Den anden markør i figur 9A (med blåt) viser tre toppe i POC. To af disse toppe stammer fra Faderen og en fra moderen. Således er det klart igen fra denne markør, at der er tre alleler til stede i POC, to fra Faderen og en fra moderen. Den tredje og fjerde markører i figur 9A ligner den første markør, og viser også to alleler, der kommer fra Faderen og en fra moderen.
Da alle fire markører konsekvent viser tre alleler (ved dosis eller ved tilstedeværelsen af tre alleler i forskellige størrelser), to stammer fra Faderen og en fra moderen, kan man konk sige, at denne POC er triploide dispermisk, og bekræfter diagnosen af PHM.
Alle fire markører i figur 9B viser igen tre alleler: den første markør viser to doser i den første top, der stammer fra moderen og en dosis i den anden top, der stammer fra Faderen. Den anden og fjerde markører viser tre forskellige toppe (dvs. tre forskellige alleler), hvoraf to er fra moderen. Den tredje markør viser en dosis i den første top med oprindelse fra Faderen og to doser i den anden top med oprindelse fra moderen. Derfor er denne POC er triploide digynic i oprindelse, da to sæt af kromosomer kommer fra moderen og et sæt kommer fra Faderen. Det er derfor en ikke-molær abort.
Figur 9: repræsentative genotype resultater af patient 1790. (A) Vælg genotype resultater af patientens første undfangelse, der viser en triploide dispermisk genotypen. (B) Vælg genotypebestemmelse resultater fra patientens anden undfangelse, der viser en triploide digynic genotypen. X-aksen er i basepairs; etiketterne og basepair størrelserne er udeladt for enkelhed. Y-aksen repræsenterer peak højde og er ligeledes udeladt fra figuren for enkelhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Denne patient blev oprindeligt fejldiagnosticeret med to PHM og var bekymrende om en øget risiko for flere mol, mens hun havde en enkelt PHM. Denne sag fremhæver begrænsningen af SNP microarray på POC alene. SNP microarray er en kraftfuld metode og er den bedste til at detektere aneuploidies af enhver kromosom (trisomer, monosomer, eller ikke-diploid genotyper); men når det udføres på POC alene uden at analysere forældrenes DNA, kan oprindelsen af triploidy ikke bestemmes. For yderligere forklaringer om genotype analyse og tolkning henvises til undersøgelsen af Murphy et al.16.
Repræsentative resultater vist i figur 10a er af triploide-undfangelse. Værdierne af x-aksen repræsenterer det nukleare DNA-indhold. For eksempel, 200 er et vilkårligt tal givet til celler, der indeholder en vis mængde af nukleare DNA-indhold. Derfor repræsenterer et højdepunkt på 400 celler, der indeholder det dobbelte af mængden af nukleart DNA-indhold i forhold til 200-toppen. Den lille top omkring 300 repræsenterer nukleare DNA-indhold, der er i mellem 200 og 400 peak og er derfor triploide Peak. Bemærk, hvordan en diploide-undfangelse (figur 10B) ikke indeholder nogen spidsværdi ved 300-værdien.
I nogle tilfælde, triploide peak er meget subtile (figur 10C). Når en knap mærkbar triploide peak er noteret, er det vigtigt først at overveje mængden af CV, der var til stede i de sektioner, der anvendes til flow flowcytometri analyse. Hvis afsnittene havde mindre end omkring 20% CV, så vil det sandsynligvis være en sand triploidy, da det forventes at være en meget lav top. Hvis afsnittene taget havde store mængder af CV, POC bliver mistænksom over for mosaisme med tilstedeværelsen af en anden diploide cellulære befolkning. Dette kan kontrolleres ved fornyet gennemgang af Geno Typing resultater for at se, om de passer til en perfekt triploide dispermy eller kan også bekræftes af fisk med sonder fra X, Y, og 18 kromosomer. Også, ved hjælp af den software, der er beskrevet i denne artikel, er det muligt at indstille specifikke porte, som beskrevet i afsnit 2.4.1, der giver brugeren mulighed for at fokusere på en bestemt region for at berige for triploide celler, hvis de virkelig eksisterer.
Figur 10: repræsentative flow cytometri-resultater, der viser triploide-konceptioner i (A) og (C) og en diploide forestilling i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HM er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier og har forskellige histologiske og genotypiske typer, hvilket gør deres nøjagtige klassificering og diagnose udfordrende. Histopatologiske morfologiske vurderinger blev ofte påvist unøjagtige og er derfor upålidelige i sig selv til at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra ikke-molære aborter. Derfor kræver en nøjagtig diagnose af HM brug af andre metoder såsom multiplex-DNA-genotypebestemmelse, Ploidi-analyse ved flow cytometri, Ploidi-analyse af fisk og P57KIP2 Immunhistokemi. Hver af disse metoder har sine egne begrænsninger og fordele.
Begrænsninger og fordele ved multiplex genotypebestemmelse og flow cytometri
Maternel kontaminering er et af de mest almindeligt forekommende problemer, når man arbejder med FFPE-væv og kan føre til fejldiagnosticering, hvilket understreger vigtigheden af at adskille mødre fra POC-væv. Det er vigtigt at identificere maternel kontaminering for at få en idé om, hvad man kan forvente af de genotype toppe og til at hjælpe med deres fortolkning. Hvis kontamineringsniveauet er for stort og forhindrer pålidelig fortolkning af resultaterne, skal du gentage DNA-isoleringen og-ekstraktionen og tage ekstra omhu ved at fjerne alle mulige mødrevæv. I områder, hvor morfologien i vævet ikke er klar, er det bedre at fjerne sådanne regioner for at minimere risikoen for maternel kontaminering. Den første fordel ved den metode, der er beskrevet i denne protokol, ud over dens lavere omkostninger, er, at mødres væv fjernes fra slides, mens andre metoder består af indsamling af POC væv (ved at dække dem med en opløsning, der polymeriserer, når de udsættes for luft og løft af vævet) uden at fjerne mødres væv. Den metode, der er beskrevet her, gør det muligt for en at tage et andet kig på de resterende POC væv, re-rense dem, hvis det er nødvendigt, som det ofte er tilfældet, og derefter indsamle og udtrække DNA fra dem. Den anden fordel er, at vi Rengør væv på uncovergerede H & E farvede sektioner, hvilket i høj grad letter fjernelsen af mødres væv, i modsætning til brugen af ufarvede sektioner og en dækslippet kort slide. Men den ekstra farvning kan yderligere forringe DNA, og dette kompenseres ved at tilføje flere sektioner.
Tilgængeligheden af forældrenes DNA til analysen er en anden udfordring. Tilstedeværelsen af begge forældre letter i høj grad analysen og fortolkningen af Geno Typing resultater. Desværre er det ganske ofte tilfældet, at Faderens DNA ikke er tilgængelig, hvilket undertiden kan komplicere analysen, især i tilfælde, hvor kvaliteten af POC-DNA er dårlig på grund af forudgående fiksering eller langtidsopbevaring (hyppigere, når man arbejder med tilbagevendende HM). Desuden er maternel blod måske ikke altid tilgængeligt for DNA-ekstraktion. I sådanne tilfælde kan maternelle DNA ekstraheres fra maternel endometriale væv til stede i FFPE blokke som tidligere beskrevet16. Også, karakterisering af molære væv, der er resultatet af brugen af assisteret reproduktionsteknologi kan komplicere microsatellite genotype analyse, fordi, i de fleste tilfælde, DNA fra donorer (hanner eller hunner) er normalt ikke tilgængelig.
Endelig er den omstændighed, at større toppe tendens til at være kortere i form af peak højde en anden mulig kilde til forvirring, især når tophøjder skal bruges til at bestemme, om der er to doser eller en dosis i en enkelt Peak. En måde at overvinde dette er at altid huske på, at toppe af store allel størrelse (antal Base par) tendens til at være kortere, på grund af den forringede karakter af DNA fra FFPE væv, hvilket gør mindre DNA til rådighed for forstærkning af større alleler. Desuden tager en kortere PCR-fragment forstærkning mindre tid end en større, og den eksponentielle forstærkning af DNA fører til færre mængder af større alleler.
Den vigtigste ulempe ved flow cytometri er, at triploide forestillinger kan undertiden gå glip af, og dette kan skyldes utilstrækkelige mængder af CV i blokken. Men tilstedeværelsen af en triploide peak er en afgørende indikation af en triploidy. Bemærk, at denne metode ikke er følsom nok til at detektere trisomer, tetraploide forestillinger, eller andre aneuploidies ved hjælp af denne protokol. Tetraploide forestillinger er ikke detekterbare ved denne protokol, fordi tetraploide peak svarer til den samme top af diploide celler i G2 fase af cellen cyklus.
Kendskab til disse begrænsninger og udfordringer hjælper med at reducere fejl. Det er derfor vigtigt og nogle gange nødvendigt at analysere det samme væv med forskellige metoder, sammenligne resultaterne, og sørg for, at de er samstemmende med hinanden. Hvis de ikke er det, skal resultaterne tages op til fornyet overvejelse, og analyserne skal gentages. For de mange tilfælde, der viste modstridende resultater, blev uoverensstemmelser løst ved blot at gentage forsøgene og tage passende omhu for at undgå det oprindelige problem. I andre tilfælde blev uoverensstemmelser løst ved at udføre yderligere metoder såsom fisk på vævs sektioner eller ved at udføre yderligere simplex-genotypebestemmelse med passende markører.
Identifikation af maternel kontaminering
Med hensyn til at identificere kontaminering af POC-DNA med maternelle DNA, vil kontamineringsniveauet blive afspejlet eller anerkendt af tilstedeværelsen af alle maternel alleler på alle loci i POC, foruden den maternelle allel (s), der overføres til POC.
I Figur 11Aer toppe, der stammer fra maternel DNA-kontaminering, mærket med et "c". Bemærk, hvordan hver top markeret med en "c" er også til stede i moderen, og vi ser disse "c" toppe i alle tre markører. Bemærk, at for den anden markør (i blåt) er den mødres kontaminerings spids, der er angivet med et "c", højere end hvert "c"-højdepunkt ved den første markør, fordi moderen er homozygot for den anden markør; højden af kontaminanten er derfor fordoblet for denne markør. I denne POC er der ingen Maternelt afledte toppe. Med andre ord, denne POC ikke arve nogen alleler fra moderen. Der er kun én reel top ved hver markør, og dette højdepunkt er ikke til stede i moderen. Vi ved derfor, at de virkelige toppe må være kommet fra Faderen. Med Ploidi oplysninger fra enten karyotype eller flow flowcytometri analyse viser diploidy, er det muligt at konk ¦ lle, at denne POC er både androgenetisk i oprindelse og diploid.
Desuden viser disse tre markører i Figur 11A , at der altid kun er én reel top for hver markør. Kun tre markører er illustreret her, men multiplex kits ofte kommer med mange flere markører, der vil også afsløre det samme mønster. Da denne POC er diploid, der skal være to doser i hver top. Med disse oplysninger, kan vi konk gøre, at denne POC er androgenetisk monospermic og er homozygot ved hver enkelt markør.
Figur 11B repræsenterer en diploide biparental POC. Den lille sorte bjælke på tværs af den første top af den første markør (med grønt) repræsenterer den anslåede mængde af forurening, der er til stede inden for denne reelle Peak. Den "R" indikerer den virkelige del af denne peak kommer fra POC DNA; "c" repræsenterer den kontaminerende del af denne spids, som kommer fra det maternelle DNA. Hvordan kan man identificere forureningsniveauet? Det er muligt, i dette tilfælde, når en markør er heterozygot i moderen, fordi en af de maternelle alleler er fraværende i POC. Den lille top i den første markør mærket med "c" indikerer f. eks., at dette er det kontamineringsniveau, der bør forventes for den anden Maternelt nedarvede top. Derfor er alle de POC toppe, der er af mødres oprindelse er lidt højere end de formynderisk nedarvede toppe på grund af den lille tilsat mængde forurening. For den tredje markør (i sort) i Figur 11Bforventes kontamineringsniveauet at være dobbelt så meget som det sædvanlige (fordi moderen er homozygot for denne specifikke markør), og man kan derfor udlede, at der kun er én dosis i den første spids i POC.
Figur 11C illustrerer en TRIPLOIDe dispermisk POC. Den første markør (med grønt) viser tre toppe i POC. Da disse tre toppe har lignende højder, er det muligt at konk gøre, at denne POC er sandsynligvis triploid. Bemærk, at den tredje top i denne markør er kortere end den første. Dette forventes, fordi større toppe som en generel tendens har tendens til at være kortere. Den anden top er lidt højere end den første, og dette kan forklares ved en lille mængde af maternel forurening, som angivet af baren og "c." Desuden er to af disse tre toppe ikke til stede i moderen, og derfor må være kommet fra Faderen. Hidtil, denne markør indikerer, at POC kunne være triploide (eller en trisomy), og at oprindelsen af det ekstra sæt af kromosomer er faderlig. Det viser også, at det er en dispermisk undfangelse, da POC arvet to forskellige alleler fra Faderen.
Den anden markør (i blåt) i Figur 11C har kun to toppe. Efter at have ført regnskab for forureningsniveauet synes den anden top at være højere end den første, og det er på trods af den generelle tendens til, at større toppe er mindre (en tendens, der altid skal holdes for øje under analysen). Således er det sandsynligt, at der er to doser i, at en stor top. Dette underbygges også af, at den første markør er vejledende for triploidy.
Endelig viser den tredje markør (i sort) i Figur 11C tre toppe, som igen indikerer triploidy. Da de fleste markører i multiplex kits kommer fra forskellige kromosomer, er det muligt at konk ægge med tillid, at en POC er triploide efter at have observeret den samme tendens af tre alleler på tværs af flere forskellige markører. Bemærk også fra denne markør, at to ud af de tre toppe stammer fra Faderen, der bekræfter den dispermiske oprindelse.
Figur 11: resultater af genotypebestemmelse, som illustrerer virkningen af maternel kontaminering. De øverste paneler viser alleler, der hører til POC og de nederste paneler viser dem, der tilhører moderen. I (A), POC er androgenetisk monospermic og niveauet af forurening er fremhævet af en pil og bogstavet "c." I (B), POC er diploide biparental, og graden af forurening er fremhævet af bogstavet "c." I (C), POC er triploide dispermic og graden af forurening er fremhævet af bogstavet "C." De små sorte bjælker viser, hvor meget af højde højden kommer fra maternel kontaminering og bør derfor tages i betragtning ved sammenligning af tophøjder. X-aksen er i basepairs; etiketterne og basepair størrelserne er udeladt for enkelhed. Y-aksen repræsenterer peak højde og er ligeledes udeladt fra figuren for enkelhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Eksempler på udfordrende sager
I en række tilfælde var det kun muligt at nå frem til en konklusion ved at have alle tre vurderinger samtidigt (dvs. flow, P57KIP2og multiplex-genotypebestemmelse). For eksempel, en sag (808) blev henvist som en ikke-molær abort. Histopatologiske evaluering føre til mistanke om en molær undfangelse og genotypebestemmelse analyse af POC afslørede en markør, der klart viste tre toppe (to fra Faderen og en fra moderen). De P57KIP2 resultater var ikke afgørende. Flow flowcytometri analyse afslørede en lille triploide peak, der blev bekræftet med fisk analyse, som også udelukket tilstedeværelsen af en anden diploide cellulære population. Med bekræftelse fra fisk, var det muligt at konk gøre, at POC er faktisk en triploide dispermisk mole.
En anden sag (1192) blev også omtalt som ikke-molær abort. CV'ET for denne POC var blandet med mødres væv og var meget nekrotisk samt, hvilket gør rengøringsprocessen meget udfordrende. Derfor viste den første genotype analyse en høj grad af maternel kontaminering, således at alle maternel alleler kunne ses i POC (en god indikation af mulig kontaminering). Desuden var P57KIP2 desværre inkonklusive, sandsynligvis på grund af den nekrotiske karakter af vævet, måske på grund af forsinket fiksering. Resultaterne af strømnings cytometri var imidlertid vejledende for triploidy, som også blev bekræftet af fisk. DNA'ET blev genudvundet med det mål at reducere kontamineringsniveauet og fjerne væv med uklar morfologi. Analyse af de nye genotype resultater, mens der tegner sig for den sandsynlige tilstedeværelse af maternel kontaminering, tillod os at konk gøre, at POC var en triploide dispermisk XXY PHM.
Tabel 4 skitserer de typiske metoder, der anvendes til analyse. Det anbefales at bruge morfologisk evaluering og P57KIP2 immun histokemi på alle væv mistænkelige af HM og mindst én genotype metode. Blandt genotypebestemmelse metoder, den mest informative er multiplex DNA genotypebestemmelse. Når resultaterne mellem forskellige metoder ikke er overensstemmende, eller når nogle resultater er inkonklusive, skal der anvendes andre genotype metoder. Tabellen viser forventede samstemmende resultater for hver mulig HM type sammen med sjældne undtagelser og anbefalinger til at løse dem.
Tabel 4: typisk analyse rækkefølge, forventede resultater og sjældne undtagelser sammen med anbefalinger til at løse dem. P57KIP2 immun histokemi har til formål at detektere ekspression af P57KIP2, proteinet kodet af CDKN1C gen. Dette gen er paternalt påtrykt i cytotrofoblast og den villøs stroma i første trimester placenta og udtrykkes kun fra det maternelle genom. Det er derfor bruges som en supplerende markør til at opdage, på en nem og billig måde tilstedeværelsen af det maternelle genom i POC. Det anbefales at udføre P57KIP2 Immunhistokemi for alle poc'er, der mistænkes for at være HM parallelt med den morfologiske evaluering. I forfatterens laboratorium, P57KIP2 antistof og platforme, der er angivet i tabellen over materialer anvendes, og forfatterne er meget tilfredse med kvaliteten af resultaterne. Forkortelser: IHC = Immunhistokemi; Dip og = diploide androgenetic; DIP bip = diploide biparental; Chr = kromosom; MC = spontan abort; og TP = trofoblastiske proliferation.
Til det bedste af forfatterne ' viden, denne artikel er den første til at give detaljerede protokoller for flow flowcytometri samt lavpris og høj kvalitet multiplex microsatellite DNA genotypebestemmelse af FFPE POC væv. Fortolkningen af resultaterne er også beskrevet, sammen med deres fejlfinding og integration med de andre metoder til at nå præcise konklusioner og diagnoser af POCs og HM. Forfatterne håber inderligt, at denne artikel kan være nyttige for forskere, der forsøger at forstå denne komplekse enhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Sophie patrier og Marianne parésy for at dele den oprindelige flow flowcytometri-protokol og promega og qiagen for forsyninger og reagenser. Dette arbejde blev støttet af Réseau Québécois en reproduktion og det canadiske Institut for sundhedsforskning (MOP-130364) til R.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
