Summary
Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.
Abstract
La culture tridimensionnelle (3D) des organoïdes des spécimens de tumeur des patients humains et des modèles de xénogreffe (PDX) de patient-dérivé (PDX), désignés sous le nom d'organoïdes patient-dérivés (PDO), sont une ressource inestimable pour étudier le mécanisme de tumorigenesis et métastasie du cancer de la prostate. Leur principal avantage est qu'ils maintiennent l'hétérogénéité génomique et fonctionnelle distinctive du tissu original par rapport aux lignées cellulaires conventionnelles qui ne le font pas. En outre, les cultures 3D de l'ADP peuvent être utilisées pour prédire les effets du traitement médicamenteux sur les patients individuels et sont une étape vers la médecine personnalisée. Malgré ces avantages, peu de groupes utilisent régulièrement cette méthode en partie en raison de l'optimisation étendue des conditions de culture des APR qui peuvent être nécessaires pour différents échantillons de patients. Nous avons précédemment démontré que notre modèle de métastasie d'os de prostate PDX, PCSD1, a récapitulé la résistance de la métaste d'os du patient de distributeur au traitement d'anti-androgène. Nous avons employé des organoïdes 3D de PCSD1 pour caractériser plus loin les mécanismes de la résistance d'anti-androgène. À la suite d'un aperçu des études actuellement publiées sur les modèles PDX et ADP, nous décrivons un protocole étape par étape pour la culture 3D de l'ADO à l'aide de membranes en dôme ou flottantes (p. ex. Matrigel) dans des conditions de culture optimisées. L'imagerie in vivo de point et le traitement cellulaire pour l'histologie sont également décrits. Ce protocole peut être optimisé pour d'autres applications, y compris la tache occidentale, la co-culture, etc. et peut être utilisé pour explorer les caractéristiques de l'AOP cultivé en 3D concernant la résistance aux médicaments, la tumorigénèse, la métastes et la thérapeutique.
Introduction
Les organoïdes cultivés tridimensionnels ont attiré l'attention sur leur potentiel de récapituler l'architecture in vivo, la fonctionnalité cellulaire et la signature génétique de leurs tissus d'origine1,2,3,4,5. Plus important encore, les organoïdes 3D établis à partir de tissus tumoraux patients ou de xénogreffes dérivées du patient (PDX) modèles fournissent des occasions inestimables de comprendre les mécanismes de signalisation cellulaire sur la tumorigénèse et de déterminer les effets du traitement médicamenteux sur chaque population cellulaire6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et coll.5 ont élaboré un protocole standard pour l'établissement d'organoïdes de la prostate humains et souris, qui a été largement adopté dans le domaine de l'urologie. En outre, un effort significatif a été consacré pour la caractérisation des organoïdes 3D et de comprendre les mécanismes détaillés de la tumorigénèse et la métastes4,12,14,15. En plus du protocole précédemment établi et largement accepté pour les cultures d'organoïdes 3D, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la culture 3D de PDO utilisant trois méthodes différentes de doming dans des conditions de culture optimisées.
Dans ce manuscrit, des organoïdes 3D ont été établis comme modèle ex vivo du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC). Les cellules utilisées pour ces cultures provenaient de la prostate Cancer San Diego (PCSD) série et ont été dérivés directement de patients cancer de la prostate os métastatique tissus tumoraux (PCSD18 et PCSD22) ou le patient dérivé xénogreffe (PDX) modèles tumoraux (échantillons nommés PCSD1, PCSD13, et PCSD17). Parce que la métastase spontanée d'os des cellules cancéreuses de la prostate est rare dans les modèles génétiquement modifiés de souris16,nous avons employé l'injection intra-fémorale directe (IF) des cellules humaines de tumeur dans le Rag2 mâle -/--c------souris pour établir les modèles de PDX du cancer de la prostate métastatiqued'os 17.
Une fois que les organoïdes 3D sont établis à partir des cellules hétérogènes de tumeur patiente ou des xénogreffes dérivées de patient, il est essentiel de confirmer leur identité en tant que cellules de tumeur de prostate et de déterminer leurs phénotypes dans les cultures organoïdes 3D. La chimie de l'immunofluorescence (IFC) permet la visualisation de l'expression des protéines in situ dans chaque cellule, indiquant souvent les fonctions potentielles pour des populations cellulaires spécifiques2,4. En général, les protocoles IFC pour une grande majorité d'échantillons, y compris les tissus et les cellules, sont simples et entièrement optimisés. Cependant, la densité cellulaire et le nombre d'organoïdes peuvent être significativement inférieurs à ceux de la culture conventionnelle. Par conséquent, le protocole de l'IFC pour les organoïdes nécessite des mesures supplémentaires pour assurer un traitement approprié et l'intégration de la paraffine pour tous les organoïdes dans les échantillons. Nous décrivons des étapes supplémentaires pour un processus de pré-embedding d'agarose et des bouts pour étiqueter l'emplacement des organoïdes sectionnés sur la glissière qui augmente le taux de succès de l'IFC sur des organoïdes particulièrement quand les échantillons des organoïdes ont la densité cellulaire inférieure que désiré.
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Protocol
Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide for the University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). L'Accord de #090401 de la CISR a été reçu de la Commission d'examen institutionnel de l'UCSD (CISR) pour recueillir des échantillons chirurgicaux de patients à des fins de recherche. Un consentement informé a été obtenu de chaque patient et un spécimen chirurgical de métastasie de cancer de la prostate d'os a été obtenu de la réparation orthopédique d'une rupture pathologique dans le fémur. Les protocoles sur les animaux ont été exécutés dans le cadre du protocole approuvé par l'Université de Californie à San Diego (UCSD) et le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) #S10298. Des cellules du tissu de tumeur patiente mécaniquement et enzymatiquement dissocié ont été intra-fémoralement injectées dans le Rag2mâle de 6 à 8 semaines-/-;c-/- souris comme précédemment décrit17. Le volume de tumeur de Xénograft a été déterminé utilisant un système in vivo de formation image de bioluminescence et des mesures d'étrier. Sur la croissance de tumeur jusqu'à 2.0 cm (la taille autorisée maximale approuvée par IACUC), la tumeur a été moissonnée pour l'établissement 3D d'organoïdes.
REMARQUE : La figure 1 montre le flux de travail pour l'établissement des organoïdes 3D et un numéro de protocole pour chaque étape des procédures expérimentales.
1. Traitement des tissus tumoraux dérivés de xénogreffe (PDX) de patient
REMARQUE : Il s'agit d'une première étape pour l'établissement d'organoïdes pour une tumeur dérivée d'un modèle de souris xénogreffe. Ce protocole est adapté d'une publication précédente par Drost et coll.5 et nous avons modifié les conditions médiatiques pour inclure la supplémentation en sérum aux médias organoïdes.
- Traiter le spécimen de tumeur tel que décrit ci-dessous.
- Mince échantillons de tumeur à 1-3 mm3 morceaux de taille et digérer les échantillons avec 10 ml de solution de dissociation cellulaire pendant 45 min à température ambiante.
- Pour mettre fin à la digestion, ajouter 20 ml de dMEM de support complet aux échantillons.
- Filtrer la suspension à l'autre d'une passoire cellulaire de 70 m. Utilisez une bride stérile pour pousser les restes de tissu sur le dessus de la passoire cellulaire de 70 m.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Laver la pastille cellulaire trois fois avec un média complet adDMEM frais. Associez le volume des médias pour le lavage et la suspension avec le volume de médias suggéré dans le tableau 3. Par exemple, pour une condition de culture de 24 plaques de puits, le volume pour le lavage doit être de 500 L.
REMARQUE : Comme indiqué dans le tableau 3, le protocole s'applique à différentes conditions de culture. - Déterminer le nombre final de cellules à l'aide de colorant bleu Trypan et d'un hémocytomètre.
- Après avoir obtenu des comptes cellulaires, re-suspendre le granule de cellules dans 80 'L de 2% FBS dans PBS par 2 x 106 cellules tumorales.
- Ajouter 20 l de cocktail d'épuisement des cellules de souris par 2 x 106 cellules tumorales. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 2-8 oC.
- Ajustez le volume à 500 L avec 2% de FBS en tampon PBS pour 2 x 106 cellules tumorales.
REMARQUE : Jusqu'à 1 x 107 cellules tumorales dans 2,5 ml de suspension cellulaire peuvent être traitées sur une colonne de LS. - Chargez les colonnes LS sur le séparateur de colonne magnétique et placez un tube conique de 15 ml sur un support en dessous pour recueillir le flux à travers.
- Rincer chaque colonne avec 3 ml de 2% FBS dans le tampon PBS. Jetez le tube conique avec le flux de lavage à travers et remplacez-le par un nouveau tube conique stérile de 15 ml.
- Ajouter la suspension cellulaire (jusqu'à 2,5 ml de 1 x 107 cellules tumorales) sur la colonne. Recueillir flow-through qui sera enrichi avec des cellules tumorales humaines.
- Laver la colonne deux fois avec 1 ml de 2% FBS dans le tampon PBS.
REMARQUE : Il est important d'effectuer des étapes de lavage dès que la colonne est vide. Aussi, essayez d'éviter de former des bulles d'air.
- Aliquot le volume approprié de suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml pour la culture désirée mis en place (tableau 3).
- Centrifuger le tube de 1,5 ml à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
- Retirez soigneusement et jetez le supernatant.
2. Traitement des tissus tutules primaires du patient
REMARQUE : Il s'agit d'une première étape pour l'établissement des organoïdes.
- Suivez tous les étapes 1 excepté le processus d'épuisement de cellules de souris, qui n'est pas nécessaire pour le traitement des tissus primaires patients de tumeur.
3. Formation d'un dôme rond attaché sur la plaque
REMARQUE : Ce manuscrit décrit trois façons de fabriquer un dôme à partir d'un mélange de granule de cellules et de membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel) comme le montre la figure 1 et la figure 2. Dans les étapes 2-4, les cellules et la membrane du sous-sol doivent être maintenues sur la glace pour empêcher la solidification de la membrane du sous-sol.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans le volume approprié de la membrane du sous-sol (p. ex., 40 l) pour une plaque de 24 puits mise en place (tableau 3).
- Pipette de haut en bas doucement pour s'assurer que les cellules sont bien suspendues dans la membrane du sous-sol.
- Pipette le volume approprié (tableau 3) du mélange de membrane de cellules-sous-sol (et en option 10 l de milieu complet adDMEM) dans le centre de la plaque de culture de tissu pré-chauffée.
- Inverser la plaque et placer immédiatement la plaque à l'envers dans l'incubateur de culture cellulaire CO2 fixé à 5 % CO2, 37 oC pendant 15 min. Cela empêche les cellules de se tasser et d'adhérer au fond de la plaque tout en permettant à la membrane du sous-sol de se solidifier.
- Pipette le volume approprié (tableau 3) de milieu pré-chauffé contenant 10 'M Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits.
- Placez la plaque à droite vers le haut à l'intérieur de l'incubateur de culture cellulaire CO2 (5 % CO2, 37 oC).
- Changez les médias tous les 3-4 jours. Après 5-7 jours, utilisez le milieu de culture sans 10 M Y-27632 dihydrochlorure pour maintenir les cultures.
4. Formation d'un dôme flottant à partir d'un dôme rond attaché sur la plaque
- Après l'étape 3.7, détachez le dôme à l'aide d'un grattoir cellulaire.
5. Former des perles flottantes
REMARQUE : Ce protocole est nommé comme perles flottantes puisque le mélange de membrane de sous-sol, de médias, et d'organoïdes ressemblent à des perles.
- Couper un morceau de 2 pouces x 4 pouces de film de paraffine.
- Placez le film de paraffine sur le dessus des divots d'une grille vide de tip-holding à partir d'une boîte de tuyauterie en plastique de 1000 l.
- Appuyez doucement sur le film de paraffine pour tracer les divots à l'aide d'un index ganté, mais sans percer le film de paraffine.
- Vaporiser le film de paraffine avec 70% d'éthanol et allumer la lampe UV dans le capot de culture cellulaire pour stériliser le film de paraffine préparé pendant au moins 30 min.
- Préparer un mélange de cellules et 20 l de membrane de sous-sol. La densité d'ensemencement peut être de 50 000 à 250 000 cellules par dôme.
- Pipette le mélange de cellules traitées à partir de l'étape 1 ou 2, et 20 l de membrane de sous-sol dans le moule du divot formé dans le film de paraffine préparé.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans la membrane du sous-sol et pipette la suspension cellulaire dans les divots filmés paraffins préparés.
- Placer les perles solidifiées et le film de paraffine dans une assiette de 6 puits. Un puits dans une assiette de 6 puits peut s'adapter jusqu'à 5 perles.
- Pipette 3-5 ml de milieu pré-chauffé contenant 10 M Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits tout en brossant doucement les perles hors du film de paraffine.
REMARQUE : En volume minimum, 3 ml sont recommandés. Pour un nombre maximum de perles (N-5) par puits, 5 ml de milieu est recommandé. - Placer la plaque à l'intérieur d'un incubateur de CO2 (5 % CO2, 37 oC).
- Changez les médias organoïdes tous les 3-4 jours. Après 5-7 jours, utilisez le milieu de culture sans 10 M Y-27632 dihydrochlorure pour maintenir les cultures.
6. Coutured d'image d'organoïdes in vivo utilisant le microscope8
REMARQUE : Certains microscopes sont incapables d'atteindre le périmètre externe de la plaque cellulaire (mur de bord); par conséquent, nous vous suggérons d'utiliser les puits près du périmètre de la plaque cellulaire lors de la couture de l'image.
- Placez la plaque de culture cellulaire en position ascendante dans le porte-plaque dans le microscope Keyence.
- Placez la lentille au centre du dôme cible.
- Configurez le processus de couture automatique en sélectionnant le nombre des images. Par exemple, 3 x 3 ou 5 x 5 peuvent être choisis pour générer 9 images ou 25 images au total.
- Appuyez sur le bouton de capture pour lancer le processus d'imagerie.
- Ouvrez le logiciel de visionneuse d'images et chargez un groupe d'images prises par l'étape 4.
- Cliquez sur Image Stitching pour créer une image cousue haute résolution.
REMARQUE : La capture d'images série 9 ou 25 peut être réalisée par commande manuelle ou automatique pour concentrer les cellules.
7. Traitement organoïde pour l'histologie : la méthode de spin down d'agarose
REMARQUE: Ce protocole est adapté d'une publication précédente par Vlachogiannis et al.7. Nous avons ajouté une étape impliquant l'intégration d'agarose pour intégrer avec succès toutes les populations d'organoïdes.
- Retirez les médias existants du puits. Veillez à ne pas aspirer les dômes de membrane du sous-sol.
- Ajouter un volume égal (égal au volume de support retiré de l'étape 1) de la solution de récupération cellulaire et incuber pendant 60 min à 4 oC.
- Déloger le dôme de membrane du sous-sol à l'aide d'une pipette et écraser le dôme de membrane du sous-sol à l'aide d'une pointe de tuyauterie. Recueillir le dôme dissocié et la solution de récupération cellulaire dans un tube de 1,5 ml.
- Centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
- Retirez le supernatant (solution de récupération cellulaire). Enregistrer tous les supernatants dans des tubes séparés jusqu'à la fin lorsque la présence d'organoïdes est confirmée dans l'étape finale de granulement.
- Ajouter le volume désiré (tableau 3) de PBS froid et doucement pipette de haut en bas pour déranger mécaniquement les granulés.
- Centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
- Retirez le supernatant (PBS).
- Fixez la pastille dans un volume assorti (p. ex., 500 l pour une pastille de l'état de culture de 24 plaques de puits, tableau 3) de 4 % de PFA pendant 60 min à température ambiante.
- Après fixation, centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
- Retirez le supernatant (PFA).
- Laver avec un volume assorti (p. ex., 500 l pour une pastille de l'état de culture des 24 plaques de puits, tableau 3) de PBS et centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
- Préparer l'agarose chaude (2% d'agarose en PBS).
REMARQUE : Ici, les granulés cellulaires pour les sections congelées peuvent être directement suspendus dans 200 L de composé OCT sans autre étape dans le Protocole 7. - Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 200 l d'agarose (2 % en PBS).
- Immédiatement après l'ajout de l'agarose, détachez délicatement la pastille cellulaire de la paroi du tube de 1,5 ml à l'aide de l'aiguille de 25 G fixée à une seringue de 1 ml. Comme le montre la figure 3, si le granule cellulaire n'est pas physiquement détaché de la paroi du tube de 1,5 ml, il y a un risque de perdre tout ou partie de la pastille cellulaire pendant le processus d'intégration de l'agarose.
- Attendez que l'agarose de 2% dans PBS soit complètement solidifiée.
- Détachez le bloc d'agarose solidifié du tube de 1,5 ml à l'aide d'une aiguille de 25 G fixée à la seringue de 1 ml.
- Transférer le bloc d'agarose détaché contenant le granule de cellules dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Remplissez le tube avec 70% EtOH et procéder plus loin en utilisant le protocole conventionnel pour la déshydratation des tissus et l'incorporation de paraffine.
8. Histologie et cytochimie immunofluorescente (IFC) des organoïdes
- Sélectionnez la diapositive (s) pour l'histologie ou l'IFC.
- Avant d'initier le processus de coloration, découvrez où les cellules sont situées sur la diapositive et dessinez un cercle autour des cellules sur la diapositive à l'aide d'un marqueur.
- Dessinez le périmètre autour du bord ou du bord de la glissière et où les cercles sont situés sur la glissière dans un cahier de laboratoire pour enregistrer leurs emplacements.
- Effectuer la coloration désirée.
REMARQUE : Au cours de ce processus, les cercles marqués disparaissent puisque le fabricant régulier n'est pas résistant aux produits chimiques. Même certains marqueurs permanents d'histologie peuvent être effacés pendant le processus de coloration. - Après le processus de coloration, placez la diapositive sur le dessin dans le cahier de laboratoire pour trouver l'emplacement des cellules sur la diapositive.
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Representative Results
Des organoïdes 3D ont été établis avec succès à partir d'un modèle de xénogreffe dérivé de patient (PDX) du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC) aussi bien que directement du tissu métastatique patient de cancer de la prostate (figure 4). En bref, nos modèles de PDX de BMPC ont été établis par l'injection intra-fémorale (IF) des cellules de tumeur dans le Rag2mâle -/- c-/- souris et puis les tumeurs de PDX ont été moissonnées et traitées comme décrit dans ce manuscrit. Comme indiqué dans la figure 4, tissus tumoraux PDX de la série PCSD a abouti à des organoïdes 3D avec des phénotypes différentiels qui se sont manifestés sous forme de kystes, sphéroïdes et organoïdes de plus grande complexité qui se sont formés à l'aide de ce protocole.
Une image cousue de 25 images de grossissement 10x haute résolution a montré un dôme entier de membrane de sous-sol et d'organoïdes (Figure 5). À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images, on a la possibilité de trier les cellules ou les amas cellulaires qui sont plus grands qu'une certaine taille ou de sélectionner manuellement des sphéroïdes ou des kystes.
Les étapes pour l'intégration d'agarose des cultures organoïdes et des conseils pour étiqueter l'emplacement des organoïdes sectionnés sur la diapositive augmentent le succès de l'exécution de l'IFC sur les organoïdes en particulier lorsque les échantillons d'organoïdes ont une densité cellulaire plus faible que souhaité. La figure 6 montre un exemple d'IFC sur une section de paraffine de 5 m d'épaisseur d'organoïdes ciblant la cytokératine 5 (CK5, marqueur épithélial basilial), la cytokératine 8 (CK8, marqueur épithélial luminal) et le DAPI.
Figure 1 : Établissement et caractérisation pour les organoïdes cultivés en 3D dérivés des tissus tumoraux du patient ou des tissus tumoraux dérivés du patient. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Méthodologies pour former un mélange de granulés cellulaires et de membrane soudoyante. Un dôme attaché (a), un dôme flottant (b) et des perles flottantes (c). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Une étape clé pour réussir l'intégration de l'agarose. Un processus pour détacher la pastille cellulaire de la paroi du tube de 1,5 ml. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Phénotypes différentiels des organoïdes d'une série de tumeurs de PDX de PCSD, qui inclut des cellules simples, des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes plus complexes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemple d'image cousue brute à partir d'un total de 25 images haute résolution et de son application à une analyse de suivi pour compter le nombre de cellules ou mesurer la zone des cellules/amas cellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Image montrant les organoïdes PCSD1 tachés CK5 et CK8 IFC (5 m d'épaisseur de section de paraffine). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Composant de stock | Concentration finale | Vol (mL) nécessaire pour une solution de 500 ml |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM De Glutamax | 2 mM | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x 1x | 5 |
| adDMEM/F12 | 485 |
Tableau 1 : préparation adDMEM/F12. Ce tableau a déjà été publié parDrost et al.5 .
| Composant de stock | Concentration finale | Vol (L) nécessaire pour une solution de 50 ml | Vol (L) nécessaire pour une solution de 25 ml |
| 50x B27 | 50x dilué | 1000 | 500 |
| 500 mM N-Acetylcystéin | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/mL d'EGF | 5 ng/mL | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/mL | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 Annonces | 10% de milieu conditionné | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/mL FGF10 | 10 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 50 g/mL FGF2 | 5 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 M | 5 | 2.5 |
| 1M Nicotinamide | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 M | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 M DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 | Amener jusqu'à 50 ml | Amener jusqu'à 25 ml | |
| 100 mM Y-27632 Dihydrochlorure | 10 M | 5 | 2.5 |
Tableau 2 : Composants pour les médias humains C/S 10 % FBS. Ce tableau a déjà été publié parDrost et al.5 .
| Plaque de culture | Densité d'ensemencement (cellules) | Volume de membrane de sous-sol (L) | Moyen (L) |
| 48 puits | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 bien | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 bien | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tableau 3 : Densité d'ensemencement, volume de membrane de sous-sol et volume moyen nécessaire pour un dôme. Ce tableau est modifié à partir d'une publication précédente par Drost et al.5.
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Discussion
Les organoïdes 3D dérivés des cellules cancéreuses de prostate de métastasie d'os patient sont encore relativement rares. Ici, nous décrivons des stratégies et le protocole optimisé de nouveau pour établir avec succès les organoïdes dérivés de patient 3D de série (PDO) de BMPC. En outre, des protocoles sont décrits pour fixer les organoïdes dans les échantillons avec la densité cellulaire inférieure pour l'analyse d'IFC et d'IHC. Les phénotypes différentiels sous forme de kyste, de sphéroïdes et d'organoïdes plus complexes indiquent que ce protocole fournit des conditions de culture qui permettent aux populations hétérogogènes de cellules de tumeur dans les patients de maintenir leur phénotype et structure cellulaires. Ainsi, les conditions de culture décrites ici, qui ont été adaptées de Drost et coll.5 modifiées avec supplémentation en sérum FBS, se sont avérées optimales pour les cultures des cellules bMPC-dérivées de patient de telle sorte qu'elles maintiennent leur hétérogénéité intra-sujet et inter-sujet (manuscrit en préparation).
Notre protocole optimisé est pratique pour une mise en place expérimentale avec plusieurs paramètres à partir de matériel de départ limité à partir de tissus tumoraux primaires ou PDX pour mettre en place des cultures d'organoïdes 3D. En général, l'établissement des organoïdes 3D des tissus primaires patients de tumeur est moins réussi que l'établissement des organoïdes 3D des tissus de tumeur de PDX. Par conséquent, il est recommandé d'avoir une densité d'ensemencement plus élevée (jusqu'à quatre fois plus élevée) des cellules pour l'établissement d'organoïdes 3D à partir de tissus tumoraux primaires patients que de tumeurs PDX). Une méthode pour augmenter le rendement cellulaire pendant le traitement des tissus tumoraux est de récupérer les restes de tissu tumoral sur le dessus de la passoire de cellules de 70 m en passant la suspension cellulaire filtrée à travers la passoire à nouveau.
Trois méthodes différentes pour former une culture organoïde 3D (Figure 2) peuvent être utilisées et facilement adaptées en fonction de l'analyse de point de terminaison de suivi. Par exemple, si l'on désirait avoir les images cousues après l'établissement des organoïdes 3D, un dôme attaché est fortement recommandé puisque le processus de couture d'image nécessite un mouvement en série d'objectif microscopique pour acquérir le nombre désiré d'images (soit 9 ou 25). Ce processus entraîne une vibration subtile pour le détenteur de la plaque de culture cellulaire. Les deux types de dôme flottant se déplaceront librement en raison de la vibration tout en acquérant l'image. En outre, les deux types de dômes flottants peuvent être facilement transférés d'un puits à l'autre, ce qui les rend aptes à la co-culture avec des cellules adhérentes après la mise en place de cultures organoïdes 3D et les cellules adhérentes dans les puits séparés. Il a été démontré que le dôme et le dôme flottant attachés retiennent les organoïdes jusqu'à 10 semaines. Fait intéressant, un dôme flottant de la méthode des perles flottantes a été montré pour conserver les organoïdes pour un jusqu'à 4 mois. La méthode des perles flottantes pour produire des sphères de membrane de sous-sol introduites dans notre protocole implique plus d'étapes et de compétences, mais peut être considérée pour une culture à long terme. En parallèle, en dépit de leur utilisation pour l'établissement des organoïdes 3D de différentes tumeurs et métastes, le rôle de la méthode de doming et de la forme de membrane de sous-sol sur la formation d'organoïdes n'ont pas été profondément déterminés. En ce sens, la méthode du film paraffine peut être considérée pour une utilisation lorsque les deux autres méthodes ont échoué.
Pour les trois méthodes différentes, ce protocole recommande d'utiliser un volume plus faible de médias et un volume plus élevé de membrane de sous-sol pour le processus de resuspension parce que les dômes dureront plus longtemps en culture. Un dôme est formé avec un rapport de 1:4 de la membrane de support et de sous-sol. Il est à noter que cette méthode augmente la formation de bulles tout en pipetting la suspension cellulaire de haut en bas depuis le volume supplémentaire de médias ne contourne pas la viscosité de la membrane du sous-sol. Par conséquent, il est recommandé de mettre en place des tubes de 1,5 ml de telle sorte qu'il y ait une pastille cellulaire par dôme au lieu d'avoir une pastille cellulaire pour plusieurs dômes dans un tube de 1,5 ml. Ce faisant, la formation de bulles dans un tube pour un dôme n'affectera pas en série d'autres dômes. Si la durée de l'état de culture a été précédemment optimisée et est connue pour être courte (jusqu'à un mois), la membrane de sous-sol peut être diluée plus pour contourner la question de viscosité de la membrane de sous-sol. Une suspension de granule cellulaire pour plusieurs puits peut être préparée dans un tube, utilisant un volume plus élevé de médias au volume désiré de la membrane de sous-sol pour réduire au minimum la perte et la variabilité de cellules.
Pour minimiser la formation de bulles pendant le processus de tuyauterie, pipette un volume inférieur au volume réel des cellules, des médias et du mélange de membrane de sous-sol. Par exemple, pour un dôme dans 24 plaques de puits, 40 l de membrane de sous-sol et jusqu'à 10 l de support complet adDMEM sont mélangés avec le granule de cellules. Dans ce cas, la pipette peut être réglé pour gérer un volume de 40 L au lieu de 50 L pendant la pipetting de haut en bas afin de minimiser la formation de bulles. Pour cette deuxième méthode, la suspension de granule cellulaire pour plusieurs puits peut être préparée dans un tube pour minimiser la perte et la variabilité des cellules. L'état liquide de la membrane de sous-sol disponible dans le commerce est souvent variable. Par conséquent, de nouveaux lots de membrane de sous-sol doivent être testés pour le processus de doming. Si la membrane du sous-sol est plus visqueuse que d'habitude, alors jusqu'à 10 l supplémentaires de supports complets adDMEM (détails écrits à l'étape 1) peuvent être ajoutés pour diluer le mélange de granules de cellules et de membrane du sous-sol.
Ici, nous présentons un protocole pour établir, imager et traiter l'organoïde 3D cultivé avec des conseils détaillés pour l'accomplissement réussi des procédures désirées. Les médias culturels pour les organoïdes 3D introduits dans notre manuscrit sont spécifiquement destinés aux cellules dérivées de la prostate. Cependant, d'autres détails décrits dans notre protocole sont applicables à différents types de tissus tumoraux et de sites métastatiques.
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Disclosures
Sanghee Lee et Christina A.M. Jamieson sont les rédactrices invitées de JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Leo and Anne Albert Charitable Foundation et la JM Foundation. Nous remercions les membres du Centre de cancérologie de l'Université de Californie à San Diego Moores, le Dr Jing Yang et le Dr Kay T. Yeung de nous avoir permis l'utilisation de leur microtome et Randall Français, département de chirurgie pour l'expertise technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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