Summary
Les grains de beauté hydatidiformes sont des grossesses humaines anormales avec des étiologies hétérogènes qui peuvent être classées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques et de leur contribution parentale aux génomes des molaires. Ici, les protocoles du génotypage et de la cytométrie d'écoulement microsatellites de la paraffine-intégrée des tissus paraffines formalines sont décrits en détail, ainsi que l'interprétation et l'intégration des résultats.
Abstract
La taupe hydatidiform (HM) est une grossesse humaine anormale caractérisée par la prolifération trophoblastique excessive et le développement embryonnaire anormal. Il existe deux types de HM basés sur l'évaluation morphologique microscopique, hm complet (CHM) et HM partiel (PHM). Ceux-ci peuvent être subdivisés en fonction de la contribution parentale aux génomes molaires. Une telle caractérisation de HM, par des analyses de morphologie et de génotype, est cruciale pour la gestion patiente et pour la compréhension fondamentale de cette pathologie intrigante. Il est bien documenté que l'analyse morphologique de HM est sujette à une grande variabilité interobservateur et ne suffit pas à elle seule à classer avec précision HM en CHM et PHM et les distinguer des avortements hydropiques non-molaires. L'analyse du génotypage est principalement effectuée sur l'ADN et les tissus à partir de produits de conception intégrés à la paraffine (FFPE) qui ont une qualité inférieure à l'optimal et peuvent donc conduire à de mauvaises conclusions. Dans cet article, des protocoles détaillés pour les analyses de génotypage multiplex et de cytométrie du flux des tissus molaires FFPE sont fournis, ainsi que l'interprétation des résultats de ces méthodes, leur dépannage, et l'intégration avec l'évaluation morphologique , l'immunohistochimiede KIP2 p57, et l'hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour atteindre un diagnostic correct et robuste. Ici, les auteurs partagent les méthodes et les leçons apprises au cours des 10 dernières années de l'analyse d'environ 400 produits de conception.
Introduction
Une taupe hydatidiform (HM) est une grossesse humaine anormale caractérisée par le développement embryonnaire anormal, l'hyperprolifération du trophoblaste, et la dégénérescence hydropic des villosités chorioniques (CV). Historiquement, HM était divisé en deux types, HM complet (CHM) et HM partiel (PHM) basé seulement sur l'évaluation morphologique1. Cependant, il a été démontré que l'évaluation morphologique seule ne suffit pas à classer HM dans les deux sous-types (CHM et PHM) et les distinguer des fausses couches non molaires2,3,4.
Puisque CHM et PHM ont des propensions différentes aux malignités, il est donc important de déterminer avec précision le type génotypique de HM pour fournir le suivi et la gestion appropriés aux patients. Par conséquent, au cours des dernières décennies, plusieurs méthodologies ont été développées et développées dans le but d'identifier la contribution parentale aux tissus molaires et d'atteindre une classification correcte de HM. Il s'agit notamment de l'analyse karyotype, du polymorphisme de baguage chromosomique, de la typage sérologique de l'antigène leucocyte humain (HLA), du polymorphisme de longueur de fragment de restriction, du nombre variable de répétitions de tandem, du génotypage microsatellite, de la cytométrie du débit et du p57 immunohistochimie KIP2. Cela a permis une subdivision précise des conceptions de HM basées sur la contribution parentale à leurs génomes, comme suit: CHM, qui sont diploïdes androgènes monospermiques ou diploïdes dispermiques androgénétiques androgènes, et PHM, qui sont triploïdes, dispermiques dans 99% et monospermic dans 1% des cas5,6,7,8. En outre, il existe un autre type de HM génotypique qui a émergé au cours des deux dernières décennies, qui est biparental diploïde. Ce dernier est principalement récurrent et peut affecter un seul membre de la famille (cas simplex) ou au moins deux membres de la famille (cas familiaux). Ces taupes biparentales diploïdes sont principalement provoquées par des mutations récessives dans NLRP7 ou KHDC3L dans les patients9,10,11,12. Diploid biparental HM chez les patients présentant des mutations récessives dans NLRP7 peut être diagnostiqué comme CHM ou PHM par analyse morphologique et ceci semble être associé à la sévérité des mutations dans les patients13,14. En plus de la classification de HM en fonction de leurs génotypes, l'introduction et l'utilisation de plusieurs méthodes de génotypage ont permis la distinction des différentes entités molaires des fausses couches non molaires, telles que les conceptions biparentales diploïdes anéuploides et d'autres types de conceptions5,15. De telles conceptions peuvent avoir une certaine prolifération de trophoblastet et la morphologie vilaine anormale qui imitent, dans une certaine mesure, quelques dispositifs morphologiques de HM.
Le but de cet article est de fournir des protocoles détaillés pour le génotypage multiplexe et la cytométrie de flux des tissus paraffinés (FFPE) de formaline fixe, et des analyses complètes des résultats de ces méthodes et de leur intégration avec d'autres méthodes pour diagnostic correct et concluant des tissus molaires.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel de McGill. Tous les patients ont donné leur consentement écrit pour participer à l'étude et faire récupérer leurs produits de conception FFPE (POC) dans divers départements de pathologie.
REMARQUE: Bien qu'il existe plusieurs méthodes de génotypage et de détermination ploidy par cytométrie de flux, les protocoles fournis ici décrivent une méthode d'analyse à l'aide d'une plate-forme pour chacun.
1. Génotypage
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Sélection du meilleur bloc FFPE
- Pour chaque produit de conception FFPE (POC), préparez des sections tachées d'hématoxylin et d'éosine (H et E) d'une épaisseur de 4 m d'épaisseur, telles que décrites dans les sections 1.2 et 1.3, une pour chaque bloc disponible, pour l'évaluation morphologique par microscopie.
- À l'aide des diapositives h et E et d'un microscope léger, sélectionnez le bloc FFPE qui a la plus grande quantité de villosités chorioniques (CV), et si possible, le bloc qui a CV séparé des tissus maternels et non mêlés.
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Sectionnement
- Placer le bloc choisi sur la glace pendant 15 min pour faciliter le sectionnement.
- Ajustez le microtome pour couper des sections de 4 m d'épaisseur pour l'évaluation morphologique microscopique et de 10 m d'épaisseur pour l'extraction de l'ADN.
- Placez le bloc froid dans le microtome et coupez une section de chaque bloc pour la coloration de H et E et 10-30 sections du bloc choisi, selon la quantité de CV dans le bloc, pour l'extraction de l'ADN.
REMARQUE: Pour les blocs pleins de CV, 10 sections sont suffisantes pour l'extraction de l'ADN. Si seulement environ 10% du bloc contient le CV tandis que le reste sont des tissus maternels, alors 20-30 sections sont nécessaires pour assurer des quantités suffisantes d'ADN. - À l'aide de forceps, transférer chaque section dans un bain d'eau de 45 oC. Ramassez la section du bain d'eau avec une glissière chargée positivement(Tableau des matériaux)qui est préalablement étiquetée avec le numéro d'identification de l'échantillon à l'aide d'un crayon.
- Placez les lames contenant les sections dans un four à 65 oC pour permettre aux sections d'adhérer aux glissières. Gardez les glissières de H et E au four pendant 25 min. Gardez les glissières pour l'extraction de l'ADN dans le four pendant 20 min.
REMARQUE: Le temps d'incubation plus court rend les tissus légèrement moins adhérents aux diapositives et facilite par conséquent l'ablation des tissus maternels.
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Coloration de H et E
- Laisser refroidir les glissières à température ambiante (10 min).
- Préparation du réactif
- Préparer la solution de travail Eosin Y (0,25%) selon le tableau 1. Bien mélanger et conserver à température ambiante.
- Préparer la solution d'hématoxyline de travail en diluant la solution de stock d'hématoxyline 5x dans l'eau (c.-à-d., mélanger 80 ml d'eau avec 20 ml d'hématoxyline).
REMARQUE: Enveloppez la solution de stock d'hématoxylin dans le papier d'aluminium pour le stockage.
- Préparer les bocaux de coloration avec les réactifs corrects sous une hotte de fumée selon le tableau 2.
- Effectuez la coloration de H et E en submergeant les diapositives dans les bocaux de coloration appropriés pour la période appropriée selon le tableau 2.
- Monter les sections de 4 m pour l'analyse morphologique avec le milieu de montage et le couvercle avec des couvertures en verre (Tableau des matériaux).
REMARQUE: Les sections de 10 m pour le génotypage ne doivent pas être masquées. - Laissez les sections de 10 m sous le capot de fumée pendant un minimum de 3 h afin que les odeurs toxiques de xylène se dissipent.
MISE EN GARDE: Toutes les étapes de coloration doivent être effectuées sous une hotte de fumée. Les produits à xylène doivent être conservés sous le capot en tout temps parce que les odeurs de xylène sont toxiques. De plus, le xylène et l'hématoxylin doivent être jetés dans des contenants spéciaux. Une fois que ces contenants sont pleins, ils doivent être jetés comme recommandé par l'organisme de sécurité du laboratoire.
| réactif | quantité |
| Solution d'actions Eosin Y (1%) | 250 ml |
| 80% d'éthanol | 750 ml |
| Acide acétique glaciaire (concentré) | 5 mL |
Tableau 1 : Solution de travail Eosin Y (0,25 %) préparation.
| Réactif utilisé (100 ml par bac) | durée |
| 1) Xylène | 5 min |
| 2) Xylène | 5 min |
| 3) 100% éthanol | 2 min |
| 4) 95% d'éthanol | 2 min |
| 5) 70% éthanol | 2 min |
| 6) 50% d'éthanol | 2 min |
| 7) Eau distillée | 5 min |
| 8) Hématoxylin | 4 min |
| 9) Eau distillée | 5 min |
| 10) Eosin | 1 min |
| 11) 95% d'éthanol | 5 min |
| 12) 100% éthanol | 5 min |
| 13) Xylène | 5 min |
| 14) Xylène | 5 min |
Tableau 2 : Réactifs et durées du protocole de coloration H et E.
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Isolement du CV
- Sous un microscope léger, utilisez des forceps et de petits morceaux de lingettes en papier hydratées à l'eau(Tableau des matériaux)pour gratter les tissus maternels indésirables des sections de 10 m d'épaisseur.
REMARQUE: L'objectif final est de ne garder que des membranes CV ou fœtales (lorsqu'elles sont présentes) sur les toboggans et donc d'enlever tous les autres tissus. Cette étape peut avoir besoin de beaucoup de temps et de patience, selon le bloc, car elle nécessite une attention méticuleuse aux détails. - Demandez à une deuxième personne de vérifier les glissières après le nettoyage pour s'assurer qu'elles sont exemptes de tissus maternels.
- Prenez des photos des diapositives nettoyées ou documentez ce qui suit pour aider à l'interprétation des données : 1) si le tissu était difficile à nettoyer, hémorragique ou très propre, 2) le nombre de sections utilisées, et 3) la quantité approximative de tissus nettoyés.
REMARQUE : La figure 1 fournit un exemple de diapositive facile à nettoyer. Pour un bloc contenant à peu près cette quantité de CV, 10 sections sont suffisantes pour l'extraction de l'ADN. La diapositive de la figure 2 a très peu de CV qui sont mélangés avec les tissus maternels, ce qui rend très difficile et long à nettoyer. Pour un bloc contenant à peu près cette quantité de CV, 30 sections sont nécessaires pour l'extraction de l'ADN. - Recueillir le CV à l'aide de petits morceaux de papier humide. À l'aide des forceps, arracher un petit morceau des lingettes de papier humidifiées et l'utiliser pour recueillir le CV.
- Placez les lingettes en papier avec leur CV attaché dans un tube étiqueté de 1,5 ml.
- Minimisez la quantité de lingettes en papier utilisées dans cette étape car trop peut obstruer la colonne d'extraction d'ADN et, par conséquent, réduire la quantité finale d'ADN recueilli. En moyenne, visez à utiliser moins de sept petits morceaux de lingettes en papier par échantillon. Si cela n'est pas possible en raison de la présence de grandes quantités de CV, diviser l'échantillon en deux tubes pour faciliter l'extraction.
- Sous un microscope léger, utilisez des forceps et de petits morceaux de lingettes en papier hydratées à l'eau(Tableau des matériaux)pour gratter les tissus maternels indésirables des sections de 10 m d'épaisseur.
Figure 1 : Diapositive représentative pour le génotypage. Haut : Une diapositive qui doit être « nettoyée » pour se libérer des tissus maternels. En bas: La même diapositive montrée après qu'il a été nettoyé et contient maintenant rien d'autre que CV pour l'extraction de l'ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Diapositive représentative pour le génotypage. Haut : Une diapositive qui doit être « nettoyée » pour se libérer des tissus maternels. En bas: La même diapositive montrée après qu'il a été nettoyé et contient maintenant rien d'autre que CV pour l'extraction de l'ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Suivez le protocole de l'extraction d'ADN du kit FFPE (Tableau des Matériaux) pour effectuer l'extraction de l'ADN.
REMARQUE: Certains kits recommandent d'utiliser 15 à 20 l de tampon d'élution pour l'élution finale. D'expérience, l'élution avec 15 l de tampon d'élution fonctionne bien pour la plupart des échantillons. Les dilutions peuvent être préparées à partir de l'ADN du stock au besoin.
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Quantification de l'ADN
- À l'aide d'un dispositif de spectrophotomètre de laboratoire, chargez 1 L d'ADN et mesurez l'absorption à 260 nm pour la quantification.
- Chargez 1 L d'ADN sur un gel agarose de 2 % et exécutez l'électrophorèse de gel à une tension de 80 à 100 V pour l'évaluation qualitative.
- Sur la base des résultats des étapes 1.6.1 et 1.6.2, choisissez le volume d'ADN à utiliser dans l'amplification de la réaction en chaîne de polymériase (PCR) à répétition en tandem court multiplexe (STR). Visez à utiliser un minimum de 1000 ng d'ADN dans l'amplification PCR qui suit.
REMARQUE : La figure 3 démontre des exemples représentatifs de gels ainsi que les concentrations de l'ADN (basé sur les résultats du spectrophotomètre) et le volume de la solution d'ADN recommandée pour le multiplex STR PCR qui suit.
Figure 3 : Gel représentatif pour la quantification de l'ADN. Sont inclus les concentrations de chaque ADN, mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre, et les quantités utilisées pour le multiplexe PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Amplification PCR
- Effectuer le génotypage microsatellite fluorescent à l'aide d'un système STR multiplex (Tableau des matériaux).
- Utilisez les conditions PCR indiquées à la figure 4 pour l'amplification PCR à l'aide du système STR multiplex (Tableau des matériaux).
REMARQUE: Les amorces suivantes sont utilisées dans ce système STR multiplex : D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, et Penta D.
Figure 4 : Conditions du cycle PCR pour le système MULTIPLEx STR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Résoudre les produits PCR par électrophoresis capillaire.
- Suspendre 1 l de chaque échantillon amplifié dans 0,5 l de la voie standard interne du système multiplex et 9,5 l de formamide fortement déionisé (Tableau des matériaux).
- Exécuter des échantillons à travers un instrument d'électrophorèse capillaire (Table of Materials) à l'aide d'une matrice de séparation appropriée ( Table ofMaterials) pour l'instrument et l'ensemble de teinture du système multiplex.
- Analyse des données
- Analysez les données à l'aide d'un logiciel d'analyse des fragments d'ADN et comparez les allèles POC aux allèles parentaux pour déterminer leur origine.
- Configurez une norme de taille.
REMARQUE: Cela permet au logiciel de reconnaître l'échelle qui est utilisée dans le système STR multiplex, et d'attribuer des paires de base aux amplicons en fonction de l'échelle. Les étapes suivantes sont pour un logiciel spécifique (Tableau des matériaux) mais peut être utile pour la mise en place d'autres types de logiciels ainsi.- Ouvrez le logiciel. Cliquez sur Démarrer le nouveau projet, puis sur New Size Standard.
- Donnez un nom à la norme de taille (p. ex., ABI-600).
- Dans la boîte nommée Entrez nouvelle définition de la normede taille : entrez ce qui suit : 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Cliquez ensuite sur Ajouter de la taille.
REMARQUE : Les numéros saisis apparaîtront sous la case de droite, qui est nommée Définition standard de la taille actuelle (voir figure 5). - Cliquez sur Enregistrer.
- Pour importer et analyser un fichier, cliquez sur Ajouter des fichiers, et choisissez le fichier fsa à analyser. Cliquez sur Ajouter des fichiers sélectionnés, puis sur OK. Ensuite, suivez ces étapes:
- Localisez la colonne Taille Standard et choisissez ABI-600 (ou quel que soit le nom donné à la norme de taille).
- Dans le cadre de la méthode d'analyse,cliquez sur Dimensionnement par défaut - NPP, puis cliquez sur le bouton Analyse verte.
- Le fichier est maintenant prêt à être consulté. Ajuster les options d'affichage pour afficher les données comme vous le souhaitez.
- Dépannage - méthode d'analyse
REMARQUE: Le logiciel peut parfois ne pas identifier les pics et les aligner correctement. Cela se produit lorsque les pics sont trop bas ou trop élevés. Les deux méthodes d'analyse suivantes peuvent être corrigées et doivent être essayées avant qu'un échantillon ne soit retesté.- Méthode d'analyse 1 pour les pics élevés :
- Cliquez sur la nouvelle méthode d'analyse et nommez-la High Peaks (ou un autre nom selon vos préférences personnelles).
- Cliquez sur Gamme, puis sur La plage partielle pour l'analyse et le dimensionnement. Ensuite, tapez 100 pour le point de départ et la taille de départ.
- Pour le point d'arrêt, entrez 10 000. Pour la taille d'arrêt,entrez 1000.
- Ensuite, cliquez sur les hauteurs minimales de pointe et de changer les chiffres de telle sorte que le seuil de pointe pour les couleurs est la suivante: Bleu: 50; Vert: 50; Jaune: 20; Rouge: 100; Orange: 5000.
- Enregistrer la nouvelle méthode d'analyse.
- Méthode d'analyse 2 pour les pics bas :
- Cliquez sur la nouvelle méthode d'analyse et nommez-la Low Peaks (ou un autre nom selon vos préférences personnelles).
- Cliquez sur Gamme, puis sur La plage partielle pour l'analyse et le dimensionnement. Ensuite, tapez 100 pour le point de départ et la taille de départ.
- Pour le point d'arrêt, entrez 10 000. Pour la taille d'arrêt,entrez 1000.
- Ensuite, cliquez sur Les drapeaux de qualité et de changer la plage de laissez-passer de telle sorte qu'il se lit de 0,5 à 1. Modifier la plage de faible qualité de telle sorte qu'il se lit de 0,0 à 0,0. Changement Supposons la linéarité à ce qui suit: de (bp) 100,0 à (bp) 800.0.
- Enregistrer la nouvelle méthode d'analyse.
REMARQUE: Il est maintenant possible de réanalyser un fichier en choisissant Low Peaks ou High Peaks selon la méthode d'analyse, puis en cliquant sur le bouton Analyse verte.
- Méthode d'analyse 1 pour les pics élevés :
Figure 5 : Capture d'écran montrant l'éditeur standard de taille. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Cytométrie de flux
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Choisir le bloc FFPE idéal
- À l'aide de diapositives H et E et d'un microscope léger, sélectionnez un bloc FFPE qui a environ 50 à 70 % de ses tissus composés de CV.
REMARQUE : La figure 6 est un exemple représentatif d'un bloc approprié pour l'analyse de cytométrie du débit, car elle est composée d'environ 50 % de CV (la moitié droite de la section) et de 50 % de tissus maternels (moitié gauche). La présence de tissus maternels est importante parce qu'ils servent de contrôle interne pour le pic diploïde. - Pour les blocs qui n'ont pas la quantité idéale de CV, enrichissez-vous pour le CV au fur et à mesure que la section est effectuée. Pour ce faire, identifier de quel côté des sections fraîchement coupées contient plus de CV selon sa diapositive correspondante. Sur cette base, utilisez une lame pour couper l'autre moitié qui doit être jeté afin d'enrichir pour CV.
REMARQUE : La figure 7 montre un bloc qui n'a pas suffisamment de CV pour l'analyse de cytométrie du débit. Pour des blocs comme celui-ci, les sections doivent être coupées de telle sorte que la moitié qui contient moins de CV est jetée afin d'augmenter les quantités de CV par rapport aux tissus maternels, comme le montre la figure. Assurez-vous de couper plus de sections pour compenser ce qui est jeté.
- À l'aide de diapositives H et E et d'un microscope léger, sélectionnez un bloc FFPE qui a environ 50 à 70 % de ses tissus composés de CV.
Figure 6 : Section H et E représentant un bloc POC idéal pour la cytométrie du débit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Section H et E représentant un bloc plus difficile pour la cytométrie du débit. Cette section représentative de la H-E montre que seule la moitié inférieure de cette section doit être utilisée pour l'analyse de la cytométrie du débit, dans le but d'enrichir pour le CV. La zone décrite, étiquetée « CV », est principalement composée de CV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Sectionnement
- Laisser les blocs sur la glace pendant 15 min pour faciliter le sectionnement.
- À l'aide du meilleur bloc FFPE possible, couper quatre sections de 50 m d'épaisseur (ou deux sections de 100 m d'épaisseur) à l'aide d'un microtome.
REMARQUE: Pour la cytométrie de flux, il est préférable d'avoir des sections plus épaisses. - Dans le cas où un bloc FFPE idéal n'est pas disponible, visez à maintenir le rapport CV/tissu maternel néanmoins. Par exemple, si seulement 30 % du bloc est constitué de CV alors que le reste a des tissus maternels, retirez au moins la moitié de la section qui contient les tissus maternels et utilisez plus de sections pour compenser (voir la figure 7).
- Placer les sections dans des tubes étiquetés de 15 ml.
REMARQUE: Assurez-vous de ruban adhésif sur les étiquettes parce que les réactifs organiques utilisés dans l'étape suivante peuvent dissoudre et enlever l'encre.
- Protocole de cytométrie de flux à partir de tissus FFPE
- Déparaffinisation et réhydratation
- Effectuer les lavages suivants (tableau 3) sous une hotte de fumée.
- Remplir le tube de 15 ml de 6 ml du réactif approprié, suivant l'ordre présenté dans le tableau 3, laisser les sections dans les réactifs pour la durée respective, puis retirer le réactif à l'aide d'aspiration sous vide et d'une pipette Pasteur en verre.
- Entre chaque étape, trempez la pipette Pasteur d'abord dans 70% d'éthanol, puis dans de l'eau distillée, puis passez à l'étape suivante.
- Soyez très prudent de ne pas enlever les morceaux de tissu avec le réactif. Inclinez le tube de 15 ml à un angle de 60 degrés pour faciliter l'aspiration du réactif liquide sans dessiner de tissus.
MISE EN GARDE: Les liquides jetés contiennent du xylène et doivent être éliminés dans des contenants de déchets de xylène.
- Préparation de la solution
- Préparer la solution de citrate en dissolvant 2 g d'acide citrique dans 1 L d'eau double distillée. Amenez le pH à 6. Conserver à 4 oC.
- Préparer la solution de pepsine en dissolvant 0,01 g de pepsine en 2 ml de 9 parties par millier de NaCl, pH 1,64. C'est pour un échantillon.
MISE EN GARDE: La pepsine est toxique et peut facilement se disperser et s'envoler. Portez un masque lors de la manipulation de la pepsine sous sa forme de poudre et essuyez toute la zone de travail après l'avoir utilisé. - Propidium Iodide (PI)-ribonuclease Préparation d'une solution pour un échantillon.
- Mélanger 50 l'IP avec 450 oL de PBS (pour diluer 10x).
- Ajouter 50 ll de ribonuclée A (1 mg/ml) au mélange. Conserver enveloppé dans du papier d'aluminium en tout temps.
- Digestion et coloration
- Ajouter une solution de citrate de 4 oC aux tubes de 15 ml, puis placer dans un bain d'eau de 80 oC pendant 2 h.
- Laisser refroidir la solution à température ambiante (15 min). Retirez la solution de citrate.
- Ajouter 6 ml de 1x PBS, vortex, et attendre 1/2 min pour permettre aux tissus de se déposer au fond. Retirez le 1x PBS à l'aide d'aspiration sous vide et d'une pipette Pasteur en verre.
- Ajouter 1 ml de solution de pepsine (préchauffé e à 37 oC) et placer dans un bain sec de 37 oC pendant 30 min. Vortex toutes les 10 min. Préparer la solution PI-ribonuclease A dans les 10 dernières min de cette incubation.
- Ajouter 6 ml de 1x PBS, vortex, et attendre 1/2 min pour permettre aux tissus de se déposer au fond. Retirez le 1x PBS à l'aide d'aspiration sous vide et d'une pipette Pasteur en verre.
- Ajouter 550 ll de la solution PI-ribonuclease A et placer les échantillons dans un bain sec de 37 oC pendant 30 min.
REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être enveloppés dans du papier d'aluminium et laissés pendant la nuit à 4 oC jusqu'au lendemain matin. - Filtrer la solution à l'issue d'un maillage de filtration de 48 m. Recueillir le filtrate dans des tubes à fond rond en polystyrène, qui peuvent être utilisés avec le cytomètre d'écoulement. Utilisez des forceps pour placer un morceau de maille de filtration de 5 cm sur 5 cm dans la partie supérieure du tube, de sorte que le liquide peut être taché à travers le maillage et dans le tube.
REMARQUE: Les échantillons sont maintenant prêts à être exécutés avec le cytomètre de débit. Gardez-les enveloppés dans du papier d'aluminium jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être exécutés.
- Exécutez des échantillons avec un cytomètre de débit à l'aide du technicien de la plate-forme de cytométrie de flux de l'organisation.
REMARQUE: Le canal PE est utilisé pour détecter l'ADN taché d'IP et le débit doit être réglé pour ralentir lors de l'acquisition. Assurez-vous que la tension est choisie de telle sorte que le pic diploïde est à peu près à 200 le long de l'axe X PE-A pour faciliter l'analyse et l'interprétation. Visez à enregistrer un minimum de 20 000 événements par échantillon.
- Déparaffinisation et réhydratation
| Réactif utilisé (6 ml chacun) | durée |
| 1) Xylène | 2 x 10 min |
| 2) 100% éthanol | 2 x 10 min |
| 3) 95% d'éthanol | 10 min |
| 4) 70% éthanol | 10 min |
| 5) 50% d'éthanol | 10 min |
| 6) Eau distillée | 2 x 10 min |
Tableau 3 : Réactifs et durées de déparaffinisation et de réhydratation.
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Analyse des données de cytométrie de flux
- Analyser les données à l''eau à l'eide urétique des flux(Tableau des matériaux).
REMARQUE: Les étapes suivantes sont pour un logiciel spécifique (Tableau des matériaux) mais peut être utile pour la mise en place d'autres types de logiciels ainsi.- Après avoir analysé les échantillons sur un cytomètre de débit, téléchargez les fichiers FCS 2.0 pour analyse.
- Ouvrez le logiciel d'analyse de cytométrie de flux, cliquez sur Fichier ( Nouveau document.
- Cliquez sur l'icône
Histogram ( ), puis faites glisser le pointeur pour faire un rectangle. - Parcourez le fichier FCS, puis cliquez sur Open. Le long de l'axe x, cliquez sur FCS-A, puis sélectionnez PE-A.
- Cliquez sur l'icône
Dot Plot ( ) puis faites glisser le pointeur pour créer un autre rectangle sous l'intrigue de l'histogramme. Ensuite, naviguez pour le même fichier FCS qui a été sélectionné pour l'histogramme. - Changer l'axe x de la parcelle de point à PE-A et l'axe y à PE-W.
REMARQUE : La figure 8A démontre l'apparence des parcelles à ce stade. - Cliquez sur l'icône Région
( ) et dessinez une case sur l'intrigue à points qui commence avant le pic diploïde (environ 100 sur l'axe x de la figure 8B) et qui se termine autour de 700 sur l'axe x, comme le montre l'intrigue à points de la figure 8 B.
REMARQUE: Le pic diploïde de la figure 8 est à peu près à 200 sur l'axe X. Ceci est choisi arbitrairement car les échantillons sont enregistrés à travers le cytomètre de débit, simplement pour faciliter l'analyse et l'interprétation des résultats. - Cliquez sur Terrain (fr) Modifier les régions / Portes, puis tapez R0 dans la cellule qui est à côté de la cellule G0 sous stratégie. Cliquez ensuite sur Fermer.
- Cliquez n'importe où sur l'histogramme, puis sur terrain ( Format Plot/Overlay. Sous la porte,sélectionnez G0 et R0, puis cliquez sur OK.
REMARQUE: C'est l'étape de gating qui permet de mieux visualiser les pics ploidy. L'histogramme devrait maintenant ressembler à l'histogramme de la figure 8B. Il est possible de jouer avec la porte créée (en déplaçant la boîte tirée à l'étape 2.4.1.7) afin de se concentrer sur des régions spécifiques de la parcelle de point. - Pour étiqueter les parcelles, cliquez
sur l'icône de la zone de texte ( ), puis faites glisser le pointeur pour créer une boîte en haut du document, puis tapez les informations suivantes : ID patient, ID POC et le bloc utilisé (puisqu'il peut y avoir plusieurs blocs pour un POC) , pourcentage de CV présent sur le bloc, tension utilisée pour faire fonctionner l'échantillon et date.
- Analyser les données à l''eau à l'eide urétique des flux(Tableau des matériaux).
Histogram ( ), puis faites glisser le pointeur pour faire un rectangle.
Dot Plot ( ) puis faites glisser le pointeur pour créer un autre rectangle sous l'intrigue de l'histogramme. Ensuite, naviguez pour le même fichier FCS qui a été sélectionné pour l'histogramme.
( ) et dessinez une case sur l'intrigue à points qui commence avant le pic diploïde (environ 100 sur l'axe x de la figure 8B) et qui se termine autour de 700 sur l'axe x, comme le montre l'intrigue à points de la figure 8 B.
sur l'icône de la zone de texte ( ), puis faites glisser le pointeur pour créer une boîte en haut du document, puis tapez les informations suivantes : ID patient, ID POC et le bloc utilisé (puisqu'il peut y avoir plusieurs blocs pour un POC) , pourcentage de CV présent sur le bloc, tension utilisée pour faire fonctionner l'échantillon et date.
Figure 8 : Capture d'écran affichant un histogramme et une parcelle de point d'un échantillon représentatif qui n'est pas gated (A) et fermé (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Representative Results
La complexité des tissus molaires et le fait qu'ils peuvent avoir divers génotypes nécessite une analyse rigoureuse et l'utilisation de plusieurs méthodes telles que l'évaluation morphologique, l'immunohistochimie p57, le génotypage microsatellite, la cytométrie du débit et le FISH. Par exemple, un patient (1790) a été référé avec deux PHM qui se sont avérés être triploïdes par l'analyse de microarray des POC seulement. Le patient a été donc diagnostiqué avec PHM récurrent. Le génotypage microsatellite de ses deux « PHM » ainsi que l'ADN du patient et de son partenaire ont révélé que, bien que la première taupe du patient soit la dispermique triploïde(figure 9A),son deuxième « PHM » a un génotype digynique triploïde (figure 9 B) et n'est donc pas un PHM, mais une fausse couche non-molaire.
Le premier marqueur de la figure 9A (en noir) montre deux pics dans le POC. Le premier pic provient de la mère, puisque seule la mère a un pic de cette taille. Suivant le même raisonnement, le deuxième pic provient du père puisqu'il partage le même allèle. Remarquez comment le deuxième pic est beaucoup plus élevé que le premier, ce qui indique qu'il ya probablement deux doses du même allèle paternel dans ce pic. La contamination maternelle, qui sera expliquée plus en détail plus tard, est très minime dans ce POC parce que le POC affiche un pic très minuscule à la position du deuxième allèle maternel.
Le deuxième marqueur de la figure 9A (en bleu) montre trois pics dans le POC. Deux de ces sommets proviennent du père et un de la mère. Ainsi, il ressort de ce marqueur qu'il y a trois allèles présents dans le POC, deux du père et un de la mère. Les troisième et quatrième marqueurs de la figure 9A sont semblables au premier marqueur et montrent également deux allèles provenant du père et un de la mère.
Puisque les quatre marqueurs montrent uniformément trois allèles (par dose ou par la présence de trois allèles de différentes tailles), deux provenant du père et un de la mère, on peut conclure que ce POC est dispermique triploïde, et confirme le diagnostic de PHM.
Les quatre marqueurs de la figure 9B montrent à nouveau trois allèles : le premier marqueur montre deux doses dans le premier pic qui proviennent de la mère et une dose dans le deuxième pic qui provient du père. Les deuxième et quatrième marqueurs montrent trois pics différents (c.-à-d. trois allèles différents), dont deux proviennent de la mère. Le troisième marqueur montre une dose dans le premier pic provenant du père et deux doses dans le deuxième pic provenant de la mère. Par conséquent, ce POC est digynic triploïde d'origine puisque deux ensembles de chromosomes viennent de la mère et un ensemble vient du père. Il s'agit donc d'une fausse couche non molaire.
Figure 9 : Résultats représentatifs du génotypage du patient 1790. (A) Sélectionnez les résultats du génotypage de la première conception du patient montrant un génotype dispermique triploïde. (B) Sélectionnez les résultats de génotypage de la deuxième conception du patient montrant un génotype digynique triploïde. L'axe X est en paires de base; les étiquettes et les tailles de paire de base ont été omises pour la simplicité. L'axe y représente la hauteur de pointe et est également omis de la figure pour la simplicité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Ce patient a été au commencement mal diagnostiqué avec deux PHM et s'inquiétait d'un plus grand risque de plus de taupes tandis qu'elle a eu un PHM simple. Ce cas accentue la limitation du microarray de SNP sur le seul POC. Le microréseau SNP est une méthode puissante et est la meilleure pour détecter les aneuploidies de n'importe quel chromosome (trisomies, monosomies, ou génotypes non-diploïdes); cependant, lorsqu'il est effectué sur le SEUL POC sans analyser l'ADN parental, l'origine du triploïde ne peut pas être déterminée. Pour plus d'explications sur l'analyse et l'interprétation du génotype, veuillez consulter l'étude de Murphy et coll.16.
Les résultats représentatifs de la figure 10A sont d'une conception triploïde. Les valeurs de l'axe X représentent la teneur en ADN nucléaire. Par exemple, 200 est un nombre arbitraire donné aux cellules qui contiennent une certaine quantité de contenu d'ADN nucléaire. Par conséquent, un pic à 400 représente des cellules qui contiennent le double de la quantité de contenu d'ADN nucléaire par rapport au pic de 200. Le petit pic autour de 300 représente la teneur en ADN nucléaire qui se situe entre le pic de 200 et 400 et est donc le pic triploïde. Remarquez comment une conception diploïde (Figure 10B) ne contient aucun pic à la valeur 300.
Dans certains cas, le pic triploïde est très subtil (Figure 10C). Chaque fois qu'un pic triploïde à peine perceptible est noté, il est important de considérer d'abord la quantité de CV qui étaient présents dans les sections utilisées pour l'analyse de cytométrie de flux. Si les sections avaient moins d'environ 20% CV, alors il sera probablement un triploidy vrai car il est prévu d'être un pic très faible. Si les sections prises avaient de grandes quantités de CV, le POC devient méfiant du mosaïsme avec la présence d'une autre population cellulaire diploïde. Cela peut être vérifié en réexaminant les résultats de génotypage pour voir s'ils correspondent à une dispermie triploïde parfaite ou peut également être confirmé par FISH avec des sondes des chromosomes X, Y et 18. En outre, en utilisant le logiciel décrit dans cet article, il est possible de définir des portes spécifiques, comme décrit dans la section 2.4.1, qui permettent à l'utilisateur de se concentrer sur une région spécifique à enrichir pour les cellules triploïdes si elles existent vraiment.
Figure 10 : Résultats de cytométrie de flux représentatifs démontrant des conceptions triploïdes dans (A) et (C), et une conception diploïde dans (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
HM sont des grossesses humaines anormales avec des étiologies hétérogènes et ont différents types histologiques et génotypiques, ce qui rend leur classification précise et le diagnostic difficile. L'évaluation morphologique histopathologique s'est souvent avérée inexacte et n'est donc pas fiable en soi pour classer HM en CHM et PHM et les distinguer des fausses couches non-molaires. Par conséquent, un diagnostic précis de HM exige l'utilisation d'autres méthodes telles que le génotypage d'ADN microsatellite multiplex, l'analyse de ploidy par cytométrie de flux, l'analyse de ploidy par FISH, et l'immunohistochemistry de p57KIP2. Chacune de ces méthodes a ses propres limites et avantages.
Limitations et avantages du génotypage multiplexe et de la cytométrie du débit
La contamination maternelle est l'un des problèmes les plus courants lorsqu'il s'agit de travailler avec des tissus FFPE et peut conduire à un diagnostic erroné, soulignant ainsi l'importance de séparer la mère des tissus POC. Il est important d'identifier la contamination maternelle afin d'avoir une idée de ce qu'il faut attendre des pics de génotypage et d'aider à leur interprétation. Si le niveau de contamination est trop élevé et empêche une interprétation fiable des résultats, alors répétez l'isolement et l'extraction de l'ADN, en prenant un soin supplémentaire dans l'élimination de tous les tissus maternels possibles. Dans les régions où la morphologie des tissus n'est pas claire, il est préférable d'enlever ces régions pour minimiser les risques de contamination maternelle. Le premier avantage de la méthode décrite dans ce protocole, en plus de son coût inférieur, est que les tissus maternels sont retirés des diapositives tandis que d'autres méthodes consistent à recueillir des tissus POC (en les couvrant avec une solution qui polymérise lorsqu'ils sont exposés à l'air et soulever les tissus) sans enlever les tissus maternels. La méthode décrite ici permet donc de jeter un second regard sur les tissus POC restants, de les renettoyer si nécessaire, comme c'est souvent le cas, puis de recueillir et d'extraire l'ADN d'eux. Le deuxième avantage est que nous nettoyons les tissus sur les sections tachées de H et E non-reprises, ce qui facilite grandement l'ablation des tissus maternels, par opposition à l'utilisation de sections non tachées et d'une diapositive de carte glissée. Cependant, la coloration supplémentaire peut encore dégrader l'ADN, et cela est compensé par l'ajout de sections supplémentaires.
La disponibilité de l'ADN parental pour l'analyse est un autre défi. La présence des deux parents facilite grandement l'analyse et l'interprétation des résultats du génotypage. Malheureusement, il arrive assez souvent que l'ADN du père n'est pas disponible, ce qui peut parfois compliquer l'analyse, en particulier dans les cas où la qualité de l'ADN POC est médiocre en raison de la fixation préalable ou de l'entreposage à long terme (plus fréquent lorsque vous travaillez avec HM récurrent). En outre, le sang maternel peut ne pas toujours être disponible pour l'extraction de l'ADN. Dans de tels cas, l'ADN maternel peut être extrait des tissus endométrials maternels présents dans les blocs de FFPE comme précédemment décrit16. En outre, la caractérisation des tissus molaires résultant de l'utilisation de technologies de procréation assistée peut compliquer l'analyse du génotype microsatellite parce que, dans la plupart des cas, l'ADN des donneurs (mâles ou femelles) n'est généralement pas disponible.
Enfin, le fait que les pics plus grands tendent à être plus courts en termes de hauteur de pointe est une autre source possible de confusion, en particulier lorsque les hauteurs de pointe doivent être utilisées pour déterminer s'il y a deux doses ou une dose dans un seul pic. Une façon de surmonter cela est de toujours garder à l'esprit que les pics de grande taille allèle (nombre de paires de base) ont tendance à être plus courts, en raison de la nature dégradée de l'ADN des tissus FFPE, ce qui rend moins d'ADN disponible pour l'amplification des allèles plus grands. En outre, une amplification plus courte de fragment de PCR prend moins de temps qu'un plus grand, et l'amplification exponentielle de l'ADN mène à moins de quantités d'allèles plus grands.
Le principal inconvénient de la cytométrie de flux est que les conceptions triploïdes peuvent parfois être manquées, et cela pourrait être dû à des quantités insuffisantes de CV dans le bloc. Cependant, la présence d'un pic triploïde est une indication concluante d'un triploïde. Notez que cette méthode n'est pas assez sensible pour détecter les trisomies, les conceptions tétraploïdes, ou d'autres aneuploidies en utilisant ce protocole. Les conceptions tétraploïdes ne sont pas détectables par ce protocole parce que le pic tétraploïde correspond au même pic de cellules diploïdes dans la phase G2 du cycle cellulaire.
Connaître ces limites et ces défis aide à réduire les erreurs. Il est donc important et parfois nécessaire d'analyser le même tissu avec différentes méthodes, de comparer les résultats et de s'assurer qu'ils sont en accord les uns avec les autres. Si ce n'est pas le cas, les résultats doivent être réexaminés et les analyses doivent être répétées. Pour les cas qui ont montré des résultats contradictoires, les divergences ont été résolues simplement en répétant les expériences et en prenant soin d'éviter le problème initial. Dans d'autres cas, des divergences ont été résolues en exécutant des méthodes additionnelles telles que FISH sur des sections de tissu ou en effectuant le génotypage simplex additionnel avec les marqueurs appropriés.
Identification de la contamination maternelle
En ce qui concerne l'identification de la contamination de l'ADN POC avec l'ADN maternel, le niveau de contamination sera reflété ou reconnu par la présence de tous les allèles maternels à tous les loci dans le POC, en plus de l'allèle maternel qui sont transmis au POC.
Dans la figure 11A, les pics provenant de la contamination par l'ADN maternel sont étiquetés avec un « c ». Remarquez comment chaque pic marqué d'un "c" est également présent chez la mère, et nous voyons ces pics "c" dans les trois marqueurs. Notez que pour le deuxième marqueur (en bleu), le pic de contamination maternelle indiqué par un "c" est plus élevé que chaque pic "c" au premier marqueur parce que la mère est homozygote pour le deuxième marqueur; la hauteur du contaminant est donc doublée pour ce marqueur. Dans ce POC, il n'y a pas de pics dérivés de la mère. En d'autres termes, ce POC n'a hérité d'aucun allèle de la mère. Il n'y a qu'un seul pic réel à chaque marqueur et ce pic n'est pas présent chez la mère. Nous savons donc que les vrais sommets doivent provenir du père. Avec l'information de ploidy de l'analyse de cytométrie de karyotype ou de flux démontrant la diploïde, il est possible de conclure que ce POC est à la fois androgénétique dans l'origine et le diploïde.
De plus, ces trois marqueurs de la figure 11A révèlent qu'il n'y a toujours qu'un seul pic réel pour chaque marqueur. Seulement trois marqueurs sont illustrés ici, cependant, les kits de multiplex viennent souvent avec beaucoup plus de marqueurs qui révéleront également le même modèle. Puisque ce POC est diploïde, il doit y avoir deux doses dans chaque pic. Avec cette information, nous pouvons conclure que ce POC est monospermique androgénétique et est homozygote à chaque marqueur.
La figure 11B représente un POC biparental diploïde. La petite barre noire à travers le premier pic du premier marqueur (en vert) représente la quantité estimée de contamination qui est présente dans ce pic réel. Le « R » indique la partie réelle de ce pic provenant de l'ADN POC; le « c » représente la partie contaminante de ce pic provenant de l'ADN maternel. Comment peut-on identifier le niveau de contamination? Il est possible, dans ce cas, quand un marqueur est hétérozygote chez la mère parce que l'un des allèles maternels est absent dans le POC. Le petit pic dans le premier marqueur étiqueté avec « c », par exemple, indique que c'est le niveau de contamination auquel on devrait s'attendre pour l'autre pic héréditaire maternel. Par conséquent, tous les pics POC d'origine maternelle sont légèrement plus élevés que les pics hérités paternellement en raison de la faible quantité supplémentaire de contamination. Pour le troisième marqueur (en noir) de la figure 11B, le niveau de contamination devrait être le double de la quantité habituelle (parce que la mère est homozygote pour ce marqueur spécifique), et on peut donc déduire qu'il n'y a qu'une seule dose dans le premier pic dans le POC.
La figure 11C illustre un POC dispermique triploïde. Le premier marqueur (en vert) montre trois pics dans le POC. Étant donné que ces trois sommets ont des hauteurs similaires, il est possible de conclure que ce POC est probablement triploïde. Notez que le troisième pic de ce marqueur est plus court que le premier. On s'attend à cela parce que, comme tendance générale, les pics plus importants ont tendance à être plus courts. Le deuxième pic est légèrement plus élevé que le premier, et cela peut être expliqué par une petite quantité de contamination maternelle, comme indiqué par le bar et «c». De plus, deux de ces trois sommets ne sont pas présents chez la mère et doivent donc provenir du père. Jusqu'à présent, ce marqueur indique que le POC pourrait être triploïde (ou une trisomie) et que l'origine de l'ensemble supplémentaire de chromosomes est paternelle. Il indique également qu'il s'agit d'une conception dispermique, puisque le POC a hérité de deux allèles différents du père.
Le deuxième marqueur (en bleu) de la figure 11C n'a que deux sommets. Après avoir tenu compte du niveau de contamination, le deuxième pic semble plus élevé que le premier, et ce, malgré la tendance générale pour que les pics plus importants soient plus petits (une tendance qui doit toujours être gardée à l'esprit pendant l'analyse). Ainsi, il est probable qu'il y ait deux doses dans ce pic. Ceci est également soutenu par le fait que le premier marqueur est indicatif de triploidy.
Enfin, le troisième marqueur (en noir) de la figure 11C montre trois pics, encore une fois indicatifs de triploïde. Puisque la plupart des marqueurs dans des kits de multiplex viennent de différents chromosomes, il est possible de conclure avec confiance qu'un POC est triploïde après avoir observé la même tendance de trois allèles à travers plusieurs marqueurs différents. Notez également de ce marqueur que deux des trois pics proviennent du père, confirmant l'origine dispermique.
Figure 11 : Résultats du génotypage illustrant l'effet de la contamination maternelle. Les panneaux supérieurs montrent les allèles qui appartiennent au POC et les panneaux inférieurs montrent ceux qui appartiennent à la mère. Dans (A), le POC est monospermique androgénétique et le niveau de contamination est mis en évidence par une flèche et la lettre "c". Dans (B), le POC est biparental diploïde, et le niveau de contamination est mis en évidence par la lettre "c". Dans (C), le POC est triploïde dispermique et le niveau de contamination est mis en évidence par la lettre "c". Les petites barres noires montrent combien de hauteurs de pointe provient de la contamination maternelle et doivent donc être prises en considération lors de la comparaison des hauteurs de pointe. L'axe X est en paires de base; les étiquettes et les tailles de paire de base ont été omises pour la simplicité. L'axe y représente la hauteur de pointe et est également omis de la figure pour la simplicité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Exemples de cas difficiles
Dans un certain nombre de cas, il n'a été possible d'arriver à une conclusion qu'en ayant les trois évaluations simultanément (c.-à-d. flux, p57KIP2, et génotypage multiplexe). Par exemple, un cas (808) a été appelé fausse couche non molaire. L'évaluation histopathologique a mené au soupçon d'une conception molaire et de l'analyse de génotypage du POC a indiqué un marqueur qui a clairement montré trois crêtes (deux du père et un de la mère). Les résultats dup57 KIP2 n'ont pas été concluants. L'analyse de cytométrie de flux a indiqué un petit pic triploïde qui a été confirmé avec l'analyse de FISH, qui a également exclu la présence d'une autre population cellulaire diploïde. Avec la confirmation de FISH, il a été possible de conclure que le POC est en effet une taupe dispermique triploïde.
Un autre cas (1192) a également été appelé fausse couche non molaire. Le CV de ce POC ont été mélangés avec des tissus maternels et étaient fortement nécrotiques aussi bien, rendant le processus de nettoyage très provocant. Par conséquent, la première analyse de génotypage a montré un niveau élevé de contamination maternelle, de sorte que chaque allèle maternel pouvait être vu dans le POC (une bonne indication de la contamination possible). En outre, le p57KIP2 n'était malheureusement pas concluant, probablement en raison de la nature nécrotique du tissu, peut-être en raison de la fixation retardée. Les résultats de cytométrie de flux, cependant, étaient indicatifs de triploidy, qui a été également confirmé par FISH. L'ADN a été réextrait dans le but de réduire le niveau de contamination et d'enlever les tissus avec une morphologie peu claire. L'analyse des nouveaux résultats de génotypage, tout en tenant compte de la présence probable de contamination maternelle, nous a permis de conclure que le POC était un PHM dispermique dispermique triploïde XXY.
Le tableau 4 décrit les méthodes typiques utilisées pour l'analyse. Il est recommandé d'utiliser l'évaluation morphologique et l'immunohistochimie p57KIP2 sur tous les tissus suspects de HM et au moins une méthode de génotypage. Parmi les méthodes de génotypage, la plus informative est le génotypage multiplex de l'ADN. Lorsque les résultats entre les différentes méthodes ne sont pas concordants ou lorsque certains résultats ne sont pas concluants, d'autres méthodes de génotypage doivent être utilisées. Le tableau montre les résultats concordants attendus pour chaque type de HM possible ainsi que de rares exceptions et recommandations pour les résoudre.
Tableau 4 : Ordre d'analyse typique, résultats attendus et rares exceptions ainsi que des recommandations pour les résoudre. L'immunohistochimie P57KIP2 vise à détecter l'expression de p57KIP2, la protéine codée par le gène CDKN1C. Ce gène est paternellement imprimé dans le cytotrophoblaste et le stroma villous du placenta du premier trimestre et n'est exprimé que par le génome maternel. Il est donc utilisé comme marqueur auxiliaire pour détecter, de manière facile et peu coûteuse, la présence du génome maternel dans le POC. Il est recommandé d'effectuer l'immunohistochimie p57KIP2 pour tous les POC soupçonnés d'être HM en parallèle à l'évaluation morphologique. Dans le laboratoire de l'auteur, les anticorps et les plates-formes p57KIP2 indiqués dans le Tableau des matériaux sont utilisés et les auteurs sont très satisfaits de la qualité des résultats. Abréviations : IHC et immunohistochimie; Trempette et diploïde androgénétique; Trempette Bip et biparental diploïde; Chr et chromosome; MC - fausse couche; et tP et la prolifération trophoblastique.
Au meilleur de la connaissance des auteurs, cet article est le premier à fournir des protocoles détaillés pour la cytométrie de flux aussi bien que le génotypage d'ADN microsatellite de multiplex à faible coût et de haute qualité des tissus de POC de FFPE. L'interprétation des résultats est également décrite, ainsi que leur dépannage et leur intégration avec ceux d'autres méthodes pour parvenir à des conclusions précises et des diagnostics de POC et DE HM. Les auteurs espèrent sincèrement que cet article peut être utile pour les chercheurs qui tentent de comprendre cette entité complexe.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Sophie Patrier et Marianne Parésy d'avoir partagé le protocole original de cytométrie du débit, et Promega et Qiagen d'avoir fourni des fournitures et des réactifs. Ce travail a été appuyé par le Réseau québécois en reproduction et l'Institut canadien de recherche en santé (MOP-130364) à R.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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