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Genetics

Pulitura del DNA microsatellite e citometria di flusso Ploidy Analisi dei tessuti molari Molari Molari Molar fissati di paraffino fissati in parina

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60366

Summary

Le talpe idatidiformi sono gravidanze umane anomale con aeziologie eterogenee che possono essere classificate in base alle loro caratteristiche morfologiche e al contributo dei genitori ai genomi molare. Qui, i protocolli di genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex e citometria di flusso dei tessuti molari incorporati in paraffina fissati in formalina sono descritti in dettaglio, insieme all'interpretazione e all'integrazione dei risultati.

Abstract

La talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da un'eccessiva proliferazione trofoblastica e da uno sviluppo embrionale anormale. Esistono due tipi di HM basati sulla valutazione morfologica microscopica, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM). Questi possono essere ulteriormente suddivisi in base al contributo dei genitori ai genomi molare. Tale caratterizzazione dell'HM, mediante morfologia e analisi del genotipo, è fondamentale per la gestione del paziente e per la comprensione fondamentale di questa patologia intrigante. È ben documentato che l'analisi morfologica dell'HM è soggetta ad ampia variabilità interosservante e non è sufficiente da sola per classificare con precisione HM in CHM e PHM e distinguerli dagli aborti idropici non molare. L'analisi della genotipizzazione viene eseguita principalmente su DNA e tessuti da prodotti di concezione incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE), che hanno una qualità inferiore a quella ottimale e possono quindi portare a conclusioni errate. In questo articolo vengono forniti protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e l'analisi della citometria di flusso dei tessuti molari FFPE, insieme all'interpretazione dei risultati di questi metodi, alla loro risoluzione dei problemi e all'integrazione con la valutazione morfologica , l'immunosofochimicap57 KIP2 e l'ibridazione in situ (FISH) della fluorescenza in situ per raggiungere una diagnosi corretta e robusta. Qui, gli autori condividono i metodi e le lezioni appresi negli ultimi 10 anni dall'analisi di circa 400 prodotti di concepimento.

Introduction

Una talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da sviluppo embrionale anormale, iperproliferazione del trofoblasto e degenerazione ipicca di villi cirionico (CV). Storicamente, HM era diviso in due tipi, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM) basato solo sulla valutazione morfologica1. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica da sola non è sufficiente per classificare HM nei due sottotipi (CHM e PHM) e distinguerli da aborti non molori2,3,4.

Poiché CHM e PHM hanno diverse propensioni alle neoplasie, è quindi importante determinare con precisione il tipo genotypic di HM per fornire un adeguato follow-up e gestione ai pazienti. Di conseguenza, negli ultimi decenni, diverse metodologie sono state sviluppate ed evolute allo scopo di identificare il contributo dei genitori ai tessuti molari e raggiungere una corretta classificazione dell'HM. Questi includono l'analisi del cariotipo, il polimorfismo delle bande cromosomiche, la tipiagrafia sierologica dell'antigene leucocito umano (HLA), il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione, il numero variabile di ripetizioni tandem, la genotipizzazione dei microsatelliti, la citometria di flusso e il p57 immunohistochimica KIP2. Ciò ha permesso una suddivisione accurata delle concezioni HM in base al contributo dei genitori al loro genoma, come segue: CHM, che sono diploidi androgenetici o diploidi dispermiati, e PHM, che sono triploidi, dispermiche nel 99% e monospermico nell'1% dei casi5,6,7,8. Inoltre, c'è un altro tipo genotypic di HM che è emerso negli ultimi due decenni, che è biparentalo diploide. Quest'ultimo è per lo più ricorrente e può interessare un singolo membro della famiglia (casi simplex) o almeno due membri della famiglia (casi familiari). Queste talpe biparentali diploidi sono per lo più causate da mutazioni recessive in NLRP7 o KHDC3L nei pazienti9,10,11,12. Diploid biparentalHM in pazienti con mutazioni recessive in NLRP7 può essere diagnosticato come CHM o PHM da analisi morfologica e questo sembra essere associato con la gravità delle mutazioni nei pazienti13,14. Oltre alla classificazione della HM in base ai loro genotipi, l'introduzione e l'uso di diversi metodi di genotipizzazione hanno permesso la distinzione delle varie entità molare da aborti spontanei non molari, come le concezioni biparentali diploidi aneuploidi e altri tipi di concezioni5,15. Tali concezioni possono avere una certa proliferazione di trofoblasti e una morfologia villosa anormale che imitano, in una certa misura, alcune caratteristiche morfologiche di HM.

Lo scopo di questo articolo è quello di fornire protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e la citometria di flusso dei tessuti incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE), nonché analisi complete dei risultati di questi metodi e della loro integrazione con altri metodi per diagnosi corretta e conclusiva dei tessuti molari.

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Protocol

Questo studio di ricerca è stato approvato dal McGill Institutional Review Board. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso scritto per partecipare allo studio e per avere i loro prodotti FFPE di concepimento (POC) recuperati da vari reparti di patologia.

NOT: Mentre ci sono diversi metodi per la genotipizzazione e la determinazione ploidia per citometria di flusso, i protocolli qui forniti descrivono un metodo di analisi utilizzando una piattaforma per ciascuno.

1. Genotipizzazione

  1. Selezione del miglior blocco FFPE
    1. Per ogni prodotto FFPE del concepimento (POC), preparare 4 sezioni colorate di ematossia e ematosina (H&E) spesse a 4 m di spessore e di eosina (H&E), come descritto nelle sezioni 1.2 e 1.3, una per ogni blocco disponibile, per la valutazione morfologica mediante microscopia.
    2. Utilizzando i vetrini H&E e un microscopio luminoso, selezionare il blocco FFPE che ha la maggiore quantità di villi corionico (CV), e se possibile, il blocco che ha CV separato e non mescolato con, tessuti materni.
  2. Taglio
    1. Posizionare il blocco scelto sul ghiaccio per 15 min per facilitare il sezionamento.
    2. Regolare il microtoma per tagliare sezioni spesse 4 m per la valutazione morfologica microscopica e spesse 10 m per l'estrazione del DNA.
    3. Posizionare il blocco freddo nel microtome e tagliare una sezione da ogni blocco per la colorazione H&E e 10-30 sezioni dal blocco scelto, a seconda della quantità di CV nel blocco, per l'estrazione del DNA.
      NOT: Per i blocchi pieni di CV, 10 sezioni sono sufficienti per l'estrazione del DNA. Se solo circa il 10% del blocco contiene CV mentre il resto sono tessuti materni, allora sono necessarie 20-30 sezioni per garantire una quantità sufficiente di DNA.
    4. Utilizzando le pinze, trasferire ogni sezione a un bagno d'acqua di 45 gradi centigradi. Raccogliere la sezione dal bagno d'acqua con una diapositiva carica positivamente (Tabella dei materiali) che è precedentemente etichettato con il numero di identificazione del campione utilizzando una matita.
    5. Posizionare i vetrini che contengono le sezioni in forno a 65 gradi centigradi per consentire alle sezioni di aderire ai vetrini. Tenere i vetrini per H&E in forno per 25 min.
      NOT: Il tempo di incubazione più breve rende i tessuti leggermente meno aderenti alle diapositive e di conseguenza facilita la rimozione dei tessuti materni.
  3. Colorazione H&E
    1. Lasciare raffreddare gli scivoli a temperatura ambiente (10 min).
    2. Preparazione del reagente
      1. Preparare la soluzione di lavoro Eosin Y (0,25%) come da tabella 1. Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente.
      2. Preparare la soluzione di ematossilina funzionante diluindo la soluzione stock di ematossilina 5x in acqua (cioè mescolare 80 mL di acqua con 20 mL di ematossillina).
        NOT: Avvolgere la soluzione stock di ematossialina in lamina per lo stoccaggio.
    3. Preparare i vasetti di colorazione con i reagenti corretti sotto un cofano di fumi secondo la tabella 2.
    4. Eseguire la colorazione H&E immergendo i vetrini nei vasetti di colorazione appropriati per il periodo di tempo corretto in base alla tabella 2.
    5. Montare le 4 sezioni m per l'analisi morfologica con supporto di montaggio e coverslip con coperchi in vetro (Tabella dei materiali).
      NOT: Le 10 sezioni di 10 m per la genotipizzazione non devono essere ritagliate.
    6. Lasciare le sezioni da 10 m sotto il cofano fumatore per un minimo di 3 h affinché gli odori xileni tossici si dissipano.
      ATTENZIONE: Tutte le fasi di colorazione devono essere eseguite sotto un cappuccio di fumi. I prodotti Xylene devono essere tenuti sempre sotto il cofano perché gli odori di xilene sono tossici. Inoltre, lo xilene e l'ematossialina devono essere scartati in appositi contenitori. Una volta che questi contenitori sono pieni, devono essere scartati come raccomandato dall'organizzazione di sicurezza del laboratorio.
Reagente quantità
Soluzione azionaria Eosin Y (1%) 250 mL
80% Etanolo 750 mL
Acido acetico glaciale (concentrato) 5 mL

Tabella 1: Soluzione di lavoro Eosin Y (0,25%) preparazione.

Reagente utilizzato (100 mL per contenitore) durata
1) Sleonina 5 min
2) Sylene 5 min
3) 100% Etanolo 2 min
4) 95% Etanolo 2 min
5) 70% Etanolo 2 min
6) 50% Etanolo 2 min
7) Acqua distillata 5 min
8) Ematossina 4 min
9) Acqua distillata 5 min
10) Eosina 1 min
11) 95% Etanolo 5 min
12) 100% Etanolo 5 min
13) Slene 5 min
14) Xilene 5 min

Tabella 2: Reagenti e durate per il protocollo di colorazione H&E.

  1. Isolamento del CV
    1. Sotto uno stereoscopio leggero, utilizzare pinze e piccoli pezzi di salviette di carta idratate per l'acqua (Tabella dei materiali) per raschiare via i tessuti materni indesiderati da sezioni di 10 m di spessore H&E.
      NOT: L'obiettivo finale è quello di mantenere nient'altro che CV o membrane fetali (se presenti) sulle diapositive e quindi rimuovere tutti gli altri tessuti. Questo passaggio può richiedere un sacco di tempo e pazienza, a seconda del blocco, in quanto richiede un'attenzione meticolosa ai dettagli.
    2. Chiedi a una seconda persona di controllare i vetrini dopo la pulizia per assicurarti che siano privi di tessuti materni.
    3. Scattare foto delle diapositive pulite o documentare quanto segue per aiutare con l'interpretazione dei dati: 1) se il tessuto era difficile da pulire, emorragico, o molto pulito, 2) il numero di sezioni utilizzate, e 3) la quantità approssimativa di tessuti puliti.
      NOTA: La figura 1 fornisce un esempio di una diapositiva facile da pulire. Per un blocco contenente all'incirca questa quantità di CV, 10 sezioni sono sufficienti per l'estrazione del DNA. Lo slittamento in Figura 2 ha pochissimi CV che si mescolano con i tessuti materni, rendendo molto difficile e richiede molto tempo per pulire. Per un blocco contenente all'incirca questa quantità di CV, sono necessarie 30 sezioni per l'estrazione del DNA.
    4. Raccogliere il CV utilizzando piccoli pezzi inumiditi di salviette di carta. Usando le pinze, strappa un pezzetto dalle salviette di carta inumidite e usalo per raccogliere il CV.
    5. Posizionare i pezzi di carta con il loro CV attaccato in un tubo etichettato da 1,5 mL.
    6. Ridurre al minimo la quantità di salviette della carta utilizzate in questo passaggio, in quanto troppo può ostruire la colonna di estrazione del DNA e di conseguenza ridurre la quantità finale di DNA raccolto. In media, mirare a utilizzare meno di sette piccoli pezzi di salviette di carta per campione. Se ciò non è possibile a causa della presenza di grandi quantità di CV, dividere il campione tra due tubi per facilitare l'estrazione.

Figure 1
Figura 1: diapositiva rappresentativa per la genotipizzazione. In alto: uno scivolo che deve essere "pulito" per liberarsi dei tessuti materni. In basso: la stessa diapositiva mostrata dopo che è stata pulita e ora non contiene altro che CV per l'estrazione del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: diapositiva rappresentativa per la genotipizzazione. In alto: uno scivolo che deve essere "pulito" per liberarsi dei tessuti materni. In basso: la stessa diapositiva mostrata dopo che è stata pulita e ora non contiene altro che CV per l'estrazione del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Seguire il protocollo dell'estrazione del DNA dal kit FFPE (Tabella dei materiali) per eseguire l'estrazione del DNA.
    NOT: Alcuni kit raccomandano di utilizzare un buffer di eluizione da 15-20 gradi per l'eluizione finale. Per esperienza, l'eluizione con 15 l di tampone di eluizione funziona bene per la maggior parte dei campioni. Le diluizioni possono essere preparate dal DNA dello stock in base alle esigenze.
  1. Quantificazione del DNA
    1. Utilizzando un dispositivo spettrofotometro di laboratorio, caricare 1 ll di DNA e misurare l'assorbimento a 260 nm per la quantificazione.
    2. Caricare 1 l l di DNA su un gel di agarose del 2% ed eseguire l'elettroforesi del gel ad una tensione di 80-100 V per una valutazione qualitativa.
    3. Sulla base dei risultati dei passaggi 1.6.1 e 1.6.2, scegliere il volume del DNA da utilizzare nell'amplificazione della reazione a catena di polimerasi (PCR) a ripetizione lunga tandem (STR) multiplax. Obiettivo di utilizzare un minimo di 1000 ng di DNA nell'amplificazione PCR che segue.
      NOTA: Figura 3 mostra esempi rappresentativi di gel insieme alle concentrazioni del DNA (in base ai risultati dello spettrofotometro) e al volume della soluzione di DNA consigliata per la MULTIPLEx STR PCR che segue.

Figure 3
Figura 3: Gel rappresentativo per la quantificazione del DNA. Sono incluse le concentrazioni di ogni DNA, misurate utilizzando uno spettrofotometro, e le quantità utilizzate per la PCR multiplex. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Amplificazione PCR
    1. Eseguire la genotipizzazione microsatellite fluorescente utilizzando un sistema multiplex STR (Tabella dei materiali).
    2. Utilizzare le condizioni PCR illustrate nella Figura 4 per l'amplificazione PCR utilizzando il sistema multiplex STR ( Tabelladei materiali).
      NOT: In questo sistema multiplex STR vengono utilizzati i seguenti primer: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 e D.

Figure 4
Figura 4: condizioni del ciclo PCR per il sistema multiplex STR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Risolvere i prodotti PCR mediante elettroforesi capillare.
    1. Sospendere 1 l di ogni campione amplificato in 0,5 litri della corsia standard interna del sistema multiplex e 9,5 l di formamide altamente dionizzata (Tabella dei materiali).
    2. Eseguire i campioni attraverso uno strumento di elettroforesi capillare (Tabella dei materiali) utilizzando una matrice di separazione appropriata ( Tabella deimateriali) per lo strumento e il set di tinture del sistema multiplex.
  1. Analisi dei dati
    1. Analizzare i dati con un software di analisi del frammento di DNA e confrontare gli alleli POC con gli alleli dei genitori per determinarne l'origine.
    2. Impostare uno standard di dimensioni.
      NOT: Ciò consente al software di riconoscere la scala utilizzata nel sistema multiplex STR e di assegnare le basi agli amplificatori in base alla scala. I seguenti passaggi sono per un software specifico (Tabella dei materiali) ma può essere di aiuto per la configurazione di altri tipi di software pure.
      1. Aprire il software. Fare clic su Avvia nuovo progetto e quindi su Nuovo standard di dimensione.
      2. Assegnare un nome allo standard di dimensione (ad esempio, ABI_600).
      3. Nella casella Immetterela nuova definizione standard di dimensioni : immettere quanto segue: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Quindi fare clic su Aggiungi dimensioni.
        NOTA: i numeri immessi appariranno sotto la casella a destra, denominata Definizione standard dimensioni correnti (vedere la figura 5).
      4. Fare clic su Salva.
    3. Per importare e analizzare un file, fare clic su Aggiungi filee scegliere il file fsa da analizzare. Fare clic su Aggiungi file selezionati e quindi su OK. Quindi attenersi alla seguente procedura:
      1. Individuare la colonna Size Standard e scegliere ABI_600 (o qualsiasi nome assegnato allo standard di dimensione).
      2. In Metodo di analisi, fare clic su Ridimensionamento predefinito - NPP e quindi fare clic sul pulsante verde Analizza.
      3. Il file è ora pronto per la visualizzazione. Regolare le opzioni di visualizzazione per visualizzare i dati come desiderato.
    4. Risoluzione dei problemi - metodo di analisiTroubleshooting - analysis method
      NOT: Il software a volte potrebbe non riuscire a identificare i picchi e allinearli correttamente. Questo accade quando i picchi sono troppo bassi o troppo alti. I due metodi di analisi seguenti possono correggersi e devono essere provati prima che un campione venga sottoposto a test.
      1. Metodo di analisi 1 per picchi elevati:
        1. Fare clic su Nuovo metodo di analisi e denominarlo High Peaks (o un altro nome in base alle preferenze personali).
        2. Fare clic su Intervallo e quindi su Intervallo parziale per l'analisi e il dimensionamento. Digitare quindi 100 per Il punto iniziale e la dimensione iniziale.
        3. Per il puntodi arresto , immettere 10.000. Per Dimensione arresto, immettere 1000.
        4. Quindi fare clic su Altezze massime di picco e modificare i numeri in modo che la soglia di picco per i colori è la seguente: Blu: 50; Verde: 50; Giallo: 20; Rosso: 100; Arancione: 5000.
        5. Salvare il nuovo metodo di analisi.
      2. Metodo di analisi 2 per picchi bassi:
        1. Fare clic su Nuovo metodo di analisi e denominarlo Low Peaks (o un altro nome in base alle preferenze personali).
        2. Fare clic su Intervallo e quindi su Intervallo parziale per l'analisi e il dimensionamento. Digitare quindi 100 per Il punto iniziale e la dimensione iniziale.
        3. Per il puntodi arresto , immettere 10.000. Per Dimensione arresto, immettere 1000.
        4. Quindi fare clic su Bandiere di qualità e modificare l'intervallo di passaggio in modo che si legge Da 0.5 a 1. Modificare l'intervallo di qualità basso in modo che venga letto da 0.0 a 0.0. Modificare Presupporre Linearità al seguente: da (bp) 100.0 a (bp) 800.0.
        5. Salvare il nuovo metodo di analisi.
          NOT: È ora possibile rianalizzare un file scegliendo Low Peaks o High Peaks in Analysis Method e quindi facendo clic sul pulsante verde Analizza.

Figure 5
Figura 5: Schermata che mostra l'Editor standard delle dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Citometria di flusso

  1. Scelta del blocco FFPE ideale
    1. Utilizzando i vetrini H&E e un microscopio luminoso, selezionare un blocco FFPE che ha circa il 50-70% dei suoi tessuti composti da CV.
      NOTA: la figura 6 è un esempio rappresentativo di un blocco appropriato per l'analisi della citometria di flusso, in quanto è composto da circa il 50% di CV (metà destra della sezione) e 50% tessuti materni (metà sinistra). La presenza di tessuti materni è importante perché servono come controllo interno per il picco diploide.
    2. Per i blocchi che non hanno la quantità ideale di CV, arricchisci per CV mentre viene eseguita la sezionamento. Per farlo, identifica quale lato delle sezioni appena tagliate contiene più CV in base alla corrispondente diapositiva H&E. Sulla base di ciò, utilizzare una lama per tagliare l'altra metà che deve essere scartato al fine di arricchire per CV.
      NOTA: la figura 7 mostra un blocco che non dispone di CV sufficiente per l'analisi della citometria di flusso. Per blocchi come questo, le sezioni devono essere tagliate in modo che la metà che contiene meno CV venga scartata al fine di aumentare la quantità di CV rispetto ai tessuti materni, come mostrato nella figura. Assicurarsi di tagliare più sezioni per compensare ciò che viene scartato.

Figure 6
Figura 6: sezione H&E che rappresenta un blocco POC ideale per la citometria di flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: sezione H&E che rappresenta un blocco più difficile per la citometria di flusso. Questa sezione h&E rappresentativa mostra che solo la metà inferiore di questa sezione deve essere utilizzata per l'analisi della citometria di flusso, con l'obiettivo di arricchire per il CV. L'area delineata, denominata "CV", è composta per lo più da CV.

  1. Taglio
    1. Lasciare i blocchi sul ghiaccio per 15 min per facilitare la sezionamento.
    2. Utilizzando il miglior blocco FFPE possibile, tagliare quattro sezioni spesse 50 m (o due sezioni spesse 100 m) utilizzando un microtoma.
      NOT: Per la citometria a flusso è preferibile avere sezioni più spesse.
    3. Nel caso in cui non sia disponibile un blocco FFPE ideale, mira a mantenere comunque il rapporto tra CV e tessuto materno. Ad esempio, se solo il 30% del blocco è costituito da CV mentre il resto ha tessuti materni, rimuovere almeno la metà della sezione che contiene i tessuti materni e utilizzare più sezioni per compensare (vedere Figura 7).
    4. Posizionare le sezioni in tubi da 15 mL etichettati.
      NOT: Assicurarsi di sovrapinserire le etichette perché i reagenti organici utilizzati nel passaggio successivo possono sciogliere e rimuovere l'inchiostro.
  2. Protocollo di citometria di flusso dai tessuti FFPE
    1. Deparaffinazione e reidratazione
      1. Eseguire i seguenti lavamenti (Tabella 3) sotto un cofano di fumi.
      2. Riempire il tubo da 15 mL con 6 mL del reagente appropriato, seguendo l'ordine presentato nella Tabella 3, lasciare le sezioni nel reagenti per la rispettiva durata, quindi rimuovere il reagente utilizzando l'aspirazione a vuoto e una pipetta Pasteur in vetro.
      3. Tra ogni passo, immergere la pipetta Pasteur prima nel 70% di etanolo, poi in acqua distillata, e poi procedere alla fase successiva.
      4. Fare molta attenzione a non rimuovere pezzi di tessuto insieme al reagente. Inclinare il tubo di 15 mL ad un angolo di 60 gradi per facilitare l'aspirazione del reagente liquido senza disegnare i tessuti.
        ATTENZIONE: I liquidi scartati contengono xilene e devono essere smaltiti in contenitori di rifiuti di xilene.
    2. Preparazione della soluzione
      1. Preparare la soluzione citrate sciogliendo 2 g di acido citrico in 1 L di acqua doppia distillata. Portare il pH a 6. Conservare a 4 gradi centigradi.
      2. Preparare la soluzione di pepsina sciogliendo 0,01 g di pepsina in 2 mL di 9 parti per mille NaCl, pH 1,64. Questo è per un campione.
        ATTENZIONE: La pepsina è tossica e può facilmente disperdersi e diventare trasportata dall'aria. Indossare una maschera durante la manipolazione della pepsina nella sua forma di polvere e pulire tutta l'area di lavoro dopo averlo usato.
      3. Propidium Iodide (PI)-ribonuclease Preparazione di una soluzione per un campione.
        1. Mescolare 50 - L di PI con 450 l di PBS (per diluire 10x).
        2. Aggiungere 50 - L di ribonuclease A (1 mg/mL) alla miscela. Tenere sempre avvolto nella pellicola.
    3. Digestione e colorazione
      1. Aggiungete la soluzione di 4 gradi centigradi ai tubi da 15 mL, quindi collocate in un bagno d'acqua di 80 gradi per 2 ore.
      2. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (15 min). Rimuovere la soluzione citrate.
      3. Aggiungete 6 mL di 1x PBS, vortice, e aspettate 1/2 min per permettere ai tessuti di depositarsi sul fondo. Rimuovere il 1x PBS utilizzando aspirazione sottovuoto e una pipetta Pasteur in vetro.
      4. Aggiungere 1 mL di soluzione di pepsina (preriscaldata a 37 gradi centigradi) e mettere in un bagno asciutto a 37 gradi per 30 min.
      5. Aggiungete 6 mL di 1x PBS, vortice, e aspettate 1/2 min per permettere ai tessuti di depositarsi sul fondo. Rimuovere il 1x PBS utilizzando aspirazione sottovuoto e una pipetta Pasteur in vetro.
      6. Aggiungere 550 - L della soluzione PI-ribonuclease A e mettere i campioni in un bagno secco a 37 gradi per 30 min.
        NOT: A questo punto, i campioni possono essere avvolti in un foglio e lasciati durante la notte a 4 gradi centigradi fino alla mattina successiva.
      7. Filtrare la soluzione attraverso una rete filtrante da 48 m. Raccogliere il filtrato in tubi rotondi in polistirolo, che possono essere utilizzati con il citometro di flusso. Utilizzare pinze per posizionare un pezzo di 5 cm per 5 cm di rete filtrante nella parte superiore del tubo, in modo che il liquido può essere convogliato attraverso la rete e nel tubo.
        NOT: I campioni sono ora pronti per essere eseguiti con il citometro di flusso. Tenerli avvolti nella pellicola fino a quando non sono pronti per essere eseguiti.
    4. Esegui campioni con un citometro di flusso con l'aiuto del tecnico della piattaforma di citometria di flusso dell'organizzazione.
      NOT: Il canale PE viene utilizzato per rilevare il DNA macchiato di PI e la portata deve essere impostata su Slow durante l'acquisizione. Assicurarsi che la tensione sia scelta in modo tale che il picco diploide sia approssimativamente a 200 lungo l'asse XPE-A per facilitare l'analisi e l'interpretazione. Obiettivo di registrare un minimo di 20.000 eventi per campione.
Reagente utilizzato (6 mL ciascuno) durata
1) Sleonina 2 x 10 min
2) 100% Etanolo 2 x 10 min
3) 95% Etanolo 10 min
4) 70% Etanolo 10 min
5) 50% Etanolo 10 min
6) Acqua distillata 2 x 10 min

Tabella 3: Reagenti e durate per deparaffinazione e reidratazione.

  1. Analisi dei dati della citometria di flusso
    1. Analizzare i dati con un software di analisi della citometria di flusso (Tabella dei materiali).
      NOT: I seguenti passaggi sono per un software specifico (Tabella dei materiali) ma può essere di aiuto per la configurazione di altri tipi di software pure.
      1. Dopo aver eseguito gli esempi su un citometro di flusso, scaricare i file FCS 2.0 per l'analisi.
      2. Aprire il software di analisi della citometria di flusso, fare clic su File Nuovo documento.
      3. Fare clic sull'icona Istogramma (), quindi trascinare il puntatore per creare un rettangolo.
      4. Cercare il file FCS e quindi fare clic su Apri. Lungo l'asse x, fare clic su FCS-A, quindi selezionare PE-A.
      5. Fare clic sull'iconaGrafico a punti ( ) e trascinare il puntatore per creare un altro rettangolo sotto il grafico dell'istogramma. Quindi cercare lo stesso file FCS selezionato per l'istogramma.
      6. Modificare l'asse x del grafico a punti in PE-A e l'asse y in PE-W.
        NOTA: Figura 8A dimostra l'aspetto dei grafici a questo punto.
      7. Fare clic sull'icona Regione ( ) e disegnare una casella sul grafico a punti che inizia prima del picco diploide (circa 100 sull'asse x in Figura 8B) e che termina intorno a 700 sull'asse x, come mostrato nel grafico a punti in Figura 8 B.
        NOT: Il picco diploide nella Figura 8 è all'incirca a 200 sull'asse x. Questo viene scelto arbitrariamente come i campioni vengono registrati attraverso il citometro di flusso, semplicemente per facilitare l'analisi e l'interpretazione dei risultati.
      8. Fare clic su Stampa . Modificare Regioni/Gates, quindi digitare R0 nella cella accanto alla cella G0 in Strategia. Quindi fare clic su Chiudi.
      9. Fare clic in un punto qualsiasi dell'istogramma, quindi su Grafico. Formato stampa/sovrapposizione. In Porta, selezionare G0 e R0, quindi fare clic su OK.
        NOT: Questo è il passo di gating che permette di visualizzare meglio i picchi ploidi. L'istogramma dovrebbe ora essere simile all'istogramma in Figura 8B. È possibile giocare con il cancello creato (spostando la casella disegnata al passo 2.4.1.7) al fine di concentrarsi su specifiche regioni del grafico a punti.
      10. Per etichettare i grafici, fare clicsull'icona Area di testo ( ), quindi trascinare il puntatore per creare una casella nella parte superiore del documento, quindi digitare le seguenti informazioni: ID paziente, ID POC e blocco utilizzato (poiché potrebbero essere presenti diversi blocchi per un POC) , percentuale CV presente sul blocco, tensione utilizzata per eseguire il campione e data.

Figure 8
Figura 8: Schermata che mostra un istogramma e un grafico a punti di un campione rappresentativo che è ungated (A) e gated (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

La complessità dei tessuti molari e il fatto che possano avere vari genotipi richiede un'analisi rigorosa e l'uso di diversi metodi come la valutazione morfologica, l'immunohistochimica p57, la genotipizzazione microsatellite, la citometria di flusso e la FISH. Ad esempio, un paziente (1790) è stato riferito con due PHM che sono stati trovati triploide dall'analisi microarray solo dei POC. Al paziente è stato quindi diagnosticato un PHM ricorrente. La genotipizzazione microsatellite dei suoi due "PHM" insieme al DNA del paziente e del suo partner ha rivelato che mentre la prima talpa del paziente è dispermica triploide (Figura 9A), il suo secondo "PHM" ha un genotipo digonico triploide (Figura 9 B) e quindi non è un PHM, ma un aborto spontaneo non molare.

Il primo indicatore in Figura 9A (in nero) mostra due picchi nel POC. Il primo picco proviene dalla madre, dal momento che solo la madre ha un picco di queste dimensioni. Seguendo lo stesso ragionamento, il secondo picco proviene dal padre poiché condivide lo stesso allele. Si noti come il secondo picco è molto più alto del primo, indicando che ci sono probabilmente due dosi dello stesso allele paterno in quel picco. La contaminazione materna, che sarà spiegata più in dettaglio più avanti, è molto minima in questo POC perché il POC mostra un picco molto piccolo nella posizione del secondo allele materno.

Il secondo indicatore nella figura 9A (in blu) mostra tre picchi nel POC. Due di queste vette provengono dal padre e una dalla madre. Così, è evidente ancora una volta da questo marcatore che ci sono tre alleli presenti nel POC, due dal padre e uno dalla madre. Il terzo e il quarto marcatore in Figura 9A sono simili al primo marcatore, e mostrano anche due alleli provenienti dal padre e uno dalla madre.

Poiché tutti e quattro i marcatori mostrano costantemente tre alleli (per dose o per presenza di tre alleli di diverse dimensioni), due provenienti dal padre e uno dalla madre, si può concludere che questo POC è dispermiato triploide e conferma la diagnosi di PHM.

Tutti e quattro i marcatori in Figura 9B mostrano di nuovo tre alleli: il primo marcatore mostra due dosi nel primo picco che hanno origine dalla madre e una dose nel secondo picco che ha origine dal padre. Il secondo e il quarto marcatore mostrano tre picchi diversi (cioè tre diversi alleli), due dei quali provengono dalla madre. Il terzo marcatore mostra una dose nel primo picco proveniente dal padre e due dosi nel secondo picco proveniente dalla madre. Pertanto, questo POC è triploide di origine diginenica poiché due serie di cromosomi provengono dalla madre e un set proviene dal padre. Si tratta quindi di un aborto spontaneo non molare.

Figure 9
Figura 9: Risultati rappresentativi della genotipizzazione del paziente 1790. (A) Selezionare i risultati della genotipizzazione della prima concezione del paziente che mostra un genotipo triploide disperico. (B) Selezionare i risultati della genotipizzazione dalla seconda concezione del paziente che mostra un genotipo triploide digynic. L'asse x è in basepairs; le etichette e le dimensioni delle coppie di base sono state omesse per semplicità. L'asse y rappresenta l'altezza massima ed è anch'emesso dalla figura per semplicità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questa paziente è stata inizialmente erroneamente diagnosticata con due PHM e si preoccupava di un aumento del rischio di più talpe mentre aveva un singolo PHM. Questo caso evidenzia la limitazione del microarray SNP solo sul POC. SNP microarray è un metodo potente ed è il migliore per rilevare aneuploidies di qualsiasi cromosoma (trisomie, monosomie, o genotipi non-diploidi); tuttavia, se eseguita solo sul POC senza analizzare il DNA dei genitori, l'origine della triploidia non può essere determinata. Per ulteriori spiegazioni sull'analisi e l'interpretazione del genotipo, si prega di fare riferimento allo studio di Murphy etal.

Risultati rappresentativi mostrati figura 10A sono di una concezione triploide. I valori dell'asse x rappresentano il contenuto del DNA nucleare. Ad esempio, 200 è un numero arbitrario dato alle cellule che contengono una certa quantità di contenuto di DNA nucleare. Pertanto, un picco a 400 rappresenta le cellule che contengono il doppio della quantità di contenuto di DNA nucleare rispetto al picco 200. Il piccolo picco intorno a 300 rappresenta il contenuto di DNA nucleare che è tra il picco 200 e 400 ed è quindi il picco triploide. Si noti come una concezione diploide (Figura 10B) non contenga alcun picco al valore 300.

In alcuni casi, il picco triploid è molto sottile (Figura 10C). Ogni volta che si nota un picco triploide appena percettibile, è importante considerare prima la quantità di CV che erano presenti nelle sezioni utilizzate per l'analisi della citometria di flusso. Se le sezioni hanno avuto meno di circa il 20% CV, allora sarà probabilmente una vera triploidy dal momento che si prevede di essere un picco molto basso. Se le sezioni prese avevano elevate quantità di CV, il POC diventa sospettoso del mosaicismo con la presenza di un'altra popolazione cellulare diploide. Questo può essere controllato rivedendo i risultati della genotipizzazione per vedere se si adattano a una perfetta dispersione triploide o possono anche essere confermati da FISH con sonde dai cromosomi X, Y e 18. Inoltre, utilizzando il software descritto in questo articolo, è possibile impostare porte specifiche, come descritto nella sezione 2.4.1, che consentono all'utente di concentrarsi su una regione specifica per arricchire per le celle triploide se esistono realmente.

Figure 10
Figura 10: Risultati rappresentativi della citometria di flusso che dimostrano concezioni triploidiche in (A) e (C), e una concezione diploide in (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le HM sono gravidanze umane anormali con eziologie eterogenee e hanno diversi tipi istologici e genotypic, il che rende la loro classificazione e diagnosi accurate impegnative. La valutazione morfologica istopatologica è stata spesso dimostrata imprecisa ed è quindi inaffidabile da sola per classificare HM in CHM e PHM e distinguerli da aborti non molari. Pertanto, una diagnosi accurata di HM richiede l'uso di altri metodi come la genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex, l'analisi della ploidia per citometria di flusso, l'analisi ploidia da FISH e l'immunohistochimica p57KIP2. Ognuno di questi metodi ha i propri limiti e vantaggi.

Limitazioni e vantaggi della genotipizzazione multiplex e della citometria di flusso

La contaminazione materna è uno dei problemi più comuni quando si lavora con i tessuti FFPE e può portare a diagnosi errate, evidenziando così l'importanza di separare la materna dai tessuti POC. È importante identificare la contaminazione materna per avere un'idea di cosa aspettarsi dai picchi di genotipizzazione e per aiutare con la loro interpretazione. Se il livello di contaminazione è troppo grande e impedisce un'interpretazione affidabile dei risultati, ripetere l'isolamento e l'estrazione del DNA, presungendo particolare attenzione nella rimozione di tutti i possibili tessuti materni. Nelle regioni in cui la morfologia dei tessuti non è chiara, è meglio rimuovere tali regioni per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione materna. Il primo vantaggio del metodo descritto in questo protocollo, oltre al suo costo inferiore, è che i tessuti materni vengono rimossi dalle diapositive mentre altri metodi consistono nella raccolta dei tessuti POC (coprendoli con una soluzione che polimerizza quando viene esposta all'aria e sollevare i tessuti) senza rimuovere i tessuti materni. Il metodo qui descritto permette quindi di dare un'altra occhiata ai tessuti POC rimanenti, ripulirli se necessario, come spesso accade, e quindi raccogliere ed estrarre il DNA da loro. Il secondo vantaggio è che puliamo i tessuti su sezioni colorate H&E non coperte, che facilitano notevolmente la rimozione dei tessuti materni, al contrario dell'uso di sezioni incontaminate e di uno scivolo mappa coperta. Tuttavia, la colorazione aggiuntiva può ulteriormente degradare il DNA, e questo è compensato con l'aggiunta di altre sezioni.

La disponibilità di DNA parentale per l'analisi è un'altra sfida. La presenza di entrambi i genitori facilita notevolmente l'analisi e l'interpretazione dei risultati della genotipizzazione. Purtroppo, tuttavia, è molto spesso il caso che il DNA del padre non sia disponibile, il che a volte può complicare l'analisi, soprattutto nei casi in cui la qualità del DNA POC è scarsa a causa della fissazione preventiva o dello stoccaggio a lungo termine (più frequente quando si lavora con HM ricorrente). Inoltre, il sangue materno potrebbe non essere sempre disponibile per l'estrazione del DNA. In questi casi, il DNA materno può essere estratto dai tessuti endometriali materni presenti nei blocchi FFPE come descritto in precedenza16. Inoltre, caratterizzare i tessuti molari derivanti dall'uso di tecnologie di riproduzione assistita può complicare l'analisi del genotipo microsatellite perché, nella maggior parte dei casi, il DNA dei donatori (maschi o femmine) di solito non è disponibile.

Infine, il fatto che i picchi più grandi tendono ad essere più brevi in termini di altezza di picco è un'altra possibile fonte di confusione, in particolare quando le altezze di picco devono essere utilizzate per determinare se ci sono due dosi o una dose in un singolo picco. Un modo per superare questo è quello di tenere sempre a mente che i picchi di grandi dimensioni alleli (numero di coppie di basi) tendono ad essere più brevi, a causa della natura degradata del DNA dai tessuti FFPE, che rende meno DNA disponibile per l'amplificazione di alleli più grandi. Inoltre, un'amplificazione del frammento PCR più corta richiede meno tempo rispetto a una più grande, e l'amplificazione esponenziale del DNA porta a meno quantità di alleli più grandi.

Il principale inconveniente della citometria di flusso è che le concezioni triploidi possono talvolta essere perse, e questo potrebbe essere dovuto a quantità insufficienti di CV nel blocco. Tuttavia, la presenza di un picco triploide è un'indicazione conclusiva di una triploidia. Si noti che questo metodo non è abbastanza sensibile per rilevare trisomie, concezioni tetraploidi, o altri aneuploidi utilizzando questo protocollo. Le concezioni tetraploidi non sono rilevabili da questo protocollo perché il picco tetraploide corrisponde allo stesso picco di cellule diploidi nella fase G2 del ciclo cellulare.

Conoscere questi limiti e queste sfide aiuta a ridurre gli errori. È quindi importante e talvolta necessario analizzare lo stesso tessuto con metodi diversi, confrontare i risultati e assicurarsi che siano concordanti l'uno con l'altro. In caso contrario, i risultati devono essere riconsiderati e le analisi devono essere ripetute. Per i diversi casi che hanno mostrato risultati contrastanti, le discrepanze sono state risolte semplicemente ripetendo gli esperimenti e prendendo le cure appropriate per evitare il problema originale. In altri casi, le discrepanze sono state risolte eseguendo metodi aggiuntivi come FISH sulle sezioni di tessuto o eseguendo ulteriori genotipie semplici con marcatori appropriati.

Identificazione della contaminazione materna

Per quanto riguarda l'identificazione della contaminazione del DNA POC con DNA materno, il livello di contaminazione sarà riflesso o riconosciuto dalla presenza di tutti gli alleli materni a tutti gli alleci del POC, oltre agli allele materni che vengono trasmessi al POC.

Nella figura 11A, i picchi derivanti dalla contaminazione del DNA materno sono etichettati con una "c". Si noti come ogni picco contrassegnato con una "c" è presente anche nella madre, e vediamo questi picchi "c" in tutti e tre i marcatori. Si noti che per il secondo marcatore (in blu), il picco di contaminazione materna indicato da una "c" è più alto di ogni picco "c" al primo marcatore perché la madre è omozio per il secondo marcatore; l'altezza del contaminante è quindi raddoppiata per questo marcatore. In questo POC, non ci sono picchi derivati dall'unità maschile. In altre parole, questo POC non ha ereditato alcun allele dalla madre. C'è solo un picco reale per ogni marcatore e questo picco non è presente nella madre. Sappiamo quindi che i veri picchi devono provenire dal padre. Con le informazioni ploidiche dall'analisi del cariotipo o della citometria di flusso che dimostrano la diploidia, è possibile concludere che questo POC è sia di origine androgenetica che diploide.

Inoltre, questi tre marcatori in Figura 11A rivelano che c'è sempre un solo picco reale per ogni marcatore. Solo tre marcatori sono illustrati qui, tuttavia, i kit multiplex spesso sono dotati di molti più marcatori che riveleranno anche lo stesso modello. Dal momento che questo POC è diploide, ci devono essere due dosi in ogni picco. Con queste informazioni, possiamo concludere che questo POC è monospermico androgenetico ed è omozino ad ogni singolo marcatore.

La figura 11B rappresenta un POC biparentale diploide. La piccola barra nera attraverso il primo picco del primo marcatore (in verde) rappresenta la quantità stimata di contaminazione presente all'interno di questo picco reale. La "R" indica la parte reale di questo picco proveniente dal DNA POC; la "c" rappresenta la porzione contaminante di questo picco proveniente dal DNA materno. Come si può identificare il livello di contaminazione? È possibile, in questo caso, quando un marcatore è etetozigo nella madre perché uno degli alleli materni è assente nel POC. Il piccolo picco nel primo marcatore etichettato con "c", per esempio, indica che questo è il livello di contaminazione che ci si dovrebbe aspettare per l'altro picco ereditato dall'età fisica. Di conseguenza, tutti i picchi POC di origine materna sono leggermente superiori ai picchi ereditati dalla paternità a causa della piccola quantità aggiunta di contaminazione. Per il terzo marcatore (in nero) nella figura 11B, il livello di contaminazione dovrebbe essere il doppio della quantità abituale (perché la madre è omozigo per questo marcatore specifico), e si può quindi dedurre che c'è solo una dose nel primo picco nel POC.

Figura 11C illustra un triploide dispermica POC. Il primo marcatore (in verde) mostra tre picchi nel POC. Dal momento che questi tre picchi hanno altezze simili, è possibile concludere che questo POC è probabilmente triploide. Si noti che il terzo picco in questo marcatore è più corto del primo. Questo è previsto perché, come tendenza generale, picchi più grandi tendono ad essere più brevi. Il secondo picco è leggermente superiore al primo, e questo può essere rappresentato da una piccola quantità di contaminazione materna, come indicato dalla barra e "c". Inoltre, due di questi tre picchi non sono presenti nella madre, e quindi devono provenire dal padre. Finora, questo marcatore indica che il POC potrebbe essere triploide (o una trisomia) e che l'origine del set extra di cromosomi è paterno. Indica anche che si tratta di una concezione dispermica, dal momento che il POC ha ereditato due diversi alleli dal padre.

Il secondo indicatore (in blu) in Figura 11C ha solo due picchi. Dopo aver tenuto conto del livello di contaminazione, il secondo picco appare superiore al primo, e questo nonostante la tendenza generale per i picchi più grandi per essere più piccoli (una tendenza che deve sempre essere tenuto a mente durante l'analisi). Così, è probabile che ci sono due dosi in quel grande picco. Ciò è supportato anche dal fatto che il primo marcatore è indicativo di triploidia.

Infine, il terzo marcatore (in nero) nella figura 11C mostra tre picchi, ancora una volta indicativo di triploidesia. Poiché la maggior parte dei marcatori nei kit multiplex provengono da diversi cromosomi, è possibile concludere con fiducia che un POC è triploide dopo aver osservato la stessa tendenza di tre alleli su diversi marcatori. Da questo marcatore anche che due dei tre picchi provengono dal padre, confermando l'origine dispermica.

Figure 11
Figura 11: Risultati della genotipizzazione che illustrano l'effetto della contaminazione materna. I pannelli superiori mostrano gli alleli che appartengono al POC e i pannelli inferiori mostrano quelli che appartengono alla madre. In (A), il POC è monospermico androgenetico e il livello di contaminazione è evidenziato da una freccia e dalla lettera "c". In (B), il POC è biparentalo diploide e il livello di contaminazione è evidenziato dalla lettera "c". In (C), il POC è triploide dispermico e il livello di contaminazione è evidenziato dalla lettera "c". Le piccole barre nere mostrano quanto delle altezze di picco proviene dalla contaminazione materna e dovrebbero quindi essere prese in considerazione quando si confrontano le altezze di picco. L'asse x è in basepairs; le etichette e le dimensioni delle coppie di base sono state omesse per semplicità. L'asse y rappresenta l'altezza massima ed è anch'emesso dalla figura per semplicità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esempi di casi difficili

Per un certo numero di casi, è stato possibile giungere a una conclusione solo avendo tutte e tre le valutazioni contemporaneamente (cioè flusso, p57KIP2e genotipizzazione multiplex). Ad esempio, un caso (808) è stato indicato come un aborto spontaneo non molare. La valutazione istopatologica ha portato al sospetto di un concepimento molare e l'analisi genotipizzazione del POC ha rivelato un marcatore che mostrachiaramente tre picchi (due dal padre e uno dalla madre). I risultati di p57KIP2 non sono stati conclusivi. L'analisi della citometria del flusso ha rivelato un piccolo picco triploide che è stato confermato con l'analisi FISH, che ha anche escluso la presenza di un'altra popolazione cellulare diploide. Con la conferma di FISH, è stato possibile concludere che il POC è davvero una talpa dispermica triploide.

Un altro caso (1192) è stato anche indicato come aborto spontaneo non molare. Il CV di questo POC era mescolato con tessuti materni ed era anche altamente necrotico, rendendo il processo di pulizia molto impegnativo. Di conseguenza, la prima analisi della genotipizzazione ha mostrato un elevato livello di contaminazione materna, tale che ogni allele materno potrebbe essere visto nel POC (una buona indicazione di possibile contaminazione). Inoltre, il p57KIP2 era purtroppo inconcludente, molto probabilmente a causa della natura necrotica del tessuto, forse a causa di fissazione ritardata. I risultati della citometria di flusso, tuttavia, sono stati indicativi di triploidia, che è stata confermata anche da FISH. Il DNA è stato riestratto con l'obiettivo di ridurre il livello di contaminazione e rimuovere i tessuti con una morfologia poco chiara. L'analisi dei nuovi risultati della genotipizzazione, pur tenendo conto della probabile presenza di contaminazione materna, ci ha permesso di concludere che il POC era un triploide dispermico XXY PHM.

La tabella 4 illustra i metodi tipici utilizzati per l'analisi. Si raccomanda di utilizzare la valutazione morfologica e l'immunohistochimicap57 KIP2 su tutti i tessuti sospetti di HM e almeno un metodo di genotipizzazione. Tra i metodi di genotipizzazione, il più informativo è la genotipizzazione del DNA multiplex. Quando i risultati tra metodi diversi non sono concordanti o quando alcuni risultati sono inconcludenti, è necessario utilizzare altri metodi di genotipizzazione. La tabella mostra i risultati concordanti previsti per ogni possibile tipo HM insieme a rare eccezioni e raccomandazioni per risolverli.

Table 4

Tabella 4: Ordine tipico dell'analisi, risultati previsti e rare eccezioni insieme a raccomandazioni per risolverli. P57KIP2 immunohistochimica mira a rilevare l'espressione di p57KIP2, la proteina codificata dal gene CDKN1C. Questo gene è paeternamente impresso nel citotrofoblasto e nel villous stroma della placenta del primo trimestre ed è espresso solo dal genoma materno. Viene quindi utilizzato come marcatore ausiliario per rilevare, in modo semplice ed economico, la presenza del genoma materno nel POC. Si raccomanda di eseguire l'immunohistochimica p57KIP2 per tutti i POC sospettati di essere HM in parallelo alla valutazione morfologica. Nel laboratorio dell'autore vengono utilizzati gli anticorpi e le piattaforme p57KIP2 indicati nella Tabella dei Materiali e gli autori sono molto soddisfatti della qualità dei risultati. Abbreviazioni: IHC - immunohistochimica; Immersione e androgenetica diploide; Dip Bip - biparentali diploide; Cromosoma; MC - aborto spontaneo; e TP - proliferazione trofoblastica.

Per quanto ne sappia degli autori, questo articolo è il primo a fornire protocolli dettagliati per la citometria di flusso, nonché la genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex a basso costo e di alta qualità dei tessuti FFPE POC. Viene descritta anche l'interpretazione dei risultati, insieme alla loro risoluzione dei problemi e all'integrazione con quelli di altri metodi per giungere a conclusioni e diagnosi accurate di POC e HM. Gli autori sperano sinceramente che questo articolo possa essere utile per i ricercatori che cercano di capire questa entità complessa.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Sophie Patrier e Marianne Parésy per aver condiviso il protocollo originale della citometria di flusso, e Promega e Qiagen per la fornitura di rifornimenti e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Réseau Québécois en Reproduction e dal Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) a R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACS Canto II BD BioSciences 338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer Applied biosystems 313001R Service offered by the Centre for Applied Genomics
(http://www.tcag.ca)
Citric acid Sigma 251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium Fisher 23244257
Eosin Y stock solution (1%) Fisher SE23-500D
FCSalyzer - flow cytometry analysis software SourceForge - https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit Qiagen 80234
Forceps Fine Science Tools 11295-51 For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated) Sigma A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass Fisher 12-541a
Hematoxylin Fisher CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide Thermofisher 4311320
IHC platform: Benchmark Ultra Roche -
Kimwipes Ultident 30-34120
Microtome Leica RM2135
Microtome blades Fisher 12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 μm Filmar 74011 http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody Cell Marque 457M
Pasteur pipette VWR 53499-632
PCR machine Perkin Elmer, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0 Applied Biosystems 4381867 Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7012
Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm Fisher 1255015
PowerPlex 16 HS System Promega Corporation DC2102
Propidium Iodide Sigma P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas Sigma R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer Thermofisher 4352759
UltraPure Agarose Fisher 16500-500
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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Genetica Numero 152 perdite riproduttive talpa idatidiforme gravidanza molare aborto spontaneo genotipizzazione STR citometria di flusso aneeeuploidesia biparentale diploide androgenetica
Pulitura del DNA microsatellite e citometria di flusso Ploidy Analisi dei tessuti molari Molari Molari Molar fissati di paraffino fissati in parina
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Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, More

Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, P., Slim, R. Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60366, doi:10.3791/60366 (2019).

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