Summary
Hydatidiform моли являются ненормальные беременности человека с разнородными этиологиями, которые могут быть классифицированы в соответствии с их морфологических особенностей и родительского вклада в молярового геномов. Здесь подробно описаны протоколы мультиплексной микроспутниковой ДНК генотипирования и цитометрии потока формалино-фиксированных парафин-встроенных моляровских тканей, а также интерпретации результатов и интеграции.
Abstract
Hydatidiform моль (HM) является ненормальной человеческой беременности характеризуется чрезмерным трофиобластным пролиферацией и аномальным эмбриональным развитием. Существует два типа HM на основе микроскопической морфологической оценки, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM). Они могут быть дополнительно подразделены на основе родительского вклада в моляровские геномы. Такая характеристика HM, морфологии и генотипа анализов, имеет решающее значение для управления пациентом и для фундаментального понимания этой интригующей патологии. Хорошо задокументировано, что морфологический анализ Hm подвержен широкой изменчивости межнаблюдателей и не является достаточным сам по себе, чтобы точно классифицировать HM в CHM и PHM и отличить их от гидропиковых немолярных абортов. Генотипный анализ в основном проводится на ДНК и тканях из формалино-фиксированных парафин-встроенных (FFPE) продуктов зачатия, которые имеют меньше, чем оптимальное качество и, следовательно, может привести к неправильным выводам. В этой статье предоставляются подробные протоколы для мультиплексного генотипирования и цитометрии потока, а также интерпретация результатов этих методов, их устранение неполадок и интеграция с морфологической оценкой , p57KIP2 иммуногистохимия, и флуоресценция на месте гибридизации (FISH) для достижения правильной и надежной диагностики. Здесь авторы делятся методами и уроками, извлеченные за последние 10 лет из анализа примерно 400 продуктов зачатия.
Introduction
Гиматидиформная родинка (Hm) является ненормальной человеческой беременности характеризуется аномальным эмбриональным развитием, гиперраспространением трофобласта и гидропикной дегенерацией хорионического вилли (CV). Исторически сложилось так, что HM раньше был разделен на два типа, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM) на основе только морфологической оценки1. Тем не менее, было показано, что морфологическая оценка сама по себе не является достаточной, чтобы классифицировать HM в два подтипа (CHM и PHM) и отличить их от немолярных выкидышей2,3,4.
Поскольку CHM и PHM имеют различные склонности к злокачественным новообразованиям, поэтому важно точно определить генотипический тип HM, чтобы обеспечить надлежащее наблюдение и управление пациентами. Следовательно, в последние десятилетия было разработано и разработано несколько методологий с целью выявления вклада родителей в моляровые ткани и достижения правильной классификации НМ. К ним относятся кариотипный анализ, хромосомный полостальный полиморфизм, антиген лейкоцита человека (HLA) серологический типизон, полиморфизм длины фрагмента ограничения, переменное количество тандемных повторов, микроспутниковая генотипирование, цитометрия потока и p57 KIP2 иммуногистохимия. Это позволило точное разделение HM концепций на основе родительского вклада в их геномы, а именно: CHM, которые являются диплоидных андрогенетических моноспермных или диплоидных андрогенетических диспермических, и PHM, которые являются триплоид, диспермические в 99% и моноспермный в 1% случаев5,6,7,8. Кроме того, есть еще один генотипический тип HM, который появился в последние два десятилетия, который является диплоидный biparental. Последнее в основном повторяются и может повлиять на одного члена семьи (простые случаи) или, по крайней мере, двух членов семьи (семейные случаи). Эти диплоидные дьюдетские родинки в основном вызваны рецессивными мутациями в NLRP7 или KHDC3L у пациентов9,10,11,12. Диплоид ный родитель HM у пациентов с рецессивными мутациями в NLRP7 может быть диагностирован как CHM или PHM морфологическим анализом, и это, как представляется, связано с тяжестью мутаций у пациентов13,14. В дополнение к классификации HM в соответствии с их генотипами, введение и использование нескольких методов генотипирования позволило различать различные молярые сущности от немолянных выкидышей, таких как анеплодоидные диплоидные двухродительские концепции и другие типы зачатий5,15. Такие концепции могут иметь некоторое распространение трофобластов и ненормальную злобную морфологию, которые в некоторой степени имитируют некоторые морфологические особенности Hm.
Целью данной статьи является предоставление подробных протоколов для мультиплексной генотипирования и цитометрии сфиксированными парафиновыми (FFPE) тканями, а также комплексный анализ результатов этих методов и их интеграция с другими методами правильный и убедительный диагноз моляровских тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Советом по институциональному обзору McGill. Все пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании и на получение их продуктов FFPE зачатия (POCs) из различных патологических отделений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя существует несколько методов определения генотипирования и плоиды с помощью цитометрии потока, представленные здесь протоколы описывают один метод анализа с использованием одной платформы для каждого из них.
1. Генотипирование
-
Выбор лучшего блока FFPE
- Для каждого продукта FFPE зачатия (POC), подготовить 4 мкм толщиной гематоксилин и эозин (H и E) окрашенных разделов, как описано в разделах 1.2 и 1.3, по одному для каждого доступного блока, для морфологической оценки с помощью микроскопии.
- Используя h и E слайды и легкий микроскоп, выберите блок FFPE, который имеет наибольшее количество хорионических вилли (CV), и, если возможно, блок, который имеет резюме отдельно от, а не переплетемые с материнскими тканями.
-
Сечения
- Поместите выбранный блок на льду в течение 15 минут, чтобы облегчить секцию.
- Отрегулируйте микротом, чтобы сократить разделы, которые 4 мкм толщиной для микроскопической морфологической оценки и 10 мкм толщиной для извлечения ДНК.
- Поместите холодный блок в микротоме и вырежьте по одному разделу из каждого блока для окрашивания Н и Е и 10-30 секций из выбранного блока, в зависимости от количества резюме в блоке, для извлечения ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для блоков, которые полны cv, 10 разделов достаточно для извлечения ДНК. Если только около 10% блока содержит CV, в то время как остальные материнские ткани, то 20-30 разделов необходимы для обеспечения достаточного количества ДНК. - Используя щипчи, перенесите каждую секцию на водяную ванну 45 градусов по Цельсию. Возьмите раздел из водяной ванны с положительно заряженной слайд (Таблица материалов), который ранее помечены с образцом идентификационного номера с помощью карандаша.
- Поместите слайды, содержащие секции, в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы разделы должны были придерживаться слайдов. Держите слайды для Н И Е в духовке в течение 25 минут. Держите слайды для извлечения ДНК в духовке в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время инкубации делает ткани чуть менее приверженными слайдам и, следовательно, облегчает удаление материнских тканей.
-
Н И E окрашивания
- Дайте слайдам остыть до комнатной температуры (10 мин).
- Подготовка реагента
- Подготовка рабочего решения Eosin Y (0.25%) в таблице 1. Хорошо перемешать и хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте рабочий раствор гематоксилина, разбавив в воде бульонный раствор гематоксилина 5x (т.е. смешайте 80 мл воды с 20 мл гематоксилина).
ПРИМЕЧАНИЕ: Заверните бульонный раствор гематоксилина в фольгу для хранения.
- Подготовка окрашивания банки с правильными реагентами под дымом капот в соответствии с таблицей 2.
- Выполните H и E окрашивания путем погружения слайдов в соответствующие окрашивающие банки для правильного периода времени в соответствии с таблицей 2.
- Смонтировать 4 мкм разделы для морфологического анализа с монтажом среды и покрывало со стеклянными крышками(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкм разделы для генотипирования не должны быть coverslipped. - Оставьте 10 мкм разделов под дымом капот как минимум 3 ч для того, чтобы токсичные запахи ксилена рассеять.
ПРЕДЕКТО: Все шаги окрашивания должны быть выполнены под капотом дыма. Ксиленовые продукты должны храниться под капотом во все времена, потому что запахи ксилена токсичны. Кроме того, ксилен и гематоксилин необходимо отбросить в специальных контейнерах. После того, как эти контейнеры заполнены, они должны быть удалены в соответствии с рекомендациями организации по безопасности лаборатории.
| Реагента | Количество |
| Акционерное решение Eosin Y (1%) | 250 мл |
| 80% Этанол | 750 мл |
| Ледниковая ацетическая кислота (концентрированная) | 5 мл |
Таблица 1: Рабочее решение Eosin Y (0.25%) Подготовка.
| Используется реагент (100 мл на бен) | Длительность |
| 1) Ксилен | 5 мин. |
| 2) Ксилен | 5 мин. |
| 3) 100% этанол | 2 мин. |
| 4) 95% этанол | 2 мин. |
| 5) 70% этанол | 2 мин. |
| 6) 50% этанол | 2 мин. |
| 7) Дистиллированная вода | 5 мин. |
| 8) Гематоксилин | 4 мин. |
| 9) Дистиллированная вода | 5 мин. |
| 10) Эосин | 1 мин. |
| 11) 95% этанол | 5 мин. |
| 12) 100% этанол | 5 мин. |
| 13) Ксилен | 5 мин. |
| 14) Ксилен | 5 мин. |
Таблица 2: Реагенты и длительность для протокола окрашивания Н и Е.
-
Изоляция резюме
- Под легким стереомикроскопом, используйте щипцы и небольшие кусочки воды смачивают бумажные салфетки(Таблица материалов), чтобы соскребать нежелательные материнские ткани из H и E-окрашенные 10 мкм толщиной разделов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная цель состоит в том, чтобы держать ничего, кроме резюме или плода мембраны (при настоящем) на слайдах и, таким образом, чтобы удалить все другие ткани. Этот шаг может потребовать сятвения и терпения, в зависимости от блока, так как он требует тщательного внимания к деталям. - У второго лица перепроверить слайды после очистки, чтобы убедиться, что они свободны от материнских тканей.
- Сфотографируйте очищенные слайды или задокументируйте следующее, чтобы помочь с интерпретацией данных: 1) было ли ткани трудно чистить, геморрагические, или очень чистые, 2) количество используемых разделов, и 3) приблизительное количество очищенных тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 является примером слайда, который легко чистить. Для блока, содержащего примерно такое количество резюме, достаточно 10 секций для извлечения ДНК. Слайд на рисунке 2 имеет очень мало резюме, которые перепходят с материнскими тканями, что делает его очень трудным и трудоемким для очистки. Для блока, содержащего примерно такое количество резюме, для извлечения ДНК требуется 30 секций. - Соберите резюме с помощью небольших увлажненных кусочков бумаги салфетки. Используя щипцы, разорвать крошечный кусок из увлажненной бумаги салфетки и использовать его для сбора резюме.
- Поместите кусочки бумаги салфетки с их прилагается CV в помечены 1,5 мл трубки.
- Свести к минимуму количество бумажных салфеток, используемых в этом шаге, как слишком много может засорить колонку извлечения ДНК и, следовательно, уменьшить окончательное количество собранной ДНК. В среднем, цель использовать менее семи небольших кусочков бумаги салфетки на образец. Если это невозможно из-за наличия большого количества cv, разделить образец между двумя трубками для облегчения извлечения.
- Под легким стереомикроскопом, используйте щипцы и небольшие кусочки воды смачивают бумажные салфетки(Таблица материалов), чтобы соскребать нежелательные материнские ткани из H и E-окрашенные 10 мкм толщиной разделов.
Рисунок 1: Представитель слайд для генотипирования. Вверху: слайд, который должен быть "очищен", чтобы освободиться от материнских тканей. Внизу: тот же слайд, показанный после того, как он был очищен и теперь содержит только резюме для извлечения ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель слайд для генотипирования. Вверху: слайд, который должен быть "очищен", чтобы освободиться от материнских тканей. Внизу: тот же слайд, показанный после того, как он был очищен и теперь содержит только резюме для извлечения ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Следуйте протоколу извлечения ДНК из комплекта FFPE (Таблица материалов) для выполнения экстракции ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые комплекты рекомендуют использовать буфер elution 15–20 л для окончательного элюционного буфера. Из опыта, elution с 15 злиционным буфером elution хорошо работает для большинства образцов. Разбавления могут быть подготовлены из запасов ДНК по мере необходимости.
-
Количественная оценка ДНК
- Используя лабораторно-спектрофотометрическое устройство, загрузите 1 кВ л ДНК и измерьте абсорбцию на уровне 260 нм для количественной оценки.
- Загрузите 1 зл ДНК на 2% агарозный гель и запустите электрофорез геля при напряжении 80–100 В для качественной оценки.
- На основе результатов шагов 1.6.1 и 1.6.2, выберите объем ДНК, который будет использоваться в мультиплексе короткого тандемного повтора (STR) полимеразной цепной реакции (ПЦР). Цель использовать как минимум 1000 нг ДНК в усилитель ПЦР, что следует.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показаны репрезентативные примеры гелей наряду с концентрациями ДНК (на основе результатов спектрофотометра) и объемом решения ДНК, которое рекомендуется для пЦР мультиплекса STR, который следует за этим.
Рисунок 3: Представительгель для количественной оценки ДНК. Включены концентрации каждой ДНК, как измеряется с помощью спектрофотометра, и количества, используемые для мультиплекса ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
-
Усиление ПЦР
- Выполните флуоресцентный микроспутниковый генотипирование с помощью мультиплексной системы STR(Таблица материалов).
- Используйте условия ПЦР, показанные на рисунке 4, для усиления ПЦР с помощью мультиплексной системы STR(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие праймеры используются в этой мультиплексной системе STR: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 и Penta D.
Рисунок 4: Условия цикла ПЦР для мультиплексной системы STR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
-
Разрешить пЦР продукты капиллярным электрофорасом.
- Приостановить 1 зл каждого усиленного образца в 0,5 л внутренней стандартной полосы мультиплексной системы и 9,5 зла высокодейонизированного формамида(Таблица материалов).
- Запуск образцов через капиллярный электрофорекс инструмент(Таблица материалов) с использованием соответствующей матрицы разделения (Таблица материалов) для инструмента и набор красителя мультиплексной системы.
- Анализ данных
- Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа фрагментов ДНК и сравните аллели POC с родительскими аллелями, чтобы определить их происхождение.
- Настройка стандарта размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет программному обеспечению распознавать лестницу, которая используется в мультиплексной системе STR, и назначать базовые пары ампронов на основе лестницы. Следующие шаги для одного конкретного программного обеспечения(Таблица материалов),но может быть поможет для создания других типов программного обеспечения, а также.- Откройте программное обеспечение. Нажмите на Начало нового проекта, а затем на новый стандарт размера.
- Дайте стандарту размера имя (например, ABI-600).
- В поле под названием Введите новый размер стандартного определения: введите следующее: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 450. Затем нажмите на Добавить размер (ы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Введенные номера будут отображаться под полем справа, который называется Текущее стандартное определение размера (см. Рисунок 5). - Нажмите на Сохранить.
- Чтобы импортировать и анализировать файл, нажмите на Добавить файлыи выбрать fsa файл для анализа. Нажмите на Добавить выбранные файлы, а затем на OK. Затем выполните следующие действия:
- Найдите столбец Standard size и выберите ABI-600 (или какое бы имя ни было дано стандарту размера).
- При методе анализанажмите на Sizing Default - NPP, а затем нажмите на зеленую кнопку анализа.
- Файл готов к просмотру. Отрегулируйте параметры просмотра, чтобы просматривать данные по желанию.
- Устранение неполадок - метод анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение может иногда не определить пики и выровнять их правильно. Это происходит, когда пики либо слишком низки, либо слишком высоки. Следующие два метода анализа могут исправить это и должны быть опробованы до повторного тестирования образца.- Метод анализа 1 для высоких пиков:
- Нажмите на новый метод анализа и назовите его High Peaks (или другое имя в зависимости от личных предпочтений).
- Нажмите на диапазон, а затем на частичный диапазон для анализа и размеров. Затем введите 100 для стартовой точки и размера старта.
- Для стоп-пойнтавведите 10 000. Для стоп-размеравведите 1000.
- Затем нажмите на минимальные пиковые высоты и измените цифры таким образом, чтобы пиковый порог для цветов был следующим: Синий: 50; Зеленый: 50; желтый: 20; Красный: 100; Оранжевый: 5000.
- Сохранить новый метод анализа.
- Метод анализа 2 для низких пиков:
- Нажмите на новый метод анализа и назовите его Low Peaks (или другое имя в зависимости от личных предпочтений).
- Нажмите на диапазон, а затем на частичный диапазон для анализа и размеров. Затем введите 100 для стартовой точки и размера старта.
- Для стоп-пойнтавведите 10 000. Для стоп-размеравведите 1000.
- Затем нажмите на флаги качества и измените диапазон Pass таким образом, чтобы он читает от 0,5 до 1. Измените диапазон низкого качества так, что он читает от 0,0 до 0,0. Изменение Допустим линейность на следующее: от (bp) 100.0 до (bp) 800.0.
- Сохранить новый метод анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь можно повторно проанализировать файл, выбрав Низкие пики или высокие пики в рамках метода анализа, а затем нажав на зеленую кнопку анализа.
- Метод анализа 1 для высоких пиков:
Рисунок 5: Скриншот, показывающий стандартный редактор размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
2. Цитометрия потока
-
Выбор идеального блока FFPE
- Используя слайды H и E и легкий микроскоп, выберите блок FFPE, который имеет около 50–70% его тканей, состоящих из резюме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 6 является репрезентативным примером соответствующего блока для анализа цитометрии потока, так как он состоит примерно из 50% CV (правая половина раздела) и 50% материнских тканей (левая половина). Наличие материнских тканей имеет важное значение, поскольку они служат в качестве внутреннего контроля для диплоидного пика. - Для блоков, которые не имеют идеального количества резюме, обогащают для резюме, как секция выполняется. Для этого определите, какая сторона свежесрезаемых секций содержит больше резюме в соответствии с соответствующим слайдом H и E. Исходя из этого, используйте лезвие, чтобы отрезать другую половину, которая должна быть отброшена для того, чтобы обогатить для резюме.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 7 показан блок, который не имеет достаточного CV для анализа цитометрии потока. Для блоков, таких как этот, разделы должны быть сокращены таким образом, что половина, которая содержит меньше резюме получает отбрасываются для того, чтобы увеличить количество резюме в отношении материнских тканей, как показано на рисунке. Не забудьте сократить больше разделов, чтобы компенсировать то, что отбрасывается.
- Используя слайды H и E и легкий микроскоп, выберите блок FFPE, который имеет около 50–70% его тканей, состоящих из резюме.
Рисунок 6: Н И Е раздел, представляющий блок POC, который идеально подходит для цитометрии потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Н И Е раздел, представляющий более сложный блок для цитометрии потока. Этот репрезентативный раздел Н И Е показывает, что только нижняя половина этого раздела должна использоваться для анализа цитометрии потока, с целью обогащения для резюме. Изложенная область, помеченная как "CV", в основном состоит из резюме.
- Сечения
- Оставьте блоки на льду в течение 15 минут, чтобы облегчить секцию.
- Используя наилучший блок FFPE, вырежьте четыре секции толщиной 50 мкм (или два участка толщиной 100 мкм) с помощью микротома.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для цитометрии потока предпочтительнее иметь более толстые секции. - В случае, если идеальный блок FFPE не доступен, цель сохранить соотношение CV к материнской ткани, тем не менее. Например, если только 30% блока состоит из резюме, в то время как остальные материнские ткани, а затем удалить по крайней мере половину раздела, который содержит материнские ткани и использовать больше разделов для компенсации (см. Рисунок 7).
- Поместите секции в маркированные трубы 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте ленту над этикетками, потому что органические реагенты, используемые в следующем шаге, могут растворяться и удалять чернила.
- Протокол цитометрии потока из тканей FFPE
- Депараффинизация и регидратация
- Выполните следующие стирания (Таблица 3) под дымом капот.
- Заполните трубку 15 мл с 6 мл соответствующего реагента, следуя приказу, представленному в таблице 3, оставьте секции в реагентах на соответствующую продолжительность, а затем удалите реагент с помощью вакуумного всасывания и стеклянной пипетки Pasteur.
- Между каждым шагом, окунуть Пастер пипетка сначала в 70% этанола, затем в дистиллированной воде, а затем перейти к следующему шагу.
- Будьте очень осторожны, чтобы не удалить куски ткани вместе с реагентом. Наклоните трубку 15 мл под углом 60 градусов, чтобы облегчить всасывание жидкого реагента без нанесения тканей.
ПРЕДЕКТО: Выброшенные жидкости содержат ксилен и должны быть утилизированы в контейнерах для отходов ксилена.
- Подготовка решения
- Приготовьте раствор цитрата, растворив 2 г лимонной кислоты в 1 л двойной дистиллированной воды. Доведите рН до 6. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
- Приготовьте пепсиновый раствор путем растворения 0,01 г пепсина в 2 мл из 9 частей на тысячу NaCl, рН 1,64. Это для одного образца.
ПРЕДЕКТО: Пепсин токсичен и может легко рассеяться и стать воздушно-капельным путем. Носите маску при обработке пепсина в виде порошка и протрите вниз всю рабочую зону после его использования. - Propidium Iodide (PI)-рибонуклеаза Подготовка раствора для одного образца.
- Смешайте 50 л ИП с 450 Л ПБС (для разбавления 10x).
- Добавьте в смесь 50 л рибонуклеаза А (1 мг/мл). Держите завернутые в фольгу во все времена.
- Пищеварение и окрашивание
- Добавьте раствор цитрата 4 градуса к трубкам 15 мл, затем поместите в водяную ванну мощностью 80 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
- Дайте раствору остыть до комнатной температуры (15 мин). Удалите раствор цитрата.
- Добавьте 6 мл 1x PBS, вихрь, и подождите 1'2 мин, чтобы ткани, чтобы осесть на дно. Удалите 1x PBS с помощью вакуумного всасывания и стеклянной пипетки Pasteur.
- Добавьте 1 мл пепсина раствора (разогретого до 37 градусов по Цельсию) и поместите в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Vortex каждые 10 минут. Подготовьте PI-рибонуклизуа улейся раствор в последние 10 минут этой инкубации.
- Добавьте 6 мл 1x PBS, вихрь, и подождите 1'2 мин, чтобы ткани, чтобы осесть на дно. Удалите 1x PBS с помощью вакуумного всасывания и стеклянной пипетки Pasteur.
- Добавьте 550 qL PI-рибонуклеаза Раствор и поместите образцы в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент образцы можно завернуть в фольгу и оставить на ночь при 4 градусах Цельсия до следующего утра. - Фильтр раствора через 48-мм фильтрационную сетку. Соберите фильтрат в полистирол круглого дна трубки, которые могут быть использованы с потоком цитометра. Используйте щипцы, чтобы поместить 5 см на 5 см кусок фильтрации сетки в верхней части трубки, так что жидкость может быть трубчата через сетку и в трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы теперь готовы к запуску с цитометром потока. Держите их завернутые в фольгу, пока они не готовы к запуску.
- Запуск образцов с цитометром потока с помощью организации потока цитометрии платформы техник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Канал PE используется для обнаружения PI-окрашенных ДНК и скорость потока должна быть установлена, чтобы замедлить во время приобретения. Убедитесь, что напряжение выбрано таким образом, что пик диплоида находится примерно на уровне 200 вдоль оси PE-A x для облегчения анализа и интерпретации. Цель зафиксировать как минимум 20 000 событий на выборку.
- Депараффинизация и регидратация
| Используется реагент (по 6 мл) | Длительность |
| 1) Ксилен | 2 x 10 мин |
| 2) 100% этанол | 2 x 10 мин |
| 3) 95% Этанол | 10 мин. |
| 4) 70% этанол | 10 мин. |
| 5) 50% этанол | 10 мин. |
| 6) Дистиллированная вода | 2 x 10 мин |
Таблица 3: Реагенты и длительность депарафинизации и регидратации.
-
Анализ цитометрии потока
- Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа цитометрии потока(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги для одного конкретного программного обеспечения(Таблица материалов),но может быть поможет для создания других типов программного обеспечения, а также.- После запуска образцов на цитометр потока, скачать FCS 2.0 файлы для анализа.
- Откройте программное обеспечение для анализа цитометрии потока, нажмите на файл Новый документ.
- Нажмите на значок
Histogram (), а затем перетащите указатель, чтобы сделать прямоугольник. - Просмотрите файл FCS, а затем нажмите на Open. Вдоль x-оси нажмите на FCS-A, а затем выберите PE-A.
- Нажмите на значок Dot Plot (),
а затем перетащите указатель, чтобы создать еще один прямоугольник под сюжетом гистограммы. Затем просмотрите тот же файл FCS, который был выбран для гистограммы. - Измените x-оси точечного участка на PE-A и y-оси на PE-W.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 8А демонстрирует внешний вид участков на данный момент. - Нажмите на значок региона
() и нарисуйте поле на точечном участке, который начинается до пика диплоида (около 100 на оси Х на рисунке 8B)и который заканчивается около 700 на оси x, как показано на точечном участке на рисунке 8 B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пик диплоида на рисунке 8 составляет примерно 200 на оси х. Это выбрано произвольно, как образцы регистрируются через цитометр потока, просто для облегчения анализа и интерпретации результатов. - Нажмите на участок (ru) Отображать регионы/ворота,затем введите R0 в ячейке, которая находится рядом с ячейкой G0 в соответствии со стратегией. Затем нажмите на Закрыть.
- Нажмите в любом месте на гистограмму, а затем на участок (ru) Формат Участок / Оверлай. Под воротами,выберите G0 и R0, а затем нажмите на OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это шаг gating который позволяет одно более лучше визуализировать пики ploidy. Гистограмма должна теперь выглядеть как гистограмма на рисунке 8B. Можно поиграть с воротами, созданными (перемещая поле, нарисованное в шаге 2.4.1.7), чтобы сосредоточиться на определенных областях точечного сюжета. - Чтобы обозначить сюжеты, нажмите
на значок text Area (), затем перетащите указатель, чтобы создать окно в верхней части документа, а затем введите следующую информацию: Идентификатор пациента, POC ID и используемый блок (поскольку может быть несколько блоков для одного POC) , процент cv присутствует на блоке, напряжение используется для запуска образца, и дата.
- Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа цитометрии потока(Таблица материалов).
Histogram (), а затем перетащите указатель, чтобы сделать прямоугольник.
а затем перетащите указатель, чтобы создать еще один прямоугольник под сюжетом гистограммы. Затем просмотрите тот же файл FCS, который был выбран для гистограммы.
() и нарисуйте поле на точечном участке, который начинается до пика диплоида (около 100 на оси Х на рисунке 8B)и который заканчивается около 700 на оси x, как показано на точечном участке на рисунке 8 B.
на значок text Area (), затем перетащите указатель, чтобы создать окно в верхней части документа, а затем введите следующую информацию: Идентификатор пациента, POC ID и используемый блок (поскольку может быть несколько блоков для одного POC) , процент cv присутствует на блоке, напряжение используется для запуска образца, и дата.
Рисунок 8: Скриншот, отображающий гистограмму и точечный участок репрезентативного образца, который неопрозрачен (A) и закрыто (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сложность моляровских тканей и тот факт, что они могут иметь различные генотипы, требуют строгого анализа и использования нескольких методов, таких как морфологическая оценка, иммуногистохимия p57, генотипирование микроспутников, цитометрия потока и FISH. Например, один пациент (1790) был передан с двумя PHM, которые были признаны триплоидными только в ходе анализа microarray poCs. Таким образом, пациенту был поставлен диагноз рецидивирующего PHM. Микроспутниковая генотипирование ее двух "PHM" вместе с ДНК пациента и ее партнера показали, что в то время как первая родинка пациента является триплоид диспермический(Рисунок 9A), ее второй "PHM" имеет триплоидный дигиниальный генотип (Рисунок 9 B) и поэтому не PHM, но не молярный выкидыш.
Первый маркер на рисунке 9А (черным цветом) показывает два пика в POC. Первый пик приходит от матери, так как только мать имеет пик такого размера. Следуя тем же рассуждениям, вторая вершина исходит от отца, так как он разделяет тот же аллель. Обратите внимание, как второй пик намного выше, чем первый, указывая, что Есть, вероятно, две дозы одного и того же отцовского аллеля в этом пике. Материнское загрязнение, которое будет объяснено более подробно позже, является очень минимальным в этом POC, потому что POC отображает очень крошечный пик в положении второго материнского аллеля.
Второй маркер на рисунке 9А (синим цветом) показывает три вершины в POC. Два из этих пиков происходят от отца и один от матери. Таким образом, из этого маркера снова видно, что в ПОК присутствуют три аллеля: два от отца и один от матери. Третий и четвертый маркеры на рисунке 9А похожи на первый маркер, а также показывают два аллеля, исходящие от отца и один от матери.
Так как все четыре маркера последовательно показывают три аллеля (по дозе или при наличии трех аллелей разных размеров), два, происходящих от отца и один от матери, можно сделать вывод, что этот POC является триплоиддистом диспермик, и подтверждает диагноз PHM.
Все четыре маркера на рисунке 9B снова показывают три аллеля: первый маркер показывает две дозы в первом пике, которые происходят от матери и одна доза во второй пик, который исходит от отца. Второй и четвертый маркеры показывают три различных пика (т.е. три разных аллеля), два из которых от матери. Третий маркер показывает одну дозу в первом пике, происходящих от отца и две дозы во второй пик, происходящих от матери. Таким образом, этот POC является triploid digynic происхождения, поскольку два набора хромосом приходят от матери и один набор исходит от отца. Таким образом, это не моляровный выкидыш.
Рисунок 9: Представитель генотипирования результаты пациента 1790. (A) Выберите результаты генотипирования первой зачатия пациента, показывающие триплоидный диспермический генотип. (B) Выберите результаты генотипирования от второго зачатия пациента, показывающего триплоидный дигинский генотип. X-ось находится в базовых парах; этикетки и размеры базовых пар были опущены для простоты. Оси y представляет пиковую высоту и также опущена из рисунка для простоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Этот пациент был первоначально неправильно диагностируется с двумя PHM и беспокоясь о повышенном риске более родинок, пока она была одной PHM. Этот случай подчеркивает ограничение микроаррей SNP только на POC. SNP microarray является мощным методом и является лучшим для обнаружения анеуплоидии любой хромосомы (трисомии, моносомии, или недиплоидных генотипов); однако, при выполнении на POC в одиночку без анализа родительской ДНК, происхождение триплоиды не может быть определена. Для получения дополнительных объяснений по поводу анализа генотипов и интерпретации, пожалуйста, обратитесь к исследованию Мерфи и др.16.
Представительные результаты, показанные на рисунке 10А, имеют триплоидную концепцию. Значения x-оси представляют содержание ядерной ДНК. Например, 200 - это произвольное число клеток, которые содержат определенное количество содержания ядерной ДНК. Таким образом, пик в 400 представляет собой клетки, которые содержат в два раза больше содержания ядерной ДНК по сравнению с 200 пик. Небольшой пик около 300 представляет содержание ядерной ДНК, которая находится между 200 и 400 пик и, следовательно, триплоидный пик. Обратите внимание, как диплоидная концепция(рисунок 10B) не содержит пика при значении 300.
В некоторых случаях пик триплоида очень тонкий(рисунок 10C). Всякий раз, когда едва заметный пик триплоид, отмечается, важно сначала рассмотреть количество резюме, которые присутствовали в разделах, используемых для анализа цитометрии потока. Если разделы были менее 20% резюме, то это, вероятно, будет истинный триплоид, поскольку он, как ожидается, будет очень низкий пик. Если разделы принятые имели большое количество CV, то POC будет подозрительным mosaicism с присутсвием другого diploid клетчатого населения. Это может быть проверено путем повторного рассмотрения результатов генотипирования, чтобы увидеть, если они соответствуют идеальной диспермии триплоид или также может быть подтверждена FISH с зондами из X, Y и 18 хромосом. Кроме того, используя программное обеспечение, описанное в этой статье, можно установить конкретные ворота, как описано в разделе 2.4.1, которые позволяют пользователю сосредоточиться на определенном регионе, чтобы обогатить триплоидные ячейки, если они действительно существуют.
Рисунок 10: Результаты цитометрии потока представителя, демонстрирующие триплоидные зачатия в (A) и (C), и диплоидное зачатие в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HM являются ненормальные человеческие беременности с разнородными этиологии и имеют различные гистологические и генотипические типы, что делает их точной классификации и диагностики сложной задачей. Гистопатологическая морфологическая оценка часто оказывалась неточной и поэтому сама по себе ненадежна, чтобы классифицировать HM в CHM и PHM и отличить их от выкидышей, не являющимся молярами. Таким образом, точный диагноз HM требует использования других методов, таких как мультиплекс микроспутниковой ДНК генотипирования, ploidy анализа потока цитометрии, ploidy анализа FISH, и p57KIP2 иммуногистохимии. Каждый из этих методов имеет свои ограничения и преимущества.
Ограничения и преимущества мультиплексной генотипирования и цитометрии потока
Материнское загрязнение является одной из наиболее распространенных проблем при работе с тканями FFPE и может привести к неправильному диагнозу, тем самым подчеркивая важность отделения матери от тканей POC. Важно определить материнское загрязнение, чтобы иметь представление о том, чего ожидать от генотипирования пиков и помочь с их интерпретацией. Если уровень загрязнения слишком велик и препятствует надежной интерпретации результатов, то повторите изоляцию и экстракции ДНК, проявив дополнительную осторожность в удалении всех возможных материнских тканей. В регионах, где морфология тканей не ясна, лучше удалить такие регионы, чтобы минимизировать вероятность материнского заражения. Первое преимущество метода, описанного в этом протоколе, в дополнение к его более низкой стоимости, заключается в том, что материнские ткани удаляются из слайдов, в то время как другие методы состоят из сбора тканей POC (путем покрытия их раствором, который полимеризируется при воздействии воздуха и подъем тканей) без удаления материнских тканей. Таким образом, описанный здесь метод позволяет вновь взглянуть на оставшиеся ткани POC, при необходимости переочить их, как это часто бывает, а затем собрать и извлечь из них ДНК. Вторым преимуществом является то, что мы очищаем ткани на неприкрытых окрашенных секциях Н И Е, что значительно облегчает удаление материнских тканей, в отличие от использования неокрашенных секций и слайда с картами. Тем не менее, дополнительное окрашивание может еще больше ухудшить ДНК, и это компенсируется путем добавления большего количества разделов.
Еще одной проблемой является наличие родительской ДНК для анализа. Присутствие обоих родителей значительно облегчает анализ и интерпретацию результатов генотипирования. К сожалению, однако, это довольно часто бывает, что ДНК отца не доступна, что иногда может осложнить анализ, особенно в тех случаях, когда качество ДНК POC является плохим из-за предварительной фиксации или длительного хранения (более часто при работе с периодическим HM). Кроме того, материнская кровь не всегда может быть доступна для извлечения ДНК. В таких случаях материнская ДНК может быть извлечена из тканей эндометрия матери, присутствующих в блоках FFPE, как ранее описано16. Кроме того, характеристика моляровских тканей, полученных в результате использования вспомогательных репродуктивных технологий, может осложнить анализ генотипа микроспутников, поскольку в большинстве случаев ДНК доноров (мужчин или женщин) обычно отсутствует.
Наконец, тот факт, что большие пики, как правило, короче с точки зрения пиковой высоты является еще одним возможным источником путаницы, особенно когда пиковые высоты должны быть использованы, чтобы определить, есть ли две дозы или одна доза в одном пике. Один из способов преодолеть это всегда иметь в виду, что пики большого размера аллеля (количество базовых пар), как правило, короче, из-за деградированной природы ДНК из тканей FFPE, что делает менее ДНК доступны для усиления больших аллелей. Кроме того, более короткое усиление фрагмента ПЦР занимает меньше времени, чем большее, а экспоненциальное усиление ДНК приводит к меньшему количеству больших аллелей.
Основным недостатком цитометрии потока является то, что триплоидные зачатия иногда могут быть пропущены, и это может быть связано с недостаточным количеством резюме в блоке. Тем не менее, наличие триплоидного пика является убедительным признаком триплоидности. Обратите внимание, что этот метод не является достаточно чувствительным для обнаружения трисомии, тетраплоидные зачатия, или другие анеуплоидии с помощью этого протокола. Тетраплоидные концепции не обнаруживаются этим протоколом, поскольку пик тетраплоида соответствует тому же пику диплоидных клеток в фазе G2 клеточного цикла.
Знание этих ограничений и проблем помогает уменьшить ошибки. Поэтому важно, а иногда и необходимо анализировать одну и ту же ткань с помощью различных методов, сравнивать результаты и убедиться, что они согласуются друг с другом. Если это не так, результаты должны быть пересмотрены и анализы должны быть повторены. В нескольких случаях, которые показали противоречивые результаты, расхождения были решены просто путем повторения экспериментов и принятия надлежащих меры, чтобы избежать первоначальной проблемы. В других случаях расхождения были устранены путем выполнения дополнительных методов, таких как FISH на секциях тканей или путем выполнения дополнительных симплекс генотипирования с соответствующими маркерами.
Выявление материнского загрязнения
Что касается выявления загрязнения ДНК POC материнской ДНК, то уровень загрязнения будет отражаться или признаваться наличием всех материнских аллелей на всех локусах в POC, в дополнение к материнскому аллелу (ы), который передается в POC.
На рисунке 11Апики, происходящие из материнского загрязнения ДНК, помечены "c". Обратите внимание, как каждый пик, отмеченный "c", также присутствует в матери, и мы видим эти пики "c" во всех трех маркерах. Обратите внимание, что для второго маркера (синим цветом) пик материнского загрязнения, указанный "c", выше, чем каждый пик "c" на первом маркере, потому что мать гомозиготна для второго маркера; высота загрязняющей настолько удваивается для этого маркера. В этом POC, Есть нет материнско производных пиков. Другими словами, этот POC не унаследовал никаких аллелей от матери. Существует только один реальный пик на каждом маркере, и этот пик не присутствует в матери. Поэтому мы знаем, что реальные пики, должно быть, пришли от отца. С ploidy информации либо кариотипа или потока цитометрии анализа демонстрации диплоидии, можно заключить, что это POC как андрогенетические происхождения и диплоид.
Кроме того, эти три маркера на рисунке 11А показывают, что всегда есть только один реальный пик для каждого маркера. Только три маркера иллюстрируются здесь, однако, мультиплекс комплекты часто поставляются с гораздо больше маркеров, которые также будут выявить тот же шаблон. Так как этот POC является диплоид, должно быть две дозы в каждом пике. С помощью этой информации, мы можем заключить, что это POC является андрогенетический моноспермический и гомозиготных на каждом маркере.
Рисунок 11B представляет собой диплоидный двухродителей POC. Маленький черный бар через первый пик первого маркера (зеленым цветом) представляет собой предполагаемое количество загрязнения, которое присутствует в пределах этого реального пика. "R" указывает на реальную часть этого пика, исходящего от ДНК POC; "c" представляет загрязняемую часть этого пика, исходящего от материнской ДНК. Как определить уровень загрязнения? Это возможно, в этом случае, когда маркер гетерозигот в матери, потому что один из материнских аллелей отсутствует в POC. Небольшой пик первого маркера, помеченного "c", например, указывает на то, что это уровень загрязнения, который следует ожидать для другого пика, унаследованного по материнской линии. Следовательно, все пики POC, которые имеют материнское происхождение, немного выше, чем отцовски унаследованные пики из-за небольшого добавленного количества загрязнения. Для третьего маркера (черным цветом) на рисунке 11B,уровень загрязнения, как ожидается, будет в два раза больше обычного (потому что мать гомозиготной для этого конкретного маркера), и поэтому можно сделать вывод, что есть только одна доза в первом пике в POC.
Рисунок 11C иллюстрирует триплоиддистом диспермический POC. Первый маркер (зеленым цветом) показывает три вершины в POC. Поскольку эти три пика имеют одинаковые высоты, можно сделать вывод, что этот POC, вероятно, триплоид. Обратите внимание, что третий пик в этом маркере короче, чем первый. Это ожидается, потому что, как общая тенденция, большие пики, как правило, короче. Второй пик немного выше первого, и это может быть связано с небольшим количеством материнского загрязнения, как указано в баре и "c". Кроме того, два из этих трех пиков не присутствуют в матери, и поэтому должны исходить от отца. До сих пор этот маркер указывает на то, что POC может быть триплоидной (или трисомой) и что происхождение дополнительного набора хромосом отцовского. Это также указывает на то, что это распущенная концепция, так как POC унаследовал два разных аллеля от отца.
Второй маркер (синий) на рисунке 11C имеет только два пика. После учета уровня загрязнения второй пик оказывается выше первого, и это несмотря на общую тенденцию к тому, чтобы более крупные пики были меньше (тенденция, которая всегда должна быть в виду при анализе). Таким образом, вполне вероятно, что Есть две дозы в том, что один большой пик. Это также подтверждается тем фактом, что первый маркер свидетельствует о триплоидии.
Наконец, третий маркер (в черном) на рисунке 11C показывает три пика, опять же показатель триплоидии. Поскольку большинство маркеров в наборы мультиплекс аттекатии приходят из различных хромосом, можно с уверенностью заключить, что POC является триплоидпосле после наблюдения той же тенденции из трех аллелей через несколько различных маркеров. Также обратите внимание на этот маркер, что два из трех пиков происходят от отца, подтверждая рассеивающее ся.
Рисунок 11: Результаты генотипирования, иллюстрирующие эффект материнского загрязнения. Верхние панели показывают аллели, которые принадлежат к POC и нижние панели показывают те, которые принадлежат матери. В (A), POC является андрогенетический моноспермический и уровень загрязнения выделяется стрелой и буквой "c". В (B), POC является диплоидный biparental, и уровень загрязнения подчеркивается буквой "c". В (C), POC является triploid диспермики и уровень загрязнения подчеркивается буквой "c". Маленькие черные полосы показывают, сколько пиковых высот происходит от материнского загрязнения и поэтому должны быть приняты во внимание при сравнении пиковых высот. X-ось находится в базовых парах; этикетки и размеры базовых пар были опущены для простоты. Оси y представляет пиковую высоту и также опущена из рисунка для простоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Примеры сложных дел
В ряде случаев можно было прийти к выводу только путем одновременного проведения всех трех оценок (т.е. потока, p57KIP2и мультиплексного генотипирования). Например, один случай (808) был назван выкидышем, не относящемуся к молярной причине. Гистопатологическая оценка приводит к подозрению в зачатии моляра и генотипическом анализе POC показал один маркер, который четко показал три пика (два от отца и один от матери). Результаты p57KIP2 не были окончательными. Анализ цитометрии потока показал небольшой пик триплоид, который был подтвержден анализом FISH, который также исключил наличие другой диплоидной клеточной популяции. С подтверждением от FISH, можно было сделать вывод, что POC действительно триплоид диспермический моль.
Другой случай (1192) также был назван выкидышем без моляров. CV этого POC были переплетали с материнскими тканями и были очень некротические, а также, что делает процесс очистки очень сложным. Следовательно, первый генотипный анализ показал высокий уровень материнского загрязнения, так что каждый материнский аллель можно было увидеть в POC (хороший признак возможного загрязнения). Кроме того, p57KIP2, к сожалению, не был окончательным, скорее всего, из-за некротической природы ткани, возможно, из-за задержки фиксации. Результаты цитометрии потока, однако, были показаны триплоидии, которая также была подтверждена FISH. ДНК была повторно извлечена с целью снижения уровня загрязнения и удаления тканей с неясной морфологией. Анализ новых результатов генотипирования, учитывая вероятное наличие материнского загрязнения, позволил нам сделать вывод о том, что POC был триплоидным диспермическим XXY PHM.
В таблице 4 излагаются типичные методы, используемые для анализа. Рекомендуется использовать морфологическую оценку и p57 иммуногистохимиюKIP2 на всех тканях, подозрительных КЧии и, по крайней мере, в одном методе генотипирования. Среди методов генотипирования наиболее информативным является генотипирование ДНК мультиплекса. Когда результаты между различными методами не согласуются или когда некоторые результаты являются неубедительными, другие методы генотипирования должны быть использованы. Таблица демонстрирует ожидаемые результаты для каждого возможного типа HM наряду с редкими исключениями и рекомендациями по их решению.
Таблица 4: Типичный порядок анализа, ожидаемые результаты и редкие исключения наряду с рекомендациями по их устранению. P57KIP2 иммуногистохимия направлена на обнаружение экспрессии p57KIP2, белка, кодированного геном CDKN1C. Этот ген отцовски запечатлен в цитотрофобласте и злобной стромы первой триместстерной плаценты и выражается только из материнского генома. Поэтому он используется в качестве вспомогательного маркера для легкого и недорогого обнаружения присутствия материнского генома в POC. Рекомендуется выполнять p57KIP2 иммуногистохимии для всех POCs подозреваемых быть HM параллельно с морфологической оценки. В авторской лаборатории используются антитела p57KIP2 и платформы, указанные в таблице материалов, и авторы очень довольны качеством результатов. Аббревиативы: МГК и иммуногистохимия; Dip And - диплоидно-андрогенетический; Dip Bip - диплоидный биродитель; Хромосома Chr и; MC и выкидыш; и ТЦ и трохобластное распространение.
Насколько известно авторам, эта статья является первой, чтобы обеспечить подробные протоколы для потока цитометрии, а также недорогие и высококачественные мультиплексмикроподобные микроспутниковой ДНК генотипирования тканей FFPE POC. Интерпретация результатов также описана, наряду с их устранением и интеграцией с другими методами для достижения точных выводов и диагнозов POCs и HM. Авторы искренне надеются, что эта статья может быть полезна для исследователей, пытающихся понять эту сложную сущность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Софи Патриер и Марианну Пареси за совместное использование оригинального протокола цитометрии потока, а также Promega и Qiagen за поставки материалов и реагентов. Эта работа была поддержана Репродукцией Репродукции Репродукции Ребикуи и Канадским институтом исследований в области здравоохранения (MOP-130364) в Р.С.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
