Summary
الثقافات ثلاثية الأبعاد من عينات BMPC المريض وxenografts من سرطان البروستاتا النقيلي العظام الحفاظ على التغايرية الوظيفية للأورام الأصلية مما أدى إلى الخراجات، وspheroids ومعقدة، مثل الورم organoids. توفر هذه المخطوطة استراتيجية وبروتوكولًا أمثل للثقافة ثلاثية الأبعاد للعينات المشتقة من المرضى غير المتجانسة وتحليلها باستخدام مؤسسة التمويل الدولية.
Abstract
ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة organoids من عينات الورم من المرضى الإنسان ونماذج xenograft (PDX) المستمدة من المريض من سرطان البروستاتا ، ويشار إلى organoids المستمدة من المريض (PDO) ، هي مورد لا يقدر بثمن لدراسة آلية ورم ورم وورم سرطان البروستاتا. ميزتها الرئيسية هي أنها تحافظ على التغايرية الجينومية والوظيفية المميزة للأنسجة الأصلية مقارنة بخطوط الخلايا التقليدية التي لا تفعل ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لـ PDO للتنبؤ بآثار العلاج الدوائي على المرضى الأفراد وهي خطوة نحو الطب الشخصي. على الرغم من هذه المزايا، عدد قليل من المجموعات بشكل روتيني استخدام هذا الأسلوب في جزء منه بسبب التحسين واسعة النطاق من الظروف ثقافة PDO التي قد تكون مطلوبة لعينات المرضى المختلفة. لقد أثبتنا سابقًا أن نموذج PDX لسرطان البروستاتا هو نموذج PDX ، PCSD1 ، لخص مقاومة الانبثاث العظمي للمريض المتبرع للعلاج المضاد للاندروجين. استخدمنا PCSD1 3D organoids لتوصيف المزيد من آليات مقاومة مضادة للاندروجين. بعد نظرة عامة على الدراسات المنشورة حاليًا لنماذج PDX و PDO ، نصف بروتوكولًا تدريجيًا لثقافة ثلاثية الأبعاد لـ PDO باستخدام أغشية الطابق السفلي المقببة أو العائمة (على سبيل المثال ، Matrigel) في ظروف الثقافة المحسنة. في التصوير غرزة الجسم الحي ومعالجة الخلايا لعلم الأنسجة كما وصفت. ويمكن تحسين هذا البروتوكول كذلك لتطبيقات أخرى بما في ذلك لطخة الغربية، والثقافة المشتركة، وما إلى ذلك، ويمكن استخدامها لاستكشاف خصائص PDO مثقف 3D المتعلقة مقاومة الدواء، والورم، والانبثاث والعلاجات.
Introduction
وقد لفتت organoids ثلاثية الأبعاد المستزرعة الانتباه لقدرتها على تلخيص العمارة في الجسم الحي ، والوظائف الخلوية والتوقيع الجيني للأنسجة الأصلية1،2،3،4،5. الأهم من ذلك ، organoids 3D المنشأة من أنسجة الورم المريض أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج توفر فرصا لا تقدر بثمن لفهم آليات الإشارات الخلوية على تكوين الورم وتحديد آثار العلاج الدوائي على كل خلية من السكان6،7،8،9،10،11،12،13. وضعت Drost وآخرون5 بروتوكولًا قياسيًا لإنشاء أجهزة البروستاتا البشرية والفأرة ، والتي تم اعتمادها على نطاق واسع في مجال المسالك البولية. وبالإضافة إلى ذلك، تم تكريس جهد كبير لمزيد من توصيف الأجهزة 3D وفهم آليات مفصلة من الورم والانبثاث4،12،14،15. بالإضافة إلى البروتوكول الذي تم إنشاؤه مسبقًا والمقبول على نطاق واسع لثقافات الأجهزة ثلاثية الأبعاد ، فإننا نصف هنا بروتوكولًا خطوة بخطوة لثقافة 3D من PDO باستخدام ثلاث طرق مختلفة للقباب في ظروف الثقافة المثلى.
في هذه المخطوطة، تم تأسيس الأرغن ثلاثية الأبعاد كنموذج جديد لسرطان البروستاتا النقيلي العظمي (BMPC). جاءت الخلايا المستخدمة لهذه الثقافات من سلسلة سرطان البروستاتا سان دييغو (PCSD) واستمدت مباشرة من سرطان البروستاتا المريض أنسجة الورم النقيلي العظام (PCSD18 و PCSD22) أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج الورم (عينات تسمى PCSD1، PCSD13، و PCSD17). لأن الانبثاث العظام التلقائي ة من خلايا سرطان البروستاتا أمر نادر الحدوث في نماذج الماوس المعدلة وراثيا16، استخدمنا مباشرة داخل الفخذ (IF) حقن خلايا الورم البشري في Rag2 الذكور-/-οc-/- الفئران لإنشاء نماذج PDX من سرطان البروستاتا النقيلي العظام17.
مرة واحدة يتم إنشاء organoids 3D من الخلايا السرطانية المريض غير متجانسة أو xenografts المريض المستمدة، فمن الضروري لتأكيد هويتهم كخلايا ورم البروستاتا وتحديد الأنماط الظاهرية في الثقافات الاعضاء 3D. تسمح كيمياء الفلورة المناعية (IFC) بتصور التعبير البروتيني في الموقع في كل خلية ، مما يشير في كثير من الأحيان إلى الوظائف المحتملة لتجمعات خلايا محددة2،4. بشكل عام، بروتوكولات مؤسسة التمويل الدولية للغالبية العظمى من العينات بما في ذلك الأنسجة والخلايا واضحة والأمثل تماما. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة الخلايا وعدد الاعضاء أقل بكثير من الثقافة التقليدية. ولذلك، فإن بروتوكول مؤسسة التمويل الدولية للأعضاء يتطلب خطوات إضافية لضمان المعالجة السليمة والتضمين في البارافين لجميع الأرغن في العينات. نحن نصف خطوات إضافية لعملية تضمين أغاروز المسبقة ونصائح لتسمية موقع الأجزاء الاعضاء على الشريحة التي تزيد من معدل نجاح مؤسسة التمويل الدولية على organoids خاصة عندما تكون عينات من organoids كثافة خلايا أقل من المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا ً للتوصيات الواردة في دليل مجلس المراجعة المؤسسية التابع لجامعة كاليفورنيا في سان دييغو. تم الحصول على موافقة #090401 IRB من مجلس المراجعة المؤسسية UCSD (IRB) لجمع العينات الجراحية من المرضى لأغراض البحث. تم الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض وتم الحصول على عينة جراحية من سرطان البروستاتا العظمية من إصلاح العظام لكسر باثوية في عظم الفخذ. تم تنفيذ بروتوكولات الحيوان في إطار جامعة كاليفورنيا سان دييغو (UCSD) رعاية الحيوان والرعاية المؤسسية للحيوانات ولجنة الاستخدام (IACUC) وافق على بروتوكول #S10298. تم حقن الخلايا من أنسجة الورم المريض المنفصلة ميكانيكياً وأنزيمياً داخل الفخذ إلى 6 إلى 8 أسابيع ذكر قديم Rag2-/-&c-/- الفئران كما سبق وصفها17. تم تحديد حجم الورم Xenograft باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي الحيوي وقياسات الفرجار. على نمو الورم يصل إلى 2.0 سم (الحجم الأقصى المسموح به المعتمد من IACUC) ، تم حصاد الورم لإنشاء organoids 3D.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير العمل لإنشاء Organoids ثلاثية الأبعاد ورقم بروتوكول لكل خطوة من الإجراءات التجريبية.
1. معالجة أنسجة الورم المشتقة من المريض xenograft (PDX)
ملاحظة: هذه خطوة أولية لإنشاء organoid لورم مشتق من نموذج الماوس xenograft. تم تكييف هذا البروتوكول من منشور سابق من قبل Drost وآخرون5 وقد قمنا بتعديل شروط الوسائط لتشمل مكملات المصل إلى الوسائط الاعضاء.
- معالجة عينة الورم كما هو موضح أدناه.
- عينات الورم المفروم إلى 1-3 ملم3 قطع الحجم وهضم العينات مع 10 مل من محلول الانفصام الخلية لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- لإنهاء الهضم، إضافة 20 مل من الوسائط كاملة DMEM إلى العينات.
- تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون. استخدام شفة المكبس المعقمة لدفع أي بقايا الأنسجة على الجزء العلوي من 70 ميكرومتر مصفاة الخلية.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- غسل بيليه الخلية ثلاث مرات مع وسائل الإعلام الجديدة adDMEM كاملة. تطابق حجم الوسائط للغسل وإعادة التعليق مع حجم الوسائط المقترحة في الجدول 3. على سبيل المثال ، لحالة ثقافة لوحة جيدة 24 ، يجب أن يكون حجم الغسيل 500 ميكرولتر.
ملاحظة: كما هو موضح في الجدول 3،البروتوكول ينطبق على ظروف ثقافة مختلفة. - تحديد عدد الخلايا النهائية باستخدام صبغة زرقاء تريبان ومقياس الهيموكيتوم.
- بعد الحصول على عدد الخلايا, إعادة تعليق بيليه الخلية في 80 ميكرولتر من 2% FBS في PBS لكل 2 × 106 الخلايا السرطانية.
- إضافة 20 ميكرولتر من كوكتيل استنفاد خلايا الماوس لكل 2 × 106 خلايا الورم. مزيج جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية.
- ضبط حجم إلى 500 ميكرولتر مع FBS 2٪ في المخزن المؤقت PBS لكل 2 × 106 خلايا الورم.
ملاحظة: يمكن معالجة ما يصل إلى 1 × 107 خلايا الورم في 2.5 مل من تعليق الخلايا على عمود LS واحد. - قم بتحميل أعمدة LS على فاصل العمود المغناطيسي ووضع أنبوب مخروطي 15 مل على حامل تحته لجمع التدفق من خلال.
- شطف كل عمود مع 3 مل من 2٪ FBS في المخزن المؤقت PBS. تخلص من الأنبوب المخروطي مع تدفق الغسيل واستبداله بأنبوب مخروطي جديد معقم بقيمة 15 مل.
- أضف تعليق الخلية (حتى 2.5 مل من 1 × 107 خلايا سرطانية) على العمود. جمع تدفق من خلال التي سوف تكون غنية مع خلايا الورم البشري.
- غسل العمود مرتين مع 1 مل من 2٪ FBS في المخزن المؤقت PBS.
ملاحظة: من المهم تنفيذ خطوات الغسيل بمجرد أن يكون العمود فارغاً. أيضا، في محاولة لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- Aliquot الحجم المناسب لتعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل للثقافة المطلوبة إعداد(الجدول 3).
- الطرد المركزي أنبوب 1.5 مل في 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
- إزالة بعناية وتجاهل supernatant.
2. معالجة أنسجة الورم الأولية للمريض
ملاحظة: هذه خطوة أولية لإنشاء organoid.
- اتبع كل من الخطوة 1 باستثناء عملية استنفاد خلية الماوس، والتي ليست ضرورية لمعالجة أنسجة الورم الأولية للمريض.
3. تشكيل قبة مستديرة مرفقة على اللوحة
ملاحظة: تصف هذه المخطوطة ثلاث طرق لصنع قبة من خليط من بيليه الخلية وغشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، Matrigel) كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2. في الخطوات 2-4 ، يجب الاحتفاظ بالخلايا وغشاء الطابق السفلي على الجليد لمنع صلب غشاء الطابق السفلي.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في الحجم المناسب من غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، 40 ميكرولتر) لإعداد لوحة جيدة 24(الجدول 3).
- ماسيت صعودا وهبوطا بلطف لضمان أن يتم إعادة تعليق الخلايا جيدا في غشاء الطابق السفلي.
- ماصة الحجم المناسب(الجدول 3)من خليط غشاء الخلية الطابق السفلي (واختياري 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة adDMEM) في وسط لوحة زراعة الأنسجة قبل الدفء.
- عكس لوحة وعلى الفور وضع لوحة رأسا على عقب في CO2 خلية الحاضنة المنصوص عليها في 5٪ CO2،37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وهذا يمنع الخلايا من الاستقرار والتمسك أسفل لوحة مع السماح للغشاء الطابق السفلي لترسيخ.
- ماصة الحجم المناسب(الجدول 3)من المتوسطة ما قبل الحارة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ديهيدروكلوريد في كل بئر.
- ضع الجانب الأيمن من اللوحة داخل حاضنة زراعة الخلاياCO 2 (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
- تغيير وسائل الإعلام كل 3-4 أيام. بعد 5-7 أيام، واستخدام ثقافة المتوسطة دون 10 ميكرومتر Y-27632 ديهيدروكلوريد للحفاظ على الثقافات.
4. تشكيل قبة عائمة من قبة مستديرة متصلة على اللوحة
- بعد الخطوة 3.7، افصل القبة باستخدام مكشطة الخلايا.
5. تشكيل الخرز العائمة
ملاحظة: يسمى هذا البروتوكول كما الخرز العائمة منذ خليط من غشاء الطابق السفلي، وسائل الإعلام، وorganoids تبدو مثل الخرز.
- قطع 2 بوصة × 4 بوصة قطعة من فيلم البارافين.
- ضع فيلم البارافين على الجزء العلوي من divots من رف تفريغ تلميح فارغة من 1000 ميكرولتر البلاستيك ماصة مربع.
- اضغط بلطف لأسفل على فيلم البارافين لتتبع divots باستخدام السبابة قفاز ولكن دون اختراق فيلم البارافين.
- رش فيلم البارافين مع الإيثانول 70٪ وبدوره على مصباح الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية لتعقيم فيلم البارافين المعدة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إعداد خليط من الخلايا و 20 ميكرولتر من غشاء الطابق السفلي. يمكن أن تكون كثافة البذر 50،000 - 250،000 خلية لكل قبة.
- ماصة خليط من الخلايا معالجتها من الخطوة 1 أو 2، و 20 ميكرولتر من غشاء الطابق السفلي في قالب من divot شكلت في فيلم البارافين المعدة.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في غشاء الطابق السفلي وpipette تعليق الخلية في البارافين أعدت تصويرها divots.
- ضع الخرز المتين وفيلم البارافين في لوحة 6-well. يمكن لبئر واحد في لوحة 6-well احتواء ما يصل إلى 5 حبات.
- ماسيت 3-5 مل من المتوسط ما قبل الحارة التي تحتوي على 10 μM Y-27632 ديهيدروكلوريد في كل بئر في حين فرشاة بلطف الخرز قبالة فيلم البارافين.
ملاحظة: كوحدة تخزين دنيا، يوصى بـ 3 مل. للحصول على الحد الأقصى لعدد من الخرز (N = 5) لكل بئر ، يوصى بـ 5 مل من المتوسط. - ضع اللوحة داخل حاضنة CO2 (5٪ CO2، 37 درجة مئوية).
- تغيير وسائل الإعلام الاعضاء كل 3-4 أيام. بعد 5-7 أيام، واستخدام ثقافة المتوسطة دون 10 ميكرومتر Y-27632 ديهيدروكلوريد للحفاظ على الثقافات.
6. في vivo organoids صورة خياطة باستخدام المجهر8
ملاحظة: بعض المجاهر غير قادرة على الوصول إلى المحيط الخارجي للوحة الخلية (جدار الحافة)؛ لذلك ، نقترح استخدام الآبار القريبة من محيط لوحة الخلية عند خياطة الصورة.
- ضع لوحة ثقافة الخلية في وضع تصاعدي في حامل اللوحة في مجهر Keyence.
- ضع العدسة على وسط القبة المستهدفة.
- إعداد عملية خياطة التلقائي عن طريق تحديد عدد من الإطارات. على سبيل المثال، يمكن اختيار 3 × 3 أو 5 × 5 لتوليد 9 صور أو 25 صورة.
- اضغط على زر الالتقاط لبدء عملية التصوير.
- افتح برنامج عارض الصور وحمّل مجموعة من الصور التي تم التقاطها بواسطة الخطوة 4.
- انقر فوق خياطة الصورة لإنشاء صورة مخيط عالية الدقة.
ملاحظة: يمكن إجراء التقاط الصور التسلسلية 9 أو 25 إما عن طريق الإعداد اليدوي أو التلقائي لتركيز الخلايا.
7. معالجة organoid لعلم الأنسجة: طريقة أغاروز تدور أسفل
ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من منشور سابق من قبل Vlachogiannis وآخرون7. لقد أضفنا خطوة تنطوي على تضمين agarose لترسيخ بنجاح جميع مجموعات من organoids.
- إزالة الوسائط الموجودة من البئر. يجب الحرص على عدم استنشاق القباب غشاء الطابق السفلي.
- إضافة يساوي (يساوي حجم الوسائط إزالتها من الخطوة 1) حجم حل استعادة الخلية واحتضان لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- إزاحة قبة غشاء الطابق السفلي باستخدام ماصة وسحق قبة غشاء الطابق السفلي باستخدام طرف pipet. جمع القبة المنفصلة وحل استعادة الخلية في أنبوب 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 5 سنوات.
- إزالة supernatant (حل استعادة الخلية). حفظ جميع supernatants في أنابيب منفصلة حتى النهاية عندما يتم تأكيد وجود organoids في خطوة الكريات النهائية.
- إضافة الحجم المطلوب(الجدول 3)من برنامج تلفزيوني بارد وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لإزعاج ميكانيكيا بيليه.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 5 سنوات.
- إزالة supernatant (PBS).
- إصلاح بيليه في حجم مطابقة (على سبيل المثال، 500 ميكرولتر لبيليه واحد من 24 حالة ثقافة لوحة جيدة، الجدول 3)من 4٪ PFA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد التثبيت، الطرد المركزي في 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
- إزالة supernatant (PFA).
- غسل مع حجم مطابقة (على سبيل المثال، 500 ميكرولتر لبيليه واحد من حالة ثقافة لوحة بئر 24، الجدول 3)من PBS والطرد المركزي في 300 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
- إعداد أغاروز دافئة (2٪ أغاروز في برنامج تلفزيوني).
ملاحظة: هنا، يمكن إعادة تعليق كريات الخلية للأقسام المجمدة مباشرة في 200 ميكرولتر من مركب OCT دون خطوات أخرى في البروتوكول 7. - إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من أغاروز (2٪ في برنامج تلفزيوني).
- مباشرة بعد إضافة agarose، بلطف فصل بيليه الخلية من جدار أنبوب 1.5 مل باستخدام إبرة 25 G تعلق على 1 مل حقنة. كما هو مبين في الشكل 3، إذا لم يتم فصل بيليه الخلية فعليًا عن جدار أنبوب 1.5 مل ، فهناك خطر فقدان كل أو جزء من بيليه الخلية أثناء عملية تضمين agarose.
- الانتظار حتى يتم ترسيخ 2٪ أغاروز في برنامج تلفزيوني تماما.
- فصل كتلة الآغا روز الصلبة من أنبوب 1.5 مل باستخدام إبرة 25 G تعلق على حقنة 1 مل.
- نقل كتلة agarose منفصلة تحتوي على بيليه الخلية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
- ملء أنبوب مع 70٪ EtOH والمضي قدما باستخدام البروتوكول التقليدي لجفاف الأنسجة وتضمين البارافين.
8- الكيمياء النسيجية والخلايا الفلورية المناعية (IFC) من الأورجادات الاعضاء
- حدد الشريحة (الشرائح) لعلم الأنسجة أو مؤسسة التمويل الدولية.
- قبل الشروع في عملية تلطيخ، معرفة أين تقع الخلايا على الشريحة ورسم دائرة حول الخلايا على الشريحة باستخدام علامة.
- رسم محيط حول حافة أو الحدود من الشريحة وحيث تقع الدوائر على الشريحة في دفتر ملاحظات المختبر لتسجيل مواقعها.
- أداء تلطيخ المطلوب.
ملاحظة: أثناء هذه العملية، تختفي الدوائر المميزة لأن صانع العادية ليست مقاومة للمواد الكيميائية. حتى بعض علامات الأنسجة الدائمة قد تمحى أثناء عملية تلطيخ. - بعد عملية تلطيخ، ضع الشريحة فوق الرسم في دفتر ملاحظات المختبر للعثور على مواقع الخلايا على الشريحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء organoids 3D بنجاح من نموذج xenograft (PDX) من نموذج التهاب البروستاتا النقيلي (BMPC) المريض والعظام النقيلية سرطان السرطان(الشكل 4). باختصار، تم إنشاء نماذج PDX لدينا من BMPC عن طريق حقن داخل الفخذ (IF) من الخلايا السرطانية في ذكر Rag2-/- ج-/- الفئران ثم تم حصاد الأورام PDX ومعالجتها على النحو المبين في هذه المخطوطة. كما هو مبين في الشكل 4، أدت أنسجة الورم PDX من سلسلة PCSD إلى organoids ثلاثية الأبعاد مع أنماط ظاهرية تفاضلية تتجلى كأكياس وكرويدات وأجهزة تعقيد أعلى التي تشكلت باستخدام هذا البروتوكول.
وأظهرت صورة مخيط من 25 عالية الدقة 10x صور التكبير قبة كاملة من غشاء الطابق السفلي وorganoids(الشكل 5). باستخدام برامج تحليل الصور ، واحد لديه خيار لفرز الخلايا أو مجموعات الخلايا التي هي أكبر من حجم معين أو لتحديد يدويا كرويدات أو الخراجات.
خطوات تضمين أغاروز للثقافات الاعضاء ونصائح لتسمية موقع organoids مقطعة على الشريحة زيادة نجاح أداء مؤسسة التمويل الدولية على organoids خاصة عندما تكون عينات من organoids كثافة خلايا أقل من المطلوب. ويبين الشكل 6 مثالاً على مؤسسة التمويل الدولية على مقطع من البارافين سمكه 5 ميكرومتر من الأرغونات المنتهية التي تستهدف السيتوكراتين 5 (CK5، علامة الخلية الظهارية القاعدية)، السيتوكيراتين 8 (CK8، علامة الخلية الظهارية المضيئة) وDAPI.
الشكل 1: إنشاء وتوصيف للorganoids 3D المستزرعة المستمدة إما من أنسجة أورام المريض أو أنسجة الورم xenograft المريض (PDX). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منهجيات لتشكيل خليط من الكريات الخلية وغشاء الطابق السفلي. قبة مرفقة (أ) ، قبة عائمة(ب)وحبات عائمة(ج). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: خطوة رئيسية لنجاح تضمين الآغا روز. عملية لفصل بيليه الخلية من جدار أنبوب 1.5 مل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الأنماط الظاهرية التفاضلية للأعضاء العضوية من سلسلة من أورام PCSD PDX ، والتي تشمل الخلايا المفردة والخراجات والمواد الكروية والأجهزة العضوية ذات التعقيد العالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على صورة مخيط الخام من مجموع 25 صورة عالية الدقة وتطبيقها لتحليل المتابعة لحساب عدد الخلايا أو قياس مساحة الخلايا / مجموعات الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صورة تظهر CK5 و CK8 IFC الملطخPCSD1 organoids (5 ميكرومتر سمك قسم البارافين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون المخزون | التركيز النهائي | Vol (مل) اللازمة ل500 مل الحل |
| 1000 مم HEPES | 10 مليمتر | 5 |
| 200 مم غلوتامماكس | 2 م.م.م | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x | 5 |
| adMEM/F12 +/+/+ | 485 |
الجدول 1: إعداد adDMEM/F12 +/+/+. وقد سبق نشر هذا الجدول من قبل Drost وآخرون5.
| مكون المخزون | التركيز النهائي | Vol (μL) اللازمة لمحل 50 مل | Vol (μL) اللازمة لمحل 25 مل |
| 50x B27 | 50x مخففة | 1000 | 500 |
| 500 متر من الـ N-Acetylcysteine | 1.25 م.م | 125 | 62.5 |
| 0.5 ملغم/مل EGF | 5 نانوغرام/مل | 0.5 | 0.3 |
| 100 ميكروغرام/مل نوجين | 100 نانوغرام/مل | 50 | 25 |
| آر- سبوندين 1 | 10% متوسطة مكيفة | 5000 | 2500 |
| 5 مم A83-01 | 500 مليون متر | 5 | 2.5 |
| 0.1 ملغم/مل FGF10 | 10 نانوغرام/مل | 5 | 2.5 |
| 50 ميكروغرام/مل FGF2 | 5 نانوغرام/مل | 5 | 2.5 |
| 10 م م بروستاغلاندين E2 | 1 ميكرومتر | 5 | 2.5 |
| 1M نيكوتيناميد | 10 مليمتر | 500 | 250 |
| 30 مم SB202190 | 10 ميكرومتر | 16.7 | 8.4 |
| FBS | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 ميكرومتر دهت | 1 مليون متر | 50 | 25 |
| adMEM/F12 +/+/+ | جلب ما يصل إلى 50 مل | جلب ما يصل إلى 25 مل | |
| 100 مم - 27632 ديهيدروكلوريد | 10 ميكرومتر | 5 | 2.5 |
الجدول 2: مكونات C/S Human Media + 10% FBS. وقد سبق نشر هذا الجدول من قبل Drost وآخرون5.
| لوحة الثقافة | كثافة البذر (الخلايا) | حجم غشاء الطابق السفلي (μL) | متوسط (ميكرولتر) |
| 48 جيدا | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 جيدا | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 جيدا | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
الجدول 3: كثافة البذر، وحجم غشاء الطابق السفلي، وحجم متوسط اللازمة لقبة واحدة. يتم تعديل هذا الجدول من منشور سابق من قبل Drost وآخرون5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا تزال الأجهزة ثلاثية الأبعاد المشتقة من خلايا سرطان البروستاتا الانبثاث العظمي للمريض نادرة نسبيًا. هنا ، ونحن نصف الاستراتيجيات والبروتوكول الأمثل كذلك إلى إنشاء بنجاح المسلسل 3D المريض المشتقة organoids (PDOs) من BMPC. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف البروتوكولات لتأمين الأورجادات في عينات ذات كثافة خلايا أقل لتحليل مؤسسة التمويل الدولية والمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. تشير الأنماط الظاهرية التفاضلية في شكل كيس وكرويدات وأجهزة أكثر تعقيدًا إلى أن هذا البروتوكول يوفر ظروفًا ثقافية تسمح لتجمعات خلايا الورم الهيستروغونية في المرضى بالاحتفاظ بالنمط الظاهري الخلوي والهيكل. وهكذا، فإن الظروف الثقافية الموصوفة هنا، والتي تم تكييفها من Drost et al.5 المعدلة مع مكملات مصل FBS، قد ثبت أنها مثالية لثقافات الخلايا المشتقة من BMPC المريض بحيث تحتفظ بتغايريتها داخل الموضوع وفيما بين الموضوعات (المخطوطة في الإعداد).
بروتوكولنا الأمثل هو عملي لإعداد تجريبي مع نقاط نهاية متعددة من مواد البداية محدودة من أنسجة الورم الأولية أو PDX لإعداد الثقافات الاعضاء 3D. بشكل عام ، فإن إنشاء الأجهزة ثلاثية الأبعاد من أنسجة الورم الأولية للمريض أقل نجاحًا من إنشاء organoids ثلاثية الأبعاد من أنسجة الورم PDX. لذلك ، يوصى بكثافة بذر أعلى (تصل إلى أربعة أضعاف) من الخلايا لإنشاء organoids ثلاثية الأبعاد من أنسجة الورم الأولية للمريض من أورام PDX). طريقة واحدة لزيادة غلة الخلايا أثناء معالجة أنسجة الورم هو استرداد أي بقايا أنسجة الورم على رأس مصفاة الخلايا 70 ميكرومتر عن طريق تمرير تعليق الخلية المصفاة من خلال مصفاة مرة أخرى.
يمكن استخدام ثلاث طرق مختلفة لتشكيل ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد(الشكل 2)وتكييفها بسهولة اعتمادًا على تحليل نقطة النهاية للمتابعة. على سبيل المثال ، إذا كان أحد يرغب في الحصول على الصور مخيط بعد إنشاء organoids 3D ، يوصى بشدة قبة المرفقة لأن عملية خياطة الصورة تتطلب حركة متسلسلة من الهدف المجهري للحصول على العدد المطلوب من الصور (إما 9 أو 25). هذه العملية النتائج في اهتزاز خفية لحامل لوحة ثقافة الخلية. كلا النوعين من القبة العائمة سوف تتحرك بحرية بسبب الاهتزاز في حين الحصول على الصورة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن نقل كلا النوعين من القباب العائمة بسهولة من بئر إلى آخر ، مما يجعلها مناسبة للاستزراع المشترك مع الخلايا الملتصقة بعد إنشاء الثقافات الاعضاء ثلاثية الأبعاد والخلايا الملتصقة في الآبار المنفصلة. وقد ثبت أن القبة المرفقة والقبة العائمة الصادرة من التعلق تحتفظ بالمواد الاعضاء لمدة تصل إلى 10 أسابيع. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت قبة عائمة من طريقة الخرز العائمة للاحتفاظ organoids لمدة تصل إلى 4 أشهر. طريقة الخرز العائمة لإنتاج المجالات غشاء الطابق السفلي التي أدخلت في بروتوكول لدينا ينطوي على المزيد من الخطوات والمهارات ولكن يمكن النظر فيها لثقافة طويلة الأجل. في موازاة ذلك ، على الرغم من استخدامها لإنشاء organoids 3D من الأورام والانبثاث المختلفة ، لم يتم تحديد دور طريقة القبة وشكل غشاء الطابق السفلي على تشكيل organoids بعمق. وبهذا المعنى، يمكن النظر في طريقة فيلم البارافين للاستخدام عندما تكون الطريقتان الأخريان غير ناجحتين.
بالنسبة لجميع الطرق الثلاث المختلفة ، يوصي هذا البروتوكول باستخدام حجم أقل من الوسائط وحجم أعلى من غشاء الطابق السفلي لعملية إعادة التعليق لأن القباب ستستمر لفترة أطول في الثقافة. يتم تشكيل قبة مع نسبة 1:4 من وسائل الإعلام وغشاء الطابق السفلي. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة تزيد من تكوين الفقاعات أثناء وضع الأنابيب في تعليق الخلية صعودا وهبوطا لأن الحجم المضاف من الوسائط لا يتحايل على لزوجة غشاء الطابق السفلي. لذلك ، يوصى بإعداد أنابيب 1.5 مل بحيث يكون هناك بيليه خلية واحدة لكل قبة بدلاً من وجود خلية واحدة لعدة قباب في أنبوب واحد 1.5 مل. عند القيام بذلك ، فإن تشكيل فقاعات في أنبوب واحد لقبة واحدة لن يؤثر بشكل تسلسلي على القباب الأخرى. إذا تم تحسين مدة حالة الثقافة مسبقًا ومن المعروف أنها قصيرة (تصل إلى شهر) ، يمكن تخفيف غشاء الطابق السفلي أكثر للتحايل على مسألة اللزوجة في غشاء الطابق السفلي. ويمكن إعداد إعادة تعليق بيليه الخلية لعدة آبار في أنبوب واحد، وذلك باستخدام حجم أعلى من وسائل الإعلام إلى الحجم المطلوب من غشاء الطابق السفلي للحد من فقدان الخلايا والتباين.
للحد من تشكيل فقاعة خلال عملية pipetting، ماصة حجم أقل من الحجم الفعلي للخلايا، وسائل الإعلام وخليط غشاء الطابق السفلي. على سبيل المثال ، للقبة داخل لوحات 24 جيدا ، يتم خلط 40 ميكرولتر من غشاء الطابق السفلي وما يصل إلى 10 ميكرولتر من الوسائط الكاملة adDMEM مع بيليه الخلية. في هذه الحالة ، يمكن تعيين ماصة للتعامل مع حجم 40 ميكرولتر بدلا من 50 ميكرولتر في حين pipetting صعودا وهبوطا من أجل تقليل تشكيل فقاعة. لهذه الطريقة الثانية، يمكن إعداد إعادة تعليق بيليه الخلية لعدة آبار في أنبوب واحد لتقليل فقدان الخلايا وتقلباتها. غالباً ما تكون الحالة السائلة لغشاء الطابق السفلي المتاح تجاريًا متغيرًا. لذلك ، تحتاج دفعات جديدة من غشاء الطابق السفلي إلى اختبارها لعملية القبة. إذا كان غشاء الطابق السفلي أكثر لزوجة من المعتاد ، فيمكن إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر إضافية من الوسائط الكاملة (التفاصيل المكتوبة في الخطوة 1) لتخفيف خليط بيليه الخلية وغشاء الطابق السفلي.
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء وصورة وعملية العضوية 3D المستزرعة مع نصائح مفصلة لاستكمال ناجح للإجراءات المطلوبة. وسائل الإعلام الثقافية للorganoids ثلاثية الأبعاد التي تم إدخالها في مخطوطتنا مخصصة للخلايا المشتقة من البروستاتا. ومع ذلك، فإن التفاصيل الأخرى الموضحة في بروتوكولنا تنطبق على أنواع مختلفة من أنسجة الأورام والمواقع النقيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
سانغي لي وكريستينا أ. م. جيميسون هما المحرران الضيفان لمجموعة أساليب جوفي.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة مؤسسة ليو وآن ألبرت الخيرية ومؤسسة JM. نشكر جامعة كاليفورنيا سان دييغو مورز أعضاء مركز السرطان، والدكتور جينغ يانغ والدكتور كاي ت. يونغ للسماح لنا باستخدام الميكروتومي وراندال الفرنسية، قسم الجراحة للخبرة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
