Summary
As toupeiras Hydatidiform são gravidezes humanas anormais com etiologias heterogêneas que podem ser classificadas de acordo com suas características morfológicas e contribuição parental aos genomas do molar. Aqui, os protocolos de genotipagem multiplex do ADN do microssatélites e de fluxo citometria de tecidos parafina-encaixados formalin-fixados do molar são descritos em detalhe, junto com a interpretação e a integração dos resultados.
Abstract
A toupeira Hydatidiform (HM) é uma gravidez humana anormal caracterizada pela proliferação trophoblastic excessiva e pelo desenvolvimento embrionário anormal. Existem dois tipos de HM com base na avaliação morfológica microscópica, HM completo (CHM) e HM parcial (PHM). Estes podem ser mais subdivididos com base na contribuição parental para os genomas molar. Essa caracterização da HM, por meio de análises morfológicas e genotípicas, é crucial para a gestão do paciente e para o entendimento fundamental dessa intrigante patologia. É poço-documentado que a análise morfológica do HM está sujeita à variabilidade interobservador larga e não é suficiente no seus próprios para classificar exatamente HM no chm e no PHM e distingui-los dos Abortions hidrópica do não-molar. A análise de Genotyping é executada na maior parte no ADN e nos tecidos dos produtos parafina-encaixados formalin-fixos (FFPE) da concepção, que têm menos do que a qualidade óptima e podem conseqüentemente conduzir às conclusões erradas. Neste artigo, são fornecidos protocolos detalhados para a análise de genotipagem multiplex e citometria de fluxo de tecidos molar de FFPE, juntamente com a interpretação dos resultados desses métodos, sua solução de problemas e a integração com a avaliação morfológica , P57KIP2 Immunohistochemistry, e a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para alcangar um diagnóstico correto e robusto. Aqui, os autores compartilham os métodos e lições aprendidas nos últimos 10 anos a partir da análise de aproximadamente 400 produtos de concepção.
Introduction
Uma toupeira Hydatidiform (HM) é uma gravidez humana anormal caracterizada pelo desenvolvimento embrionário anormal, pela hiperproliferação do trophoblast, e pela degeneração hidrópica de Villi coriónico (CV). Historicamente, HM costumava ser dividido em dois tipos, HM completo (CHM) e HM parcial (PHM) com base apenas na avaliação morfológica1. No entanto, tem sido demonstrado que a avaliação morfológica isoladamente não é suficiente para classificar HM nos dois subtipos (chm e PHM) e distingui-los de abortos não-molar2,3,4.
Porque o chm e o PHM têm propensões diferentes às malignidades, é conseqüentemente importante determinar exatamente o tipo genotípica de HM para fornecer a continuação e a gerência apropriadas aos pacientes. Conseqüentemente, nas últimas décadas, diversas metodologias têm sido desenvolvidas e evoluídas com o objetivo de identificar a contribuição parental para os tecidos molares e alcançar uma correta classificação da HM. Estes incluem a análise do karyotype, o polimorfismo da borda cromossomática, a tipagem sorológicos do antígeno humano da leucócito (HLA), o polimorfismo do comprimento do fragmento da limitação, número variável de repetições em tandem, genotyping do microssatélites, citometria do fluxo, e P57 KIP2 immunohistochemistry. Isto permitiu a subdivisão exata de concepções do HM baseadas na contribuição parental a seus genomes, como segue: chm, que são chimerism androgenética monospérmicos ou diploid androgenética diploid, e PHM, que são triploid, chimerism em 99% e monospérmicos em 1% dos casos5,6,7,8. Além disso, há um outro tipo genotípica de HM que emergiu nas duas décadas passadas, que é biparental diploid. O último é na maior parte periódico e pode afetar um único membro da família (casos simples) ou pelo menos dois membros da família (casos familial). Estas toupeiras biparental diploid são causadas na maior parte por mutações recessive em NLRP7 ou em KHDC3L nos pacientes9,10,11,12. O HM biparental diploid nos pacientes com mutações recessive em NLRP7 pode ser diagnosticado como o chm ou o PHM pela análise morfológica e este parece ser associado com a severidade das mutações nos pacientes13,14. Além da classificação de HM de acordo com seus genótipos, a introdução e o uso de vários métodos de genotipagem permitiram distinguir as diferentes entidades molares de abortos não-molar, tais como concepções biparentais diploides aneuploides e outros tipos de concepções5,15. Tais concepções podem ter alguma proliferação do trofoblasto e morfologia villous anormal que imitam, em certa medida, algumas características morfológicas de hm.
O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para genotipagem multiplex e citometria de fluxo de tecidos de parafina (FFPE) fixos em formalina, e análises abrangentes dos resultados desses métodos e sua integração com outros métodos para diagnóstico correto e conclusivo de tecidos molares.
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Protocol
Este estudo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de revisão institucional da McGill. Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito para participar do estudo e ter seus produtos de concepção de FFPE (POCs) recuperados de vários departamentos de patologia.
Nota: Embora existam vários métodos para a determinação de genotipagem e ploidia por citometria de fluxo, os protocolos aqui fornecidos descrevem um método de análise usando uma plataforma para cada um.
1. genotipagem
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Seleção do melhor bloco de FFPE
- Para cada produto de concepção de FFPE (POC), prepare seções coradas de 4 μm de espessura de hematoxilina e eosina (H & E), conforme descrito nas seções 1,2 e 1,3, uma para cada bloco disponível, para avaliação morfológica por microscopia.
- Usando os slides H & e e um microscópio de luz, selecione o bloco FFPE que tem a maior quantidade de vilosidades coriônicas (CV), e se possível, o bloco que tem CV separado de, e não misturado com, tecidos maternos.
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Corte
- Coloque o bloco escolhido no gelo por 15 min para facilitar o corte.
- Ajuste o micrótomo para cortar seções com 4 μm de espessura para avaliação morfológica microscópica e 10 μm de espessura para extração de DNA.
- Coloc o bloco frio no micrótomo e corte uma seção de cada bloco para a mancha de H & e e as seções 10 − 30 do bloco escolhido, dependendo da quantidade de CV no bloco, para a extração do ADN.
Nota: Para os blocos que estão cheios de CV, 10 seções são suficientes para a extração de DNA. Se apenas cerca de 10% do bloco contém CV, enquanto o resto são tecidos maternos, então 20 − 30 seções são necessários para garantir quantidades suficientes de DNA. - Usando fórceps, transfira cada seção a um banho de água de 45 ° c. Pegue a seção do banho de água com uma corrediça carregada positivamente (tabela dos materiais) que seja etiquetada previamente com o número de identificação da amostra usando um lápis.
- Coloque os slides contendo as seções em um forno a 65 ° c para permitir que as seções sigam os slides. Mantenha os slides para H & E no forno por 25 min. Mantenha os slides para extração de DNA no forno por 20 min.
Nota: O menor tempo de incubação torna os tecidos ligeiramente menos aderentes às lâminas e, consequentemente, facilita a remoção dos tecidos maternos.
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Coloração de H & E
- Permita que os slides esfriem até a temperatura ambiente (10 min).
- Preparação do reagente
- Prepare a solução de trabalho eosina Y (0,25%) como por a tabela 1. Misture bem e armazene à temperatura ambiente.
- Prepare a solução de hematoxilina de trabalho diluindo a solução de estoque de hematoxilina 5x em água (ou seja, misture 80 mL de água com 20 mL de hematoxilina).
Nota: Envolva a solução do estoque do hematoxilina na folha para o armazenamento.
- Prepare frascos de coloração com os reagentes corretos uma capa de fumaça de acordo com a tabela 2.
- Realize a coloração H & E submergindo os slides nos frascos de coloração apropriados para o período de tempo correto de acordo com a tabela 2.
- Monte as secções de 4 μm para análise morfológica com suporte de montagem e lamínula com lamelas de vidro (tabela de materiais).
Nota: As secções de 10 μm para genotipagem não devem ser coverescorregas. - Deixe as seções de 10 μm a capa de fumaça por um mínimo de 3 h para que os odores tóxicos de xileno se dissipar.
Atenção: Todas as etapas de coloração precisam de ser executadas uma capa das emanações. Os produtos do xileno precisam de ser mantidos a capa em todas as vezes porque os odores do xileno são tóxicos. Além disso, xileno e hematoxilina precisam ser descartados em recipientes especiais. Uma vez que estes recipientes estão cheios, precisam de ser descartados como recomendado pela organização de segurança do laboratório.
| Reagente | Quantidade |
| Solução de estoque de eosina Y (1%) | 250 mL |
| 80% etanol | 750 mL |
| Ácido acético glacial (concentrado) | 5 mL de |
Tabela 1: solução de trabalho eosina Y (0,25%) Preparação.
| Reagente usado (100 mL por o escaninho) | Duração |
| 1) xileno | 5 minutos |
| 2) xileno | 5 minutos |
| 3) 100% etanol | 2 minutos |
| 4) 95% etanol | 2 minutos |
| 5) 70% etanol | 2 minutos |
| 6) 50% etanol | 2 minutos |
| 7) água destilada | 5 minutos |
| 8) hematoxilina | 4 minutos |
| 9) água destilada | 5 minutos |
| 10) eosina | 1 minuto |
| 11) 95% etanol | 5 minutos |
| 12) 100% etanol | 5 minutos |
| 13) xileno | 5 minutos |
| 14) xileno | 5 minutos |
Tabela 2: reagentes e durações para o protocolo de coloração H & E.
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Isolamento de CV
- um estereomicroscópio leve, use fórceps e pequenos pedaços de lenços de papel umedecidos com água (tabela de materiais) para raspar os tecidos maternos indesejados de H & e-manchado 10 μm seções grossas.
Nota: O objetivo final é manter nada além de CV ou membranas fetais (quando presentes) nas lâminas e, assim, remover todos os outros tecidos. Esta etapa pode precisar de muito tempo e paciência, dependendo do bloco, pois requer atenção meticulosa aos detalhes. - Tenha uma segunda pessoa verific duas vezes as corrediças após a limpeza para assegurar-se de que estejam livres dos tecidos maternos.
- Tire fotos dos slides limpos ou documente o seguinte para ajudar na interpretação dos dados: 1) se o tecido foi difícil de limpar, hemorrágico ou muito limpo, 2) o número de secções utilizadas, e 3) a quantidade aproximada de tecidos limpos.
Nota: a Figura 1 fornece um exemplo de um slide que é fácil de limpar. Para um bloco que contenha aproximadamente esta quantidade de CV, 10 seções são suficientes para a extração do ADN. O slide na Figura 2 tem muito poucos CV que se misturam com os tecidos maternos, tornando-se muito difícil e demorado para limpar. Para um bloco que contenha aproximadamente esta quantidade de CV, 30 seções são necessários para a extração do ADN. - Colete o CV usando pequenas peças umedecidas de lenços de papel. Usando o fórceps, rasgue uma parte minúscula fora das limpezas de papel umedecidas e use-a para recolher o CV.
- Coloque os pedaços de lenços de papel com o seu CV anexado num tubo rotulado de 1,5 mL.
- Minimize a quantidade de limpezas de papel usadas nesta etapa como demasiada pode obstruir a coluna da extração do ADN e conseqüentemente reduzir a quantidade final de ADN coletado. Em média, o objetivo de usar menos de sete pequenos pedaços de papel toalhetes por amostra. Se isso não for possível devido à presença de grandes quantidades de CV, divida a amostra entre dois tubos para facilitar a extração.
- um estereomicroscópio leve, use fórceps e pequenos pedaços de lenços de papel umedecidos com água (tabela de materiais) para raspar os tecidos maternos indesejados de H & e-manchado 10 μm seções grossas.
Figura 1: slide representativo para genotipagem. Parte superior: uma corrediça que precise de ser "limpada" para tornar-se livre de tecidos maternos. Inferior: o mesmo slide mostrado depois de ter sido limpo e agora não contém nada, mas CV para extração de DNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: slide representativo para genotipagem. Parte superior: uma corrediça que precise de ser "limpada" para tornar-se livre de tecidos maternos. Inferior: o mesmo slide mostrado depois de ter sido limpo e agora não contém nada, mas CV para extração de DNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Siga o protocolo da extração do ADN do jogo de FFPE (tabela dos materiais) para executar a extração do ADN.
Nota: Alguns kits recomendam o uso de 15 − 20 μL de tampão de eluição para a eluição final. Da experiência, a eluição com 15 μL do amortecedor da eluição trabalha bem para a maioria de amostras. As diluições podem ser preparadas a partir do DNA de estoque, conforme necessário.
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Quantificação do DNA
- Usando um dispositivo do espectrofotômetro do laboratório, carregue 1 μL do ADN e absorvância da medida em 260 nanômetro para a quantificação.
- Carregue 1 μL de DNA em um gel de agarose a 2% e faça eletroforese em gel em uma voltagem de 80 − 100 V para avaliação qualitativa.
- Com base nos resultados das etapas 1.6.1 e 1.6.2, escolha o volume de DNA a ser usado na amplificação em tandem curto Multiplex (STR) da reacção em cadeia da polimerase (PCR). Apontar para usar um mínimo de 1000 ng de DNA na amplificação de PCR que se segue.
Nota: a Figura 3 demonstra exemplos representativos de géis, juntamente com as concentrações do DNA (com base nos resultados do espectrofotômetro), e o volume da solução de DNA que é recomendado para o multiplex Str PCR que se segue.
Figura 3: gel representativo para quantificação do DNA. São incluídas as concentrações de cada DNA, conforme medido com um espectrofotômetro, e as quantidades utilizadas para a PCR multiplex. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Amplificação do PCR
- Realize a genotipagem de microssatélites fluorescentes usando um sistema de STR Multiplex (tabela de materiais).
- Use as condições de PCR mostradas na Figura 4 para a amplificação de PCR usando o sistema multiplex Str (tabela de materiais).
Nota: Os seguintes primers são usados neste sistema multiplex STR: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, e penta D.
Figura 4: condições do ciclo de PCR para o sistema MULTIPLEX Str. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Resolva os produtos do PCR pela electroforese capilar.
- Suspender 1 μL de cada amostra amplificada em 0,5 μL da faixa padrão interna do sistema multiplex e 9,5 μL de formamida altamente desionizada (tabela de materiais).
- Execute amostras através de um instrumento capilar da electroforese (tabela dos materiais) usando uma matriz apropriada da separação (tabela dos materiais) para o instrumento e o jogo do corante do sistema multiplex.
- Análise de dados
- Analise os dados com um software de análise de fragmentos de DNA e compare os alelos POC com os alelos parentais para determinar sua origem.
- Configure um padrão de tamanho.
Nota: Isto permite que o software reconheça a escada que é usada no sistema do Str do multiplex, e atribua os emparelhadas aos amplicões baseados na escada. Os seguintes passos são para um software específico (tabela de materiais), mas pode ser de ajuda para a criação de outros tipos de software também.- Abra o software. Clique em Iniciar novo projeto e, em seguida, em novo tamanho padrão.
- Dê ao tamanho padrão um nome (por exemplo, ABI_600).
- Na caixa denominada Inserir novo tamanho padrão definição: digite o seguinte: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Em seguida, clique em Adicionar tamanho (s).
Nota: os números inseridos aparecerá a caixa à direita, que é denominado definição padrão de tamanho atual (consulte a Figura 5). - Clique em Save.
- Para importar e analisar um arquivo, clique em Adicionar arquivose escolha o arquivo FSA a ser analisado. Clique em Adicionar arquivos selecionados e, em seguida, em OK. Em seguida, siga estes passos:
- Localize a coluna tamanho padrão e escolha ABI_600 (ou qualquer nome foi dado ao padrão de tamanho).
- Em método de análise, clique em dimensionamento padrão-NPP e, em seguida, clique no botão verde Analyze .
- O arquivo agora está pronto para visualização. Ajuste as opções de visualização para visualizar os dados conforme desejado.
- Solução de problemas-método de análise
Nota: O software pode, por vezes, não conseguir identificar picos e alinhá-los corretamente. Isto acontece quando os picos são demasiado baixos ou demasiado elevados. Os dois métodos de análise a seguir podem corrigir isso e devem ser tentados antes que uma amostra seja retestada.- Método de análise 1 para picos altos:
- Estale sobre o método novo da análise e nomeie-o altos picos (ou um outro nome como por a preferência pessoal).
- Clique no intervalo e, em seguida, em intervalo parcial para a análise e dimensionamento. Em seguida, digite 100 para o ponto inicial e o tamanho inicial.
- Para o ponto de parada, digite 10.000. Para o tamanho de parada, insira 1000.
- Em seguida, clique em alturas mínimas de pico e alterar os números de modo que o limiar de pico para as cores é o seguinte: azul: 50; Verde: 50; Amarelo: 20; Vermelho: 100; Laranja: 5000.
- Salve o novo método de análise.
- Método de análise 2 para picos baixos:
- Estale sobre o método novo da análise e nomeie-o baixo picos (ou um outro nome como por a preferência pessoal).
- Clique no intervalo e, em seguida, em intervalo parcial para a análise e dimensionamento. Em seguida, digite 100 para o ponto inicial e o tamanho inicial.
- Para o ponto de parada, digite 10.000. Para o tamanho de parada, insira 1000.
- Em seguida, clique em bandeiras de qualidade e alterar o intervalo de passagem de tal forma que ele lê de 0,5 para 1. Mude a escala da baixa qualidade tal que lê de 0,0 a 0,0. Alterar assume linearidade para o seguinte: de (BP) 100,0 a (BP) 800,0.
- Salve o novo método de análise.
Nota: Agora é possível reanalisar um arquivo escolhendo picos baixos ou picos altos em método de análise e, em seguida, clicando no botão verde Analyze .
- Método de análise 1 para picos altos:
Figura 5: captura de tela mostrando o editor de tamanho padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. citometria de fluxo
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Escolhendo o bloco FFPE ideal
- Usando corrediças de H & e e um microscópio claro, selecione um bloco de FFPE que tenha aproximadamente 50 − 70% de seus tecidos compor do CV.
Nota: a Figura 6 é um exemplo representativo de um bloco apropriado para a análise de citometria de fluxo, pois é composto de aproximadamente 50% cv (metade direita da seção) e 50% de tecidos maternos (metade esquerda). A presença de tecidos maternos é importante porque servem como controle interno para o pico diploide. - Para os blocos que não têm a quantidade ideal de CV, enriquecer para CV como o corte é realizada. Para fazer isso, identifique qual lado das seções recém-cortadas contém mais CV de acordo com seu slide H & E correspondente. Com base nisso, use uma lâmina para cortar a outra metade que precisa ser descartada, a fim de enriquecer para CV.
Nota: a Figura 7 mostra um bloco que não tem CV suficiente para análise de citometria de fluxo. Para blocos como este, as seções precisam ser cortadas de tal forma que a metade que contém menos CV é descartada, a fim de aumentar as quantidades de CV em relação aos tecidos maternos, como mostrado na figura. Certifique-se de cortar mais seções para compensar o que é Descartado.
- Usando corrediças de H & e e um microscópio claro, selecione um bloco de FFPE que tenha aproximadamente 50 − 70% de seus tecidos compor do CV.
Figura 6: seção H &Amp; E representando um bloco POC que é ideal para citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Secção H &Amp; E que representa um bloqueio mais difícil para a citometria de fluxo. Esta seção representativa de H & E mostra que apenas a metade inferior desta seção deve ser utilizada para análise de citometria de fluxo, com o objetivo de enriquecer para o CV. A área esboçada, rotulada "CV", é composta principalmente de CV. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Corte
- Deixe os blocos no gelo por 15 min para facilitar o corte.
- Usando o melhor bloco FFPE possível, corte quatro seções que são 50 μm de espessura (ou 2 100 μm de espessura seções) usando um micrótomo.
Nota: Para a citometria de fluxo é preferível ter seções mais grossas. - No caso em que um bloco de FFPE ideal não está disponível, o objetivo de manter a proporção de CV para o tecido materno, no entanto. Por exemplo, se apenas 30% do bloco é composto de CV, enquanto o resto tem tecidos maternos, em seguida, remover pelo menos metade da seção que contém os tecidos maternos e usar mais seções para compensar (ver Figura 7).
- Coloque as secções em tubos de 15 mL rotulados.
Nota: Seja certo gravar sobre as etiquetas porque os reagentes orgânicos usados na etapa seguinte podem dissolver e remover a tinta.
- Protocolo de citometria de fluxo de tecidos FFPE
- Desparaffinização e reidratação
- Realize as seguintes lavas (tabela 3) uma capa de fumos.
- Encha o tubo de 15 mL com 6 mL do reagente apropriado, seguindo a ordem apresentada na tabela 3, deixe as secções nos reagentes para a respectiva duração e, em seguida, retire o reagente utilizando sucção a vácuo e uma pipeta Pasteur de vidro.
- Entre cada passo, mergulhe a pipeta Pasteur primeiro em 70% etanol, em seguida, em água destilada, e depois proceder para o próximo passo.
- Tenha muito cuidado para não remover partes de tecido juntamente com o reagente. Incline o tubo de 15 mL para um ângulo de 60 graus para facilitar a sucção do Reagente líquido sem desenhar os tecidos.
Atenção: Os líquidos descartados contêm xileno e devem ser eliminados em recipientes de resíduos de xileno.
- Preparação da solução
- Prepare a solução de citrato dissolvendo 2 g de ácido cítrico em 1 L de água destilada dupla. Traga o pH para 6. Conservar a 4 ° c.
- Prepare a solução de pepsina dissolvendo 0, 1 g de pepsina em 2 mL de 9 partes por mil NaCl, pH 1,64. Isto é para uma amostra.
Atenção: Pepsin é tóxico e pode facilmente dispersar e tornar-se transportado por via aérea. Use uma máscara ao segurar a pepsina em sua forma de pó e limpe toda a área de trabalho depois de usá-la. - Iodeto de propiídio (PI)-ribonuclease uma preparação de solução para uma amostra.
- Misturar 50 μL de PI com 450 μL de PBS (para diluir 10x).
- Adicionar 50 μL de ribonuclease a (1 mg/mL) à mistura. Mantenha embrulhado em folha em todos os momentos.
- Digestão e coloração
- Adicionar 4 ° c solução de citrato para os tubos de 15 mL, em seguida, colocar em um banho de água 80 ° c para 2 h.
- Deixe a solução arrefecer até à temperatura ambiente (15 min). Retire a solução de citrato.
- Adicione 6 mL de 1X PBS, vortex, e aguarde 1 − 2 min para permitir que os tecidos se instalem na parte inferior. Retire o 1X PBS usando sucção a vácuo e uma pipeta Pasteur de vidro.
- Adicione 1 mL de solução de pepsina (pré-aquecida a 37 ° c) e coloque em um banho seco de 37 ° c por 30 min. Vortex a cada 10 min. Prepare a PI-ribonuclease uma solução nos últimos 10 min desta incubação.
- Adicione 6 mL de 1X PBS, vortex, e aguarde 1 − 2 min para permitir que os tecidos se instalem na parte inferior. Retire o 1X PBS usando sucção a vácuo e uma pipeta Pasteur de vidro.
- Adicionar 550 μL da solução de PI-ribonuclease e colocar as amostras num banho seco de 37 ° c durante 30 min.
Nota: Neste ponto, as amostras podem ser embrulhadas em folha e deixada durante a noite a 4 ° c até a manhã seguinte. - Filtre a solução através de uma malha de filtração de 48 μm. Colete o filtrado em tubos de poliestireno de fundo redondo, que pode ser usado com o citometro de fluxo. Use fórceps para colocar um pedaço de 5 cm por 5 cm de malha de filtração na parte superior do tubo, de tal forma que o líquido pode ser pipetado através da malha e no tubo.
Nota: As amostras estão agora prontas para serem executadas com o citometro de fluxo. Mantê-los embrulhados em folha até que eles estão prontos para ser executado.
- Execute amostras com um citômetro do fluxo com a ajuda do técnico da plataforma da citometria do fluxo da organização.
Nota: O canal de PE é usado para detectar o DNA manchado de PI e a taxa de fluxo deve ser ajustada para retardar durante a aquisição. Assegure-se de que a tensão esteja escolhida de modo que o pico diploid esteja aproximadamente em 200 ao longo do eixo-x do PE-a para facilitar a análise e a interpretação. Apontar para gravar um mínimo de 20.000 eventos por amostra.
- Desparaffinização e reidratação
| Reagente utilizado (6 mL cada) | Duração |
| 1) xileno | 2 x 10 min |
| 2) 100% etanol | 2 x 10 min |
| 3) 95% etanol | 10 minutos |
| 4) 70% etanol | 10 minutos |
| 5) 50% etanol | 10 minutos |
| 6) água destilada | 2 x 10 min |
Tabela 3: reagentes e durações para desparaffinização e reidratação.
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Análise de dados de citometria de fluxo
- Analise dados com um software de análise de citometria de fluxo (tabela de materiais).
Nota: Os seguintes passos são para um software específico (tabela de materiais), mas pode ser de ajuda para a criação de outros tipos de software também.- Depois de executar as amostras em um citometro de fluxo, baixar FCS 2,0 arquivos para análise.
- Abra o software de análise de citometria de fluxo, clique em arquivo | Novo documento.
- Clique no ícone de histograma (
) e, em seguida, arraste o ponteiro para criar um retângulo. - Procure o arquivo FCS e, em seguida, clique em abrir. Ao longo do eixo x, clique em FCS-a e, em seguida, selecione PE-a.
- Clique no ícone de gráfico de pontos
() e arraste o ponteiro para criar outro retângulo abaixo do gráfico de histograma. Em seguida, procure o mesmo arquivo FCS que foi selecionado para o histograma. - Altere o eixo x do gráfico de pontos para PE- a e o eixo y para PE-W.
Nota: a Figura 8a demonstra a aparência das plotagens neste momento. - Clique no ícone de região (
) e desenhe uma caixa no gráfico de pontos que começa antes do pico diploide (em torno de 100 no eixo x na Figura 8B) e que termina em torno de 700 no eixo x, como mostrado no gráfico de pontos na Figura 8 O B.
Nota: O pico diploide na Figura 8 é aproximadamente em 200 no eixo x. Isto é escolhido arbitrariamente porque as amostras são gravadas através do cytometer do fluxo, para facilitar simplesmente a análise e a interpretação dos resultados. - Clique em Plot | Edite regiões/portõese digite R0 na célula que está ao lado da célula G0 em estratégia. Em seguida, clique em fechar.
- Clique em qualquer lugar no histograma, em seguida, em Plot | Formatar plotagem/sobreposição. portão, selecione G0 = R0 e, em seguida, clique em OK.
Nota: Esta é a etapa de gating que permite que um melhor visualize os picos do ploidia. O histograma agora deve se parecer com o histograma na Figura 8B. É possível jogar ao redor com a porta criada (movendo a caixa desenhada na etapa 2.4.1.7) a fim centrar-se sobre regiões específicas do lote do ponto. - Para rotular os gráficos, clique no ícone de área de
texto (), em seguida, arraste o ponteiro para criar uma caixa na parte superior do documento e, em seguida, digite as seguintes informações: ID do paciente, POC ID e o bloco usado (uma vez que pode haver vários blocos para um POC) , por cento CV presente no bloco, tensão usada para executar a amostra, e a data.
- Analise dados com um software de análise de citometria de fluxo (tabela de materiais).
) e, em seguida, arraste o ponteiro para criar um retângulo.
() e arraste o ponteiro para criar outro retângulo abaixo do gráfico de histograma. Em seguida, procure o mesmo arquivo FCS que foi selecionado para o histograma.
) e desenhe uma caixa no gráfico de pontos que começa antes do pico diploide (em torno de 100 no eixo x na Figura 8B) e que termina em torno de 700 no eixo x, como mostrado no gráfico de pontos na Figura 8 O B.
texto (), em seguida, arraste o ponteiro para criar uma caixa na parte superior do documento e, em seguida, digite as seguintes informações: ID do paciente, POC ID e o bloco usado (uma vez que pode haver vários blocos para um POC) , por cento CV presente no bloco, tensão usada para executar a amostra, e a data.
Figura 8: captura de tela exibindo um histograma e um gráfico de pontos de uma amostra representativa que é ungated (a) e gated (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
A complexidade dos tecidos molares e o fato de que eles podem ter vários genótipos necessitam de uma análise rigorosa e o uso de vários métodos, como avaliação morfológica, imunohistoquímica P57, genotipagem de microssatélites, citometria de fluxo e FISH. Por exemplo, um paciente (1790) foi consultado com os dois PHM que foram encontrados para ser triploid pela análise do microarray dos POCs somente. O paciente foi diagnosticado conseqüentemente com o PHM periódico. O Microsatellite que genotipagem de seus dois "PHM" junto com o ADN do paciente e de seu sócio revelou que quando a primeira toupeira do paciente for chimerism triploid (Figura 9a), seu segundo "PHM" tem um genótipo tripronuclear triploid (Figura 9 B) e, portanto, não é um PHM, mas um aborto não-molar.
O primeiro marcador na Figura 9a (em preto) mostra dois picos no POC. O primeiro pico origina-se da mãe, uma vez que apenas a mãe tem um pico deste tamanho. Seguindo o mesmo raciocínio, o segundo pico origina-se do pai desde que ele compartilha o mesmo alelo. Observe como o segundo pico é muito maior do que o primeiro, indicando que há provavelmente duas doses do mesmo alelo paternal nesse pico. A contaminação materna, que será explicada em mais detalhes mais tarde, é muito mínima neste POC porque o POC exibe um pico muito minúsculo na posição do segundo alelo materno.
O segundo marcador na Figura 9a (em azul) mostra três picos no POC. Dois destes picos originam-se do pai e um da mãe. Assim, é evidente novamente a partir desse marcador que há três alelos presentes no POC, dois do pai e um da mãe. O terceiro e quarto marcadores na Figura 9a são semelhantes ao primeiro marcador, e também mostram dois alelos vindos do pai e um da mãe.
Uma vez que todos os quatro marcadores consistentemente mostram três alelos (por dose ou pela presença de três alelos de diferentes tamanhos), dois originários do pai e um da mãe, pode-se concluir que este POC é dispermic triploide, e confirma o diagnóstico de PHM.
Todos os quatro marcadores na Figura 9B novamente mostrar três alelos: o primeiro marcador mostra duas doses no primeiro pico que se originam da mãe e uma dose no segundo pico que se origina do pai. O segundo e o quarto marcadores mostram três picos diferentes (ou seja, três alelos diferentes), dois dos quais são da mãe. O terceiro marcador mostra uma dose no primeiro pico originário do pai e duas doses no segundo pico originário da mãe. Conseqüentemente, este POC é tripronuclear triploid na origem desde que dois jogos dos cromossomas vêm da mãe e um jogo vem do pai. É, portanto, um aborto não molar.
Figura 9: resultados representativos de genotipagem do paciente 1790. (A) Selecione os resultados de genotipagem da primeira concepção do paciente mostrando um genótipo chimerism triploid. (B) selecione genotipagem resulta da segunda concepção do paciente mostrando um genótipo tripronuclear triploid. O eixo x está em basepairs; as etiquetas e os tamanhos dos basepair foram omitidos para a simplicidade. O eixo y representa a altura de pico e é similarmente omitido da figura para simplificar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este paciente foi diagnosticado mal inicialmente com dois PHM e estava preocupando-se sobre um risco aumentado de mais toupeiras quando teve um único PHM. Este caso destaca a limitação do microarray SNP no POC sozinho. O Microarranjo de SNP é um método poderoso e é o melhor para detectar aneuploidias de todo o cromossoma (trisomies, monosomies, ou genótipos não-diploid); no entanto, quando realizada no POC sozinho sem analisar o DNA parental, a origem da triploidy não pode ser determinada. Para mais explicações sobre a análise e interpretação dos genótipos, por favor, consulte o estudo de Murphy et al.16.
Os resultados representativos mostrados na Figura 10a são de uma concepção triploid. Os valores do eixo x representam o conteúdo de DNA nuclear. Por exemplo, 200 é um número arbitrário dado às células que contêm uma certa quantidade de conteúdo de DNA nuclear. Portanto, um pico em 400 representa as células que contêm o dobro da quantidade de conteúdo de DNA nuclear em comparação com o pico 200. O pequeno pico em torno de 300 representa o conteúdo de DNA nuclear que está entre o pico de 200 e 400 e é, portanto, o pico triploide. Observe como uma concepção diploide (Figura 10B) não contém nenhum pico no valor de 300.
Em alguns casos, o pico triploide é muito sutil (Figura 10C). Sempre que um pico triploide mal perceptível é observado, é importante considerar primeiro a quantidade de CV que estavam presentes nas secções utilizadas para a análise de citometria de fluxo. Se as seções tinham menos de cerca de 20% CV, então provavelmente será uma verdadeira triploidy, uma vez que é esperado para ser um pico muito baixo. Se as seções tomadas tiveram quantidades elevadas de CV, o POC torna-se suspeito do mosaicism com a presença de uma outra população celular diploid. Isto pode ser verificado rerevisando os resultados de genotipagem para ver se cabem um paterno triploid perfeito ou pode igualmente ser confirmado pelo peixe com pontas de prova dos cromossomas de X, de Y, e de 18. Além disso, usando o software descrito neste artigo, é possível definir portões específicos, conforme descrito na seção 2.4.1, que permitem que o usuário se concentre em uma região específica para enriquecer para células triploides se eles realmente existirem.
Figura 10: resultados representativos da citometria de fluxo demonstrando concepções triploides em (a) e (C), e uma concepção diploide em (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Hm são gravidezes humanas anormais com etiologias heterogêneas e têm tipos histológicos e genotípica diferentes, que faz sua classificação exata e o diagnóstico que desafiam. A avaliação morfológica histopatológica foi provada frequentemente imprecisa e é conseqüentemente não confiável no seus próprios classificar HM em CHM e em PHM e distingui-los dos abortos do não-molar. Conseqüentemente, um diagnóstico exato do HM exige o uso de outros métodos tais como o Genotyping multiplex do ADN do microssatélites, a análise do ploidia pela citometria do fluxo, a análise do ploidia por peixes, e o P57KIP2 immunohistochemistry. Cada um desses métodos tem suas próprias limitações e vantagens.
Limitações e vantagens da genotipagem multiplex e citometria de fluxo
A contaminação materna é uma das questões mais comuns quando se trabalha com tecidos de FFPE e pode levar ao diagnóstico errado, destacando a importância da separação materno dos tecidos POC. É importante identificar a contaminação materna, a fim de ter uma ideia do que esperar dos picos de genotipagem e ajudar na sua interpretação. Se o nível de contaminação é muito grande e impede a interpretação confiável dos resultados, em seguida, repita o isolamento de DNA e extração, tomando cuidado extra na remoção de todos os tecidos maternos possíveis. Em regiões onde a morfologia dos tecidos não é clara, é melhor remover essas regiões para minimizar a chance de contaminação materna. A primeira vantagem do método descrito neste protocolo, além de seu menor custo, é que os tecidos maternos são removidos das lâminas, enquanto outros métodos consistem na coleta de tecidos POC (cobrindo-os com solução que polimeriza quando exposto ao ar e levantar os tecidos) sem remover os tecidos maternos. O método descrito aqui, portanto, permite que um olhar segundo os tecidos POC restantes, re-limpá-los se necessário, como é frequentemente o caso, e, em seguida, recolher e extrair o DNA a partir deles. A segunda vantagem é que nós limpamos os tecidos em uncoverescorregou as seções manchadas de H & E, que facilita extremamente a remoção de tecidos maternos, ao contrário do uso de seções unmanchado e de uma corrediça coverescorregada do mapa. No entanto, a coloração adicional pode degradar ainda mais o DNA, e isso é compensado pela adição de mais seções.
A disponibilidade de DNA parental para a análise é outro desafio. A presença de ambos os pais facilita muito a análise e interpretação dos resultados da genotipagem. Infelizmente, no entanto, é muitas vezes o caso do DNA do pai não está disponível, o que pode, por vezes, complicar a análise, especialmente nos casos em que a qualidade do DNA POC é pobre devido à fixação prévia ou armazenamento a longo prazo (mais frequente quando se trabalha com HM recorrente). Além disso, o sangue materno pode não estar sempre disponível para extração de DNA. Nesses casos, o DNA materno pode ser extraído de tecidos endometriais maternos presentes nos blocos de FFPE, conforme descrito anteriormente16. Além disso, caracterizar os tecidos molares que resultaram do uso de tecnologias reprodutivas assistidas pode complicar a análise do genótipo microssatélite porque, na maioria dos casos, o DNA dos doadores (machos ou fêmeas) geralmente não está disponível.
Por fim, o fato de que os picos maiores tendem a ser mais curtos em termos de altura máxima é outra possível fonte de confusão, particularmente quando as alturas de pico precisam ser usadas para determinar se há duas doses ou uma dose em um único pico. Uma maneira de superar isso é sempre ter em mente que os picos de tamanho alelo Grande (número de pares de base) tendem a ser mais curtos, devido à natureza degradada do DNA de tecidos FFPE, o que torna menos DNA disponível para a amplificação de alelos maiores. Além, uma amplificação mais curta do fragmento do PCR toma menos tempo do que um maior, e a amplificação exponencial do ADN conduz a poucas quantidades de alelos maiores.
A principal desvantagem da citometria de fluxo é que as concepções triploides às vezes podem ser perdidas, e isso pode ser devido a quantidades insuficientes de CV no bloco. Entretanto, a presença de um pico triploid é uma indicação conclusiva de um triploidy. Note-se que este método não é sensível o suficiente para detectar trissomias, concepções tetraploides, ou outros aneuploidias usando este protocolo. Os conceptions de tetraplóides não são detectáveis por este protocolo porque o pico tetraplóides corresponde ao mesmo pico de pilhas diploid na fase G2 do ciclo da pilha.
Conhecer essas limitações e desafios ajuda na redução de erros. É assim importante e às vezes necessário analisar o mesmo tecido com métodos diferentes, comparar os resultados, e certificar-se de que estão concordantes um com o outro. Se não são, os resultados precisam de ser reconsiderados e as análises precisam de ser repetidas. Para os vários casos que mostraram resultados conflitantes, as discrepâncias foram resolvidas simplesmente repetindo os experimentos e tomando o cuidado adequado para evitar o problema original. Em outros casos, as discrepâncias foram resolvidas realizando métodos adicionais tais como peixes em seções do tecido ou realizando a genotipagem simplex adicional com marcadores apropriados.
Identificação da contaminação materna
Com relação à identificação da contaminação do DNA POC com DNA materno, o nível de contaminação será refletido ou reconhecido pela presença de todos os alelos maternos em todos os Locos do POC, além do alelo materno (s) que são transmitidos ao POC.
Na Figura 11a, os picos originários da contaminação materna do ADN são rotulados com um "c". Observe como cada pico marcado com um "c" também está presente na mãe, e vemos esses picos "c" em todos os três marcadores. Note-se que para o segundo marcador (em azul), o pico de contaminação materna indicado por um "c" é maior do que cada pico "c" no primeiro marcador porque a mãe é homozygous para o segundo marcador; a altura do contaminante é, portanto, duplicada para este marcador. Neste POC, não há picos materna derivados. Em outras palavras, este POC não herdou nenhum alelos da mãe. Há apenas um pico real em cada marcador e este pico não está presente na mãe. Portanto, sabemos que os verdadeiros picos devem ter vindo do pai. Com a informação ploidia da análise da citometria do karyotype ou do fluxo que demonstra diploidy, é possível concluir que este POC é androgenética na origem e diploid.
Além disso, esses três marcadores na Figura 11A revelam que há sempre apenas um pico real para cada marcador. Somente três marcadores são ilustrados aqui, entretanto, os jogos do multiplex vêm frequentemente com muitos mais marcadores que igualmente revelarão o mesmo teste padrão. Uma vez que este POC é diploide, deve haver duas doses em cada pico. Com esta informação, nós podemos concluir que este POC é monospérmicos androgenética e é homozygous em cada único marcador.
A Figura 11B representa um POC diploide biparental. A barra preta pequena através do primeiro pico do primeiro marcador (no verde) representa a quantidade estimada de contaminação que está atual dentro deste pico real. O "R" indica a porção real deste pico proveniente do DNA POC; o "c" representa a porção contaminante deste pico proveniente do DNA materno. Como se pode identificar o nível de contaminação? É possível, neste caso, quando um marcador é heterozygous na mãe porque um dos alelos maternos é ausente no POC. O pequeno pico no primeiro marcador rotulado com "c", por exemplo, indica que este é o nível de contaminação que deve ser esperado para o outro pico materna herdado. Consequentemente, todos os picos de POC que são de origem materna são ligeiramente superiores aos picos paternalmente herdados devido à pequena quantidade de contaminação. Para o terceiro marcador (em preto) na Figura 11B, espera-se que o nível de contaminação seja o dobro da quantidade habitual (porque a mãe é homozygous para este marcador específico), e um pode conseqüentemente inferir que há somente uma dose no primeiro pico no POC.
A Figura 11C ilustra um POC chimerism triploid. O primeiro marcador (em verde) mostra três picos no POC. Uma vez que estes três picos têm alturas semelhantes, é possível concluir que este POC é provavelmente triploide. Observe que o terceiro pico neste marcador é menor do que o primeiro. Isto é esperado porque, como uma tendência geral, os picos maiores tendem a ser mais curtos. O segundo pico é um pouco maior do que o primeiro, e isso pode ser contabilizado por uma pequena quantidade de contaminação materna, como indicado pela barra e "c". Além disso, dois destes três picos não estão presentes na mãe, e, portanto, deve ter vindo do pai. Até agora, este marcador indica que o POC poderia ser triploid (ou um trisomy) e que a origem do jogo extra dos cromossomas é paternal. Indica também que é uma concepção chimerism, desde que o POC herdou dois alelos diferentes do pai.
O segundo marcador (em azul) na Figura 11C tem apenas dois picos. Após a contabilização do nível de contaminação, o segundo pico aparece maior do que o primeiro, e isso é, apesar da tendência geral para que os picos maiores sejam menores (uma tendência que deve ser sempre mantida em mente durante a análise). Assim, é provável que haja duas doses em que um grande pico. Isso também é apoiado pelo fato de que o primeiro marcador é indicativo de triploidy.
Por fim, o terceiro marcador (em preto) na Figura 11C mostra três picos, novamente indicativos de triploidy. Como a maioria dos marcadores em kits multiplex vêm de diferentes cromossomos, é possível concluir com confiança que um POC é triploide depois de observar a mesma tendência de três alelos em vários marcadores diferentes. Anote também deste marcador que dois dos três picos originam do pai, confirmando a origem chimerism.
Figura 11: resultados de genotipagem ilustrando o efeito da contaminação materna. Os painéis superiores mostram os alelos que pertencem ao POC e os painéis inferiores mostram aqueles que pertencem à mãe. Em (a), o POC é monospérmicos androgenética e o nível de contaminação é realçado por uma seta e pela letra "c." Em (B), o POC é diploid biparental, e o nível de contaminação é realçado pela letra "c". Em (c), o POC é chimerism triploid e o nível de contaminação é realçado pela letra "C." As pequenas barras pretas mostram o quanto das alturas de pico vem da contaminação materna e, portanto, devem ser levadas em consideração ao comparar alturas de pico. O eixo x está em basepairs; as etiquetas e os tamanhos dos basepair foram omitidos para a simplicidade. O eixo y representa a altura de pico e é similarmente omitido da figura para simplificar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Exemplos de casos desafiadores
Para um número de casos, era somente possível chegar em uma conclusão tendo todas as três avaliações simultaneamente (isto é, fluxo, P57KIP2, e Genotyping multiplex). Por exemplo, um caso (808) foi referido como um aborto não-molar. A avaliação histopatológica levou à suspeita de uma concepção molar e a análise de genotipagem do POC revelou um marcador que mostrou claramente três picos (dois do pai e um da mãe). Os resultados P57KIP2 não foram conclusivos. A análise da citometria de fluxo revelou um pequeno pico triploide que foi confirmado com a análise de FISH, que também descartou a presença de outra população celular diploide. Com a confirmação do FISH, foi possível concluir que o POC é de fato uma toupeira dispermica triploide.
Outro caso (1192) também foi referido como aborto não molar. O CV deste POC foi misturado com os tecidos maternos e era altamente Necrotic também, fazendo o processo de limpeza muito desafiante. Consequentemente, a primeira análise de genotipagem mostrou um alto nível de contaminação materna, de modo que todo alelo materno poderia ser observado no POC (uma boa indicação de possível contaminação). Além disso, o P57KIP2 foi infelizmente inconclusivo, provavelmente devido à natureza necrótica do tecido, talvez por causa da fixação atrasada. Os resultados da citometria do fluxo, entretanto, eram indicativos do triploidy, que foi confirmado igualmente por peixes. O DNA foi reextraído com o objetivo de reduzir o nível de contaminação e remover os tecidos com morfologia pouco clara. A análise dos novos resultados de genotipagem, enquanto contabilizando a provável presença de contaminação materna, permitiu concluir que o POC era um triploide chimerism XXY PHM.
A tabela 4 descreve os métodos típicos utilizados para análise. Recomenda-se o uso de avaliação morfológica e P57KIP2 imuno-histoquímica em todos os tecidos suspeitos de HM e pelo menos um método de genotipagem. Entre os métodos de genotipagem, o mais informativo é a genotipagem do DNA multiplex. Quando os resultados entre diferentes métodos não são concordantes ou quando alguns resultados são inconclusivos, outros métodos de genotipagem precisam ser usados. A tabela demonstra resultados concordantes esperados para cada tipo possível HM junto com exceções raras e recomendações para resolvê-los.
Tabela 4: ordem típica de análise, resultados esperados e raras exceções, juntamente com recomendações para resolvê-los. P57KIP2 immunohistochemistry aponta detectar a expressão de P57KIP2, a proteína codificada pelo gene CDKN1C . Este gene é imprimido paternally no cytotrophoblast e no estroma villous da placenta do primeiro trimester e é expressado somente do genoma materno. É, portanto, utilizado como marcador auxiliar para detectar, de forma fácil e barata, a presença do genoma materno no POC. Recomenda-se realizar P57KIP2 imuno-histoquímica para todos os POCs suspeitos de ser hm em paralelo à avaliação morfológica. No laboratório do autor, são utilizados os anticorpos P57KIP2 e as plataformas indicadas na tabela de materiais e os autores estão muito satisfeitos com a qualidade dos resultados. Abreviaturas: IHC = immunohistochemistry; DIP e = androgenética diploide; DIP bip = diploid biparental; Chr = cromossoma; MC = aborto espontâneo; e TP = proliferação trofoblástica.
Ao melhor do conhecimento dos autores, este artigo é o primeiro a fornecer protocolos detalhados para a citometria de fluxo assim como a genotipagem multiplex de baixo custo e de alta qualidade do ADN do microssatélites de tecidos do POC de ffpe. A interpretação dos resultados também é descrita, juntamente com sua solução de problemas e integração com os de outros métodos para alcançar conclusões precisas e diagnósticos de POCs e HM. Os autores sinceramente esperam que este artigo possa ser útil para pesquisadores que tentam entender essa entidade complexa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Sophie Patrier e Marianne Parésy por compartilharem o protocolo original de citometria de fluxo, e Promega e Qiagen para fornecimento de suprimentos e reagentes. Este trabalho foi apoiado pelo Réseau Québécois en reprodução e o Instituto canadense de pesquisa em saúde (MOP-130364) para o RS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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