Summary
Tre-dimensionelle kulturer af patientenBMPC prøver og xenografts af knogle metastatisk prostatakræft opretholde den funktionelle heterogenitet af deres oprindelige tumorer resulterer i cyster, sfænoider og komplekse, tumor-lignende organoider. Dette manuskript giver en optimeringsstrategi og protokol for 3D-kultur af heterogene patientafledte prøver og deres analyse ved hjælp af IFC.
Abstract
Tredimensional (3D) kultur af organoider fra tumorprøver af humane patienter og patient-afledt xenograft (PDX) modeller af prostatakræft, benævnt patient-afledte organoider (BOB), er en uvurderlig ressource for at studere tumorigenese og metastase af prostatakræft. Deres største fordel er, at de opretholder den karakteristiske genomiske og funktionelle heterogenitet af det oprindelige væv i forhold til konventionelle cellelinjer, der ikke gør. Desuden kan 3D-kulturer af BOB bruges til at forudsige virkningerne af narkotikabehandling på de enkelte patienter og er et skridt i retning af personlig medicin. På trods af disse fordele, få grupper rutinemæssigt bruge denne metode til dels på grund af den omfattende optimering af BOB kulturbetingelser, der kan være nødvendige for forskellige patientprøver. Vi har tidligere vist, at vores prostatakræft knogle metastase PDX model, PCSD1, opsummerede modstanden af donor patientens knogle metastase til anti-androgen terapi. Vi brugte PCSD1 3D organoids til yderligere at karakterisere mekanismerne i anti-androgen modstand. Efter en oversigt over aktuelt offentliggjorte undersøgelser af PDX- og BOB-modeller beskriver vi en trinvis protokol for 3D-kultur af BOB ved hjælp af kuppelformede eller flydende kældermembraner (f.eks. matrigel) i optimerede kulturforhold. In vivo sting billeddannelse og celle behandling for histologi er også beskrevet. Denne protokol kan yderligere optimeres til andre applikationer, herunder vestlige blot, co-kultur, etc. og kan bruges til at udforske karakteristika 3D kulturfremstillede BOB vedrørende resistens, tumorigenese, metastase og terapeutiske.
Introduction
Tre-dimensionelle kulturformede organoider har henledt opmærksomheden på deres potentiale til at opsummere in vivo arkitektur, cellulære funktionalitet og genetiske signatur af deres oprindelige væv1,2,3,4,5. Vigtigst er det, 3D organoider etableret fra patient tumor væv eller patient afledt xenograft (PDX) modeller giver uvurderlige muligheder for at forstå mekanismer af cellulære signalering ved tumorigenese og til at bestemme virkningerne af narkotikabehandling på hver celle population6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 udviklet en standard protokol for etablering af menneskelige og mus prostata organoider, som er blevet bredt vedtaget inden for urologi. Desuden har en betydelig indsats været dedikeret til yderligere karakterisering af 3D organoids og til at forstå de detaljerede mekanismer tumorigenese og metastase4,12,14,15. Ud over den tidligere etablerede og bredt accepterede protokol for 3D organoids kulturer, beskriver vi her en trin-for-trin protokol for 3D-kulturen i BOB ved hjælp af tre forskellige doming metoder i optimerede kulturforhold.
I dette manuskript blev 3D organoider etableret som en ex vivo model af knogle metastatisk prostatakræft (BMPC). De celler, der anvendes til disse kulturer kom fra Prostata Cancer San Diego (PCSD) serien og blev afledt direkte fra patienten prostatakræft knogle metastatisk tumorvæv (PCSD18 og PCSD22) eller patient afledt xenograft (PDX) tumor modeller (prøver ved navn PCSD1, PCSD13, og PCSD17). Da spontan knoglemetastase af prostatakræftceller er sjælden i gensplejsede musemodeller16,brugte vi direkte intrafemoral (IF) injektion af humane tumorceller i mandlige Rag2-/-γc-/- mus til at etablere PDX-modeller af knoglemetastatisk prostatakræft17.
Når 3D organoids er etableret fra heterogene patient tumorceller eller patient afledte xenografts, Det er vigtigt at bekræfte deres identitet som prostata tumorceller og til at bestemme deres fænotyper i 3D organoid kulturer. Immunfluorescenskemi (IFC) gør det muligt at visualisering af proteinekspression på stedet i hver celle, hvilket ofte angiver de potentielle funktioner for specifikke cellepopulationer2,4. Generelt er IFC protokoller for et stort flertal af prøver, herunder væv og celler ligetil og fuldt optimeret. Men celletætheden og antallet af organoider kan være betydeligt lavere end den konventionelle kultur. Ifc-protokollen for organoider kræver derfor yderligere skridt til at sikre korrekt behandling og integrering i paraffin for alle organoider i prøverne. Vi beskriver yderligere trin for en agarose pre-indlejring proces og tips til at mærke placeringen af afgrænsede organoider på diaset, der øger succesraten for IFC på organoider, især når prøverne af organoider har lavere celletæthed end ønsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledningen for University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Godkendelse blev modtaget fra UCSD Institutional Review Board (IRB) til at indsamle kirurgiske prøve fra patienter til forskningsformål. Der blev indhentet et informeret samtykke fra hver patient, og en kirurgisk knogleprostatakræft metastase prøve blev opnået fra ortopædisk reparation af en patologisk fraktur i lårbenet. Dyreprotokoller blev udført under University of California San Diego (UCSD) dyrevelfærd og institutionelle Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendt protokol #S10298. Celler fra mekanisk og enzymatisk dissociated patient tumorvæv blev intra-femoralt injiceres i 6 til 8 uger gamle mandlige Rag2-/-;γc-/- mus som tidligere beskrevet17. Xenograft tumor volumen blev bestemt ved hjælp af en in vivo bioluminescens imaging system og kaliper målinger. Ved tumorvækst op til 2,0 cm (den maksimale tilladte størrelse godkendt af IACUC), tumoren blev høstet for 3D organoids etablering.
BEMÆRK: Figur 1 viser arbejdsgangen for oprettelse af 3D-organoider og et protokolnummer for hvert trin i forsøgsprocedurerne.
1. Behandling af patient afledt xenograft (PDX) tumorvæv
BEMÆRK: Dette er et første skridt for organoid etablering for en tumor stammer fra en xenograft mus model. Denne protokol er tilpasset fra en tidligere publikation af Drost et al.5, og vi har ændret medieforholdene til også at omfatte serumtilskud til organoidmedier.
- Proces tumor prøven som beskrevet nedenfor.
- Hakkekød tumor prøver til 1-3 mm3 mellemstore stykker og fordøje prøverne med 10 ml celle dissociation opløsning i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Hvis du vil afslutte fordøjelsen, skal du føje 20 ml DMEM komplette medier til prøverne.
- Affjedringen filtreres gennem en 70 μm cellesi. Brug en steril stempelflange til at skubbe eventuelle rester væv på toppen af 70 μm celle si.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Vask cellepellet tre gange med friske adDMEM komplette medier. Match mediemængden til vask og resuspension med den mediemængde , der foreslås i tabel 3. For eksempel, for en 24 godt plade kultur tilstand, bør volumen for vask være 500 μL.
BEMÆRK: Som vist i tabel 3gælder protokollen for forskellige kulturforhold. - Bestem endelige celletal ved hjælp af Trypan blå farvestof og et hæmocytometer.
- Efter at have opnået celletal, re-suspendere celle pellet i 80 μL af 2% FBS i PBS pr 2 x 106 tumorceller.
- Tilføj 20 μL musecellenedbrydelsecocktail pr. 2 x 106 tumorceller. Bland godt og inkuberes i 15 min ved 2-8 °C.
- Juster volumen til 500 μL med 2% FBS i PBS buffer pr 2 x 106 tumorceller.
BEMÆRK: Op til 1 x 107 tumorceller i 2,5 ml cellesuspension kan behandles på en LS kolonne. - Læg LS-kolonnerne på den magnetiske kolonneseparator, og placer et 15 ml konisk rør på et rack nedenunder for at indsamle gennemstrømningen.
- Skyl hver kolonne med 3 ml 2% FBS i PBS-buffer. Kassér det koniske rør med vaskflowet og udskift med et nyt, sterilt 15 ml konisk rør.
- Tilsæt cellesuspensionen (op til 2,5 ml 1 x 107 tumorceller) på kolonnen. Indsamle flow-through, der vil være beriget med menneskelige tumorceller.
- Kolonnen vaskes to gange med 1 ml 2% FBS i PBS-buffer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre vasketrin, så snart kolonnen er tom. Prøv også at undgå at danne luftbobler.
- Aliquot den passende mængde celle suspension til en 1,5 ml rør for den ønskede kultur oprettet (Tabel 3).
- 1,5 ml-røret centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern og kassér forsigtigt supernatantet.
2. Behandling af patientens primære tumorvæv
BEMÆRK: Dette er et første skridt for organoid etablering.
- Følg alle trin 1 undtagen musecelleudtyndingproces, hvilket ikke er nødvendigt for behandling af patientens primære tumorvæv.
3. Danner en fastgjort rund kuppel på pladen
BEMÆRK: Dette manuskript beskriver tre måder at lave en kuppel fra en blanding af cellepellet og kældermembranen (f.eks. I trin 2-4 skal cellerne og kældermembranen holdes på is for at forhindre størkning af kældermembranen.
- Cellepelletten skal opslæs igen i det passende volumen af kældermembranen (f.eks. 40 μL) for en 24 brøndplade, der er oprettet (tabel 3).
- Pipettering op og ned forsigtigt for at sikre, at cellerne genophænges godt i kældermembranen.
- Pipette det passende volumen(tabel 3)af celle-kælder membran blandingen (og valgfri 10 μL af adDMEM komplet medier) i midten af den forvarmede væv kulturplade.
- Inverter pladen, og anbring straks pladen på hovedet i CO 2-cellekulturrugevøsen, der er sat til 5% CO2, 37 °C i 15 min. Dette forhindrer celler i at bosætte sig og holde sig til pladebunden, samtidig med at kældermembranen størknes.
- Pipette det passende volumen (tabel 3) af forvarmet medium, der indeholder 10 μM Y-27632 dihydrochlorid i hver brønd.
- Placer pladen højre side op inde i CO2 celle kultur inkubator (5% CO2,37 °C).
- Skift medie hver 3-4. Efter 5-7 dage skal du bruge dyrkningsmedium uden 10 μM Y-27632 dihydrochlorid for at opretholde kulturerne.
4. Danner en flydende kuppel fra en vedhæftet rund kuppel på pladen
- Efter trin 3,7, kan du tage kuplen af ved hjælp af en celleskraber.
5. Danner flydende perler
BEMÆRK: Denne protokol er navngivet som flydende perler, da blandingen af kældermembran, medier og organoider ligner perler.
- Skær en 2 tommer x 4 tommer stykke paraffin film.
- Placer paraffinfilmen på toppen af divots af en tom spidsholderrack fra en 1000 μL plastpipettespidsboks.
- Tryk forsigtigt ned på paraffinfilmen for at spore divots ved hjælp af en behandsket pegefinger, men uden at bryde igennem paraffinfilmen.
- Spray paraffinfilmen med 70% ethanol og tænd FOR UV-lampen i cellekulturhætten for at sterilisere den forberedte paraffinfilm i mindst 30 min.
- Forbered en blanding af celler og 20 μL af kælderen membran. Seedning tæthed kan være 50.000 - 250.000 celler per kuppel.
- Pipetterblandingen af celler, der er forarbejdet fra trin 1 eller 2, og 20 μL kældermembran i formen af divot dannet i den forberedte paraffinfilm.
- Resuspendercellepellet i kælderen membran og pipette cellen suspension i den forberedte paraffin filmet divots.
- Placer de størknede perler og paraffin film i en 6-brøndplade. En brønd i en 6-brønds plade kan passe op til 5 perler.
- Pipette 3-5 ml forvarmet medium, der indeholder 10 μM Y-27632 dihydrochlorid i hver brønd, mens de forsigtigt børster perler ud af paraffinfilmen.
BEMÆRK: Som minimum anbefales 3 ml. For et maksimalt antal perler (N = 5) per brønd, anbefales 5 ml medium. - Pladen anbringes i en CO 2-kuvøse (5% CO2,37 °C).
- Skift organoid medierne hver 3-4 dage. Efter 5-7 dage skal du bruge dyrkningsmedium uden 10 μM Y-27632 dihydrochlorid for at opretholde kulturerne.
6. In vivo organoids billede syninger ved hjælp af mikroskop8
BEMÆRK: Visse mikroskoper kan ikke nå cellepladens yderkant (kantvæg); Derfor foreslår vi at bruge brøndene tæt på cellepladens omkreds, når billedet syr.
- Cellekulturpladen anbringes opad i pladeholderen i nøglecenmikroskopet.
- Placer linsen på midten af målet kuplen.
- Konfigurer den automatiske syningsproces ved at vælge antallet af rammer. For eksempel kan 3 x 3 eller 5 x 5 vælges til at generere 9 billeder eller 25 billeder i alt.
- Tryk på hentningsknappen for at starte billedbehandlingsprocessen.
- Åbn billedfremvisersoftwaren, og indlæs en gruppe billeder, der er taget af trin 4.
- Klik på Billedsyning for at oprette et syet billede i høj opløsning.
BEMÆRK: Optagelse af serie9- eller 25 billeder kan udføres enten ved manuel eller automatisk opsætning for at fokusere cellerne.
7. Organoid behandling for histologi: agarose spin down metode
BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra en tidligere publikation af Vlachogiannis et al.7. Vi har tilføjet et skridt, der involverer agarose indlejring for at kunne integrere alle populationer af organoider.
- Fjern eksisterende medier fra brønden. Pas på ikke at aspirere kældermembranen kupler.
- Tilføj en lig (lig med den mediemængde, der fjernes fra trin 1) volumen af cellegenvindingsopløsning og inkubering i 60 min ved 4 °C.
- Løsne kælderen membran kuppel ved hjælp af en pipetterog knuse kælderen membran kuppel ved hjælp af en pipet spids. Saml den dissocierede kuppel og celle genvinding løsning i en 1,5 ml rør.
- Centrifuger ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatantet (cellegenvindingsopløsning). Gem alle supernatanter i separate rør indtil slutningen, når tilstedeværelsen af organoider bekræftes i det sidste pelleteringstrin.
- Tilsæt den ønskede volumen(tabel 3)af kold PBS og forsigtigt pipette op og ned til mekanisk forstyrre pellet.
- Centrifuger ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten (PBS).
- Fastgør pellet i et matchet volumen (f.eks 500 μL for en pellet fra 24 godt plade kultur tilstand, Tabel 3) af 4% PFA i 60 min ved stuetemperatur.
- Efter fiksering centrifugeres ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten (PFA).
- Vaskes med matchet volumen (f.eks. 500 μL for en pellet fra 24 brøndpladekulturtilstanden, tabel 3)af PBS og centrifugerer ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Forbered varm agarose (2% agarose i PBS).
BEMÆRK: Her kan cellepiller til frosne sektioner suspenderes direkte i 200 μL OLT-forbindelse uden yderligere trin i protokol 7. - Cellepelletten skal suspenderes igen i 200 μL agarose (2 % i PBS).
- Umiddelbart efter tilsætning af agarose, forsigtigt trække cellepellet fra væggen i 1,5 ml rør ved hjælp af 25 G nål fastgjort til 1 ml sprøjte. Som vist i figur 3, hvis cellepellet ikke er fysisk løsrevet fra væggen i 1,5 ml rør, så er der risiko for at miste hele eller en del af cellepellet under agarose indlejring proces.
- Vent, indtil agarose på 2 % i PBS er fuldstændig størknet.
- Fjern den størknede agaroseblok fra 1,5 ml røret ved hjælp af en 25 G-nål fastgjort til 1 ml-sprøjten.
- Overfør den fritliggende agaroseblok, der indeholder cellepellet, til et nyt 1,5 ml rør.
- Fyld røret med 70% EtOH og gå videre ved hjælp af den konventionelle protokol for væv dehydrering og paraffin indlejring.
8. Histologi og immunofluorescerende cytokemi (IFC) af organoider
- Vælg diaset(e) for histologi eller IFC.
- Før farvningsprocessen påbegyndes, skal du finde ud af, hvor cellerne er placeret på sliden, og tegne en cirkel rundt om cellerne på sliden ved hjælp af et mærke.
- Tegn omkredsen rundt om kanten eller boarderet af diaset, og hvor cirkler er placeret på diaset i en laboratorienotesbog for at registrere deres placeringer.
- Udfør ønskede farvning.
BEMÆRK: Under denne proces forsvinder markerede cirkler, da almindelig maker ikke er modstandsdygtig over for kemikalierne. Selv nogle histologi permanente markører kan slettes under farvning proces. - Efter farvningsprocessen skal du placere diaset over tegningen i laboratorienotesbogen for at finde cellernes placering på sliden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D organoids blev med succes etableret fra en patient afledt xenograft (PDX) model af knoglemetastatisk prostatakræft (BMPC) samt direkte fra patient knogle metastatisk prostatakræft væv (Figur 4). Kort, vores PDX modeller af BMPC blev etableret ved intra-femoral (IF) injektion af tumorceller i mandlige Rag2-/- c-/- mus og derefter PDX tumorer blev høstet og behandlet som beskrevet i dette manuskript. Som vist i figur 4resulterede PDX tumorvæv fra PCSD-serien i 3D-organoider med differentiale fænotyper, der manifesterede sig som cyster, sfænoider og mere komplekse organoider, der dannes ved hjælp af denne protokol.
Et syet billede fra 25 høj opløsning 10x forstørrelse billeder viste en hel kuppel af kælder membran og organoids (Figur 5). Ved hjælp af billedanalyse software, man har mulighed for at sortere de celler eller celle klynger, der er større end en bestemt størrelse eller til manuelt at vælge sfæroider eller cyster.
Trinene for agarose indlejring af organoid kulturer og tips til at mærke placeringen af afgrænsede organoider på diaset øge succesen med at udføre IFC på organoids især når prøverne af organoider har en lavere celle tæthed end ønsket. Figur 6 viser et eksempel på IFC på en 5 μm tyk paraffinsektion af organoider rettet mod cytokeratin 5 (CK5, basal epitelcellemarkør), cytokeratin 8 (CK8, luminal epitelcellemarkør) og DAPI.
Figur 1: Etablering og karakterisering for 3D-dyrkede organoider stammer enten fra patiententumorvæv eller patient afledt xenograft (PDX) tumorvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Metoder til at danne en blanding af cellepiller og kældermembran. En vedhæftet kuppel(a),en flydende kuppel (b) og flydende perler (c). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et vigtigt skridt for vellykket agarose indlejring. En proces til at frigøre cellepellet fra væggen i 1,5 ml rør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Differentialfæller af organoider fra en række PCSD PDX tumorer, som omfatter enkelte celler, cyster, sfænoider og højere kompleksitet organoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempel på et råt syet billede fra i alt 25 billeder i høj opløsning og dets anvendelse af en opfølgningsanalyse for at tælle antallet af celler eller måle området med celler/celleklynger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billede, der viser CK5 og CK8 IFC farvede PCSD1 organoider (5 μm tykkelse paraffin sektion). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Lagerkomponent | Endelig koncentration | Vol .l (ml) er nødvendig for 500 ml opløsning |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabel 1: adDMEM/F12 +/+/+ Forberedelse. Denne tabel er tidligere blevet offentliggjort af Drost et al.5.
| Lagerkomponent | Endelig koncentration | Vol .l (μL), der er nødvendig for 50 ml opløsning | Vol .l (μL), der er nødvendig til 25 ml opløsning |
| 50x B27 | 50x fortyndet | 1000 | 500 |
| 500 mM N-Acetylcystein | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/ml EGF | 5 ng/ml | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/ml | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | 10% konditioneret medium | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/ml FGF10 | 10 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 50 μg/ml FGF2 | 5 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M Nicotinamid | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Medbring op til 50 ml | Hent op til 25 km/t | |
| 100 mM Y-27632 Dihydrochlorid | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tabel 2: Komponenter til C/S Human Media + 10 % FBS. Denne tabel er tidligere blevet offentliggjort af Drost et al.5.
| Kulturplade | Såning Tæthed (celler) | Kældermembranvolumen (μL) | Medium (μL) |
| 48 godt | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 godt | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 godt | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabel 3: Seedning tæthed, kælder membran volumen, og medium volumen er nødvendig for en kuppel. Denne tabel ændres fra en tidligere publikation af Drost et al.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D organoider stammer fra patienten knogle metastase prostatakræft celler er stadig relativt sjældne. Her beskriver vi strategier og yderligere optimeret protokol til succes etableret seriel 3D patient afledt organoider (PDA'er) af BMPC. Desuden beskrives protokoller for at sikre organoiderne i prøver med lavere celletæthed for IFC- og IHC-analyse. Differentialfænotyper i form af cyste, sfænoider og mere komplekse organoider viser, at denne protokol giver kulturbetingelser, der giver mulighed for heterogonous tumorcellepopulationer hos patienter for at bevare deres cellulære fænotype og struktur. De kulturbetingelser, der er beskrevet her, og som blev tilpasset fra Drost et al.5 modificeret med FBS serumtilskud, har således vist sig at være optimale for kulturer af patientenS BMPC-afledte celler, således at de bevarer deres interne og inter-emne heterogenitet (manuskript til forberedelse).
Vores optimerede protokol er praktisk for en eksperimentel oprettet med flere endepunkter fra begrænset udgangsmateriale fra primære eller PDX tumorvæv til at oprette 3D organoids kulturer. Generelt etablering af 3D organoider fra patientenprimære tumorvæv er mindre vellykket end etablering af 3D organoider fra PDX tumorvæv. Derfor anbefales det at have en højere såning tæthed (op til fire gange højere) af celler til etablering af 3D organoider fra patientenprimære tumorvæv end fra PDX tumorer). En metode til at øge celleudbyttet under tumorvæv behandling er at inddrive enhver tumorvæv sidesten på toppen af 70 μm celle si ved at passere den filtrerede celle suspension gennem si igen.
Tre forskellige metoder til at danne en 3D organoid kultur (Figur 2) kan anvendes og let tilpasses afhængigt af opfølgning endepunktanalyse. For eksempel, hvis man ønskede at få de syede billeder efter etablering af 3D organoids, en vedhæftet kuppel er stærkt anbefales, da billedet syning proces kræver en seriel bevægelse af mikroskopiske mål at erhverve det ønskede antal billeder (enten 9 eller 25). Denne proces resulterer i en subtil vibration til indehaveren af cellekulturplade. Begge typer af den flydende kuppel vil frit bevæge sig på grund af vibrationer, mens erhverve billedet. Desuden kan begge typer af flydende kupler nemt overføres fra den ene brønd til den anden, hvilket gør dem velegnede til co-kultur med tilhængere celler efter opsætning af 3D organoid kulturer og de klæbende celler i de separate brønde. Den vedlagte kuppel og flydende kuppel frigivet fra at være fastgjort har vist sig at bevare organoider i op til 10 uger. Interessant, en flydende kuppel fra de flydende perler metode har vist sig at bevare organoider i op til 4 måneder. Den flydende perler metode til at producere kælder membran kugler indført i vores protokol indebærer flere trin og færdigheder, men kan overvejes for en langsigtet kultur. Parallelt hermed, på trods af deres anvendelse til etablering af 3D organoider fra forskellige tumorer og metastase, rolle doming metode og kælderen membran form på organoider dannelse er ikke blevet dybt bestemt. I den forstand kan paraffinfilmmetoden komme i betragtning til brug, når de to andre metoder ikke har været forgæves.
For alle tre forskellige metoder anbefaler denne protokol at bruge en lavere mediemængde og en større volumen af kældermembranen til resuspensionsprocessen, fordi kuplerne vil vare længere i kulturen. En kuppel er dannet med en 1:4 forholdet mellem medier og kælder membran. Bemærk, denne metode øger dannelsen af bobler, mens pipettering cellen suspension op og ned, da den ekstra mængde medier ikke omgå viskositeten af kælderen membran. Derfor anbefales det at oprette 1,5 ml rør sådan, at der er en celle pellet pr hver kuppel i stedet for at have en celle pellet for flere kupler i en 1,5 ml rør. Ved at gøre dette, dannelsen af bobler i et rør for en kuppel vil ikke serielt påvirke andre kupler. Hvis varigheden af kulturtilstanden tidligere er blevet optimeret og er kendt for at være kort (op til en måned), kan kældermembranen fortyndes mere for at omgå viskositetsspørgsmålet om kældermembranen. En celle pellet resuspension for flere brønde kan fremstilles i ét rør, udnytte en højere volumen af medier til den ønskede mængde af kælderen membran for at minimere celletab og variabilitet.
For at minimere bobledannelse under pipettingprocessen, pipette en lavere volumen end den faktiske volumen af celler, medier og kælder membran blanding. For eksempel, for en kuppel inden for 24 brøndplader, 40 μL af kælderen membran og op til 10 μL adDMEM komplet medier blandes med cellepellet. I dette tilfælde kan pipetten indstilles til at håndtere et volumen på 40 μL i stedet for 50 μL, mens den pipetterer op og ned for at minimere bobledannelse. Til denne anden metode kan cellen pellet resuspension for flere brønde fremstilles i ét rør for at minimere celletab og variabilitet. Den flydende status af kommercielt tilgængelige kældermembraner er ofte variabel. Derfor skal nye partier af kældermembranen testes for domingprocessen. Hvis kældermembranen er mere tyktflydende end normalt, kan der tilsættes op til yderligere 10 μL adDMEM komplette medier (detaljer skrevet i trin 1) for at fortynde blandingen af cellepellet og kældermembran.
Her præsenterer vi en protokol til at etablere, billede og proces kulturfremstillede 3D organoid med detaljerede tips til en vellykket gennemførelse af de ønskede procedurer. Kulturmedier til 3D-organoider, der introduceres i vores manuskript, er specielt til prostatabaserede celler. Men, andre detaljer, der er beskrevet i vores protokol gælder for forskellige typer af tumorvæv og metastatiske steder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sanghee Lee og Christina A.M. Jamieson er gæsteredaktører af JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Leo og Anne Albert Charitable Foundation og JM Foundation. Vi takker University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmer, Dr. Jing Yang og Dr. Kay T. Yeung for at give os mulighed for brug af deres microtome og Randall fransk, Department of Surgery for teknisk ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
