Summary
Tredimensjonale kulturer av pasient BMPC prøver og xenografts av bein metastatisk prostatakreft opprettholde funksjonell heterogenitet av sine opprinnelige svulster resulterer i cyster, sfæroider og komplekse, tumor-lignende organoider. Dette manuskriptet gir en optimaliseringsstrategi og protokoll for 3D-kultur av heterogene pasientavledede prøver og deres analyse ved hjelp av IFC.
Abstract
Tredimensjonal (3D) kultur av organoider fra tumorprøver av menneskelige pasienter og pasientavledede xenograft (PDX) modeller av prostatakreft, referert til som pasientavledede organoider (PUD), er en uvurderlig ressurs for å studere mekanismen for tumorigenese og metastase av prostatakreft. Deres største fordel er at de opprettholder den karakteristiske genomiske og funksjonelle heterogeniteten til det opprinnelige vevet sammenlignet med konvensjonelle cellelinjer som ikke gjør det. Videre kan 3D-kulturer av PUD brukes til å forutsi effekten av legemiddelbehandling på individuelle pasienter og er et skritt mot personlig medisin. Til tross for disse fordelene bruker få grupper rutinemessig denne metoden delvis på grunn av den omfattende optimaliseringen av PUD-kulturforhold som kan være nødvendig for ulike pasientprøver. Vi har tidligere vist at vår prostatakreft bein metastase PDX modell, PCSD1, rekapitulert motstanden av donor pasientens bein metastase til anti-androgen terapi. Vi brukte PCSD1 3D organoider for å karakterisere ytterligere mekanismene for anti-androgenmotstand. Etter en oversikt over publiserte studier av PDX- og PUD-modeller, beskriver vi en trinnvis protokoll for 3D-kultur av PUD ved hjelp av domed eller flytende kjellermembran (f.eks. Matrigel) sfærer i optimaliserte kulturforhold. In vivo søm avbildning og cellebehandling for histologi er også beskrevet. Denne protokollen kan videre optimaliseres for andre applikasjoner, inkludert vestlig blot, co-kultur, etc. og kan brukes til å utforske egenskapene til 3D-kultivert PUD knyttet til resistens, tumorigenese, metastase og terapeutiske midler.
Introduction
Tredimensjonale kultiverte organoider har trukket oppmerksomhet for deres potensial til å rekapitulere in vivo arkitektur, cellulær funksjonalitet og genetisk signatur av deres opprinnelige vev1,2,3,4,5. Viktigst, 3D organoider etablert fra pasient tumor vev eller pasient avledet xenograft (PDX) modeller gir uvurderlige muligheter til å forstå mekanismer for cellulær signalering på tumorigenese og for å bestemme effekten av narkotikabehandling på hver cellepopulasjon6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 utviklet en standardprotokoll for etablering av humane og mus prostata organoider, som har blitt mye vedtatt innen urologi. I tillegg har betydelig innsats vært dedikert for ytterligere karakterisering av 3D organoider og for å forstå de detaljerte mekanismene for tumorigenese og metastase4,12,14,15. I tillegg til den tidligere etablerte og allment aksepterte protokollen for 3D-organoider kulturer, beskriver vi her en trinnvis protokoll for 3D-kulturen i PUD ved hjelp av tre forskjellige domingmetoder i optimaliserte kulturforhold.
I dette manuskriptet ble 3D organoider etablert som en ex vivo-modell av benmetastatisk prostatakreft (BMPC). Cellene som brukes for disse kulturene kom fra Prostatakreft San Diego (PCSD) serien og ble avledet direkte fra pasient prostatakreft bein metastatisk tumor vev (PCSD18 og PCSD22) eller pasient avledet xenograft (PDX) tumormodeller (prøver kalt PCSD1, PCSD13, og PCSD17). Fordi spontan benmetastase av prostatakreftceller er sjelden i genmodifiserte musemodeller16,brukte vi direkte intra-femoral (IF) injeksjon av humane tumorceller i mannlige Rag2-/-γc-/- mus for å etablere PDX-modellene av benmetastatisk prostatakreft17.
Når 3D organoider er etablert fra heterogene pasient tumorceller eller pasient avledet xenografts, er det viktig å bekrefte sin identitet som prostata tumorceller og for å bestemme sine fenotyper i 3D organoid kulturer. Immunfluorescenskjemi (IFC) tillater visualisering av proteinuttrykk in situ i hver celle, ofte indikerer de potensielle funksjonene for bestemte cellepopulasjoner2,4. Generelt er IFC-protokoller for et stort flertall av prøver, inkludert vev og celler enkle og fullt optimaliserte. Imidlertid kan celletettheten og antall organoider være betydelig lavere enn for konvensjonell kultur. Derfor krever IFC-protokollen for organoider ytterligere trinn for å sikre riktig behandling og innebygging i parafin for alle organoider i prøvene. Vi beskriver flere trinn for en agarose pre-embedding prosess og tips for å merke plasseringen av seksjonerte organoider på lysbildet som øker suksessraten til IFC på organoider, spesielt når prøvene av organoider har lavere celletetthet enn ønsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i veiledningen for University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Godkjenning ble mottatt fra UCSD Institutional Review Board (IRB) for å samle inn kirurgisk prøve fra pasienter til forskningsformål. Et informert samtykke ble innhentet fra hver pasient og en kirurgisk benprostatakreftmetastaseprøve ble hentet fra ortopedisk reparasjon av et patologisk brudd i lårbenet. Dyreprotokoller ble utført under University of California San Diego (UCSD) dyrevelferd og institusjonelle Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjente protokollen #S10298. Celler fra mekanisk og enzymatically dissosiert pasient tumorvev ble intra-femoralt injisert i 6 til 8 uker gamle mannlige Rag2-/-;γc-/- mus som tidligere beskrevet17. Xenograft tumorvolum ble bestemt ved hjelp av et in vivo bioluminescence bildesystem og kalipermålinger. Ved tumorvekst opp til 2,0 cm (den maksimale tillatte størrelsen godkjent av IACUC), ble svulsten høstet for 3D organoider etablering.
MERK: Figur 1 viser arbeidsflyten for å etablere 3D Organoids og et protokollnummer for hvert trinn i eksperimentelle prosedyrer.
1. Behandling av pasienter avledet xenograft (PDX) tumorvev
MERK: Dette er et første skritt for organoid etablering for en svulst avledet fra en xenograft musemodell. Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere publikasjon av Drost et al.5, og vi har endret medieforholdene til å inkludere serumtilskudd til organoide medier.
- Behandle tumorprøven som beskrevet nedenfor.
- Hakke tumorprøver til 1-3 mm3-størrelse stykker og fordøye prøvene med 10 ml celledissosiasjonsoppløsning i 45 min ved romtemperatur.
- For å avslutte fordøyelsen, legg til 20 ml DMEM komplette medier til prøvene.
- Filtrer suspensjonen gjennom en 70 μm cellesil. Bruk en steril stempelflens til å skyve eventuelle rester vev på toppen av 70 μm celle sil.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
- Vask cellepelleten tre ganger med friske adDMEM komplette medier. Samsvar er volumet av medier for vask ing og resuspensjon med volumet av medier foreslått i tabell 3. For eksempel, for en 24 brønnplate kulturtilstand, bør volumet for vasken være 500 μL.
MERK: Som vist i tabell 3,gjelder protokollen for ulike kulturforhold. - Bestem endelige celletellinger ved hjelp av Trypan blå farge og et hemocytometer.
- Etter å ha skaffet celletellinger, re-suspendere cellepellet i 80 μL av 2% FBS i PBS per 2 x 106 tumorceller.
- Tilsett 20 μL mus celle uttømming Cocktail per 2 x 106 tumorceller. Bland godt og inkubator i 15 min ved 2-8 °C.
- Juster volumet til 500 μL med 2% FBS i PBS-buffer per 2 x 106 tumorceller.
MERK: Opptil 1 x 107 tumorceller i 2,5 ml cellesuspensjon kan behandles på én LS-kolonne. - Legg LS-kolonnene på den magnetiske kolonneseparatoren og plasser et 15 ml konisk rør på et stativ under for å samle gjennomstrømningen.
- Skyll hver kolonne med 3 ml 2 % FBS i PBS-bufferen. Kast det koniske røret med vasken gjennomstrømning og skift ut med et nytt, sterilt 15 ml konisk rør.
- Tilsett cellesuspensjonen (opptil 2,5 ml 1 x 107 tumorceller) på kolonnen. Samle gjennomstrømning som vil være beriket med menneskelige tumorceller.
- Vask kolonnen to ganger med 1 ml 2 % FBS i PBS-buffer.
MERK: Det er viktig å utføre vasketrinn så snart kolonnen er tom. Prøv også å unngå å danne luftbobler.
- Aliquot riktig volum av celle suspensjon til en 1,5 ml rør for ønsket kultur satt opp (Tabell 3).
- Sentrifuge 1,5 ml rør ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern og kast supernatanten forsiktig.
2. Behandling av pasientens primære tumorvev
MERK: Dette er et første skritt for organoid etablering.
- Følg alle trinn 1 unntatt musecelleuttømmingsprosessen, som ikke er nødvendig for behandling av pasientens primære tumorvev.
3. Danne en festet rund kuppel på platen
MERK: Dette manuskriptet beskriver tre måter å lage en kuppel fra en blanding av cellepellet og kjellermembranen (f.eks. Matrigel) som vist i figur 1 og figur 2. I trinn 2-4 bør cellene og kjellermembranen holdes på is for å forhindre størkning av kjellermembranen.
- Resuspender cellepellet en riktig volum av kjellermembran (f.eks. 40 μL) for en 24 brønnplate satt opp (Tabell 3).
- Pipette opp og ned forsiktig for å sikre at cellene blir re-suspendert godt i kjelleren membran.
- Pipette riktig volum (Tabell 3) av celle-kjeller membran blandingen (og valgfri 10 μL adDMEM komplett media) inn i midten av pre-oppvarmet vev kultur plate.
- Snu platen og legg straks platen opp ned i CO2 cellekulturinkubatoren satt til 5% CO2, 37 ° C i 15 min. Dette hindrer celler fra å bosette seg og følge platebunnen samtidig som kjellermembranen kan stivne.
- Pipette riktig volum (tabell 3) av pre-oppvarmet medium som inneholder 10 μM Y-27632 dihydroklorid i hver brønn.
- Plasser platen rett side opp inne i CO2 cellekulturinkubatoren (5% CO2, 37 °C).
- Endre mediet hver 3-4 dager. Etter 5-7 dager, bruk kulturmedium uten 10 μM Y-27632 dihydrochloride for å opprettholde kulturene.
4. Danne en flytende kuppel fra en festet rund kuppel på platen
- Etter trinn 3.7 løsner du kuppelen ved hjelp av en celleskraper.
5. Forming flytende perler
MERK: Denne protokollen er oppkalt som flytende perler siden blandingen av kjellermembran, media og organoider ser ut som perler.
- Klipp en 2 tommers x 4 tommers stykke parafin film.
- Plasser parafinfilmen på toppen av divotene på et tomt spissholderstativ fra en 1000 μL plastpipetteboks.
- Trykk forsiktig ned på parafinfilmen for å spore divotene ved hjelp av en hanske pekefinger, men uten å bryte gjennom parafinfilmen.
- Spray parafinfilmen med 70% etanol og slå på UV-lampen i cellekulturhetten for å sterilisere den tilberedte parafinfilmen i minst 30 min.
- Forbered en blanding av celler og 20 μL kjellermembran. Seeding tetthet kan være 50.000 - 250.000 celler per kuppel.
- Pipette blandingen av celler behandlet fra trinn 1 eller 2, og 20 μL kjellermembran i formen på divotdannet i den tilberedte parafinfilmen.
- Resuspender cellepelleten i kjellermembranen og pipette cellesuspensjonen i de tilberedte parafinfilmet divots.
- Plasser de størknet perlene og parafinfilmen i en 6-brønns tallerken. En brønn i en 6-brønns tallerken kan passe opptil 5 perler.
- Pipette 3-5 ml pre-oppvarmet medium som inneholder 10 μM Y-27632 dihydroklorid i hver brønn mens forsiktig børsting perler av parafinfilmen.
MERK: Som et minimumsvolum anbefales 3 ml. For maksimalt antall perler (N= 5) per brønn anbefales 5 ml medium. - Plasser platen inne i en CO2 inkubator (5% CO2, 37 °C).
- Endre organoid media hver 3-4 dager. Etter 5-7 dager, bruk kulturmedium uten 10 μM Y-27632 dihydrochloride for å opprettholde kulturene.
6. In vivo organoider bildesøm ved hjelp av mikroskop8
MERK: Visse mikroskoper kan ikke nå den ytre omkretsen av celleplaten (kantvegg); Derfor foreslår vi å bruke brønnene nær omkretsen av celleplaten når bildesøm.
- Plasser cellekulturplaten i en oppadgående posisjon i plateholderen i Keyence-mikroskopet.
- Plasser linsen på midten av målkuppelen.
- Definer den automatiske sømprosessen ved å velge nummeret på rammene. For eksempler kan 3 x 3 eller 5 x 5 velges for å generere 9 bilder eller 25 bilder totalt.
- Trykk på opptaksknappen for å starte bildeprosessen.
- Åpne bildevisningsprogramvaren, og last inn en gruppe bilder tatt etter trinn 4.
- Klikk Bildesøm for å opprette et høyoppløselig sydd bilde.
MERK: Opptak av seriell 9 eller 25 bilder kan utføres enten ved manuell eller automatisk oppsett for å fokusere cellene.
7. Organoid behandling for histologi: agarose spin down metoden
MERK: Denne protokollen er tilpasset fra en tidligere publikasjon av Vlachogiannis et al.7. Vi har lagt til et skritt som involverer agarose innebygging for å kunne bygge inn alle populasjoner av organoider.
- Fjern eksisterende medier fra brønnen. Vær forsiktig så du ikke piraspirerkjellerenmembrankupler.
- Legg til et lik (lik volumet av medier fjernet fra trinn 1) volum av cellegjenopprettingsløsning og inkuber i 60 min ved 4 °C.
- Løsne kjelleren membran kuppel en pipette og knuse kjelleren membran kuppel en rørledning ved hjelp av en pipet tupp. Samle den dissociated kuppel og celle utvinning løsning i en 1,5 ml rør.
- Sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten (cellegjenopprettingsløsning). Lagre alle supernatanter i separate rør til slutten når tilstedeværelsen av organoider er bekreftet i det endelige pelletingtrinnet.
- Tilsett ønsket volum (Tabell 3) av kald PBS og forsiktig pipette opp og ned til mekanisk forstyrrepellet.
- Sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten (PBS).
- Fest pelleten i et matchet volum (f.eks. 500 μL for én pellet fra 24 brønnplatekulturtilstanden, tabell 3) på 4 % PFA i 60 min ved romtemperatur.
- Etter fiksering, sentrifuge ved 300 x g og 4 ° C i 5 min.
- Fjern supernatanten (PFA).
- Vask med matchet volum (f.eks. 500 μL for én pellet fra 24 brønnplatekulturtilstand, tabell 3)av PBS og sentrifuge ved 300 x g og 4 °C i 5 min.
- Forbered varm agarose (2% oppsto i PBS).
MERK: Her kan cellepellets for frosne seksjoner bli direkte suspendert i 200 μL okt-forbindelsen uten ytterligere trinn i protokoll 7. - Re-suspendere cellepellet i 200 μL agarose (2% i PBS).
- Umiddelbart etter tilsatt oppstått, løsne cellepelleten forsiktig fra veggen på 1,5 ml røret ved hjelp av 25 G nålen festet til 1 ml sprøyte. Som vist i figur 3, hvis cellepelletikken ikke er fysisk løsrevet fra veggen av 1,5 ml rør, så er det fare for å miste hele eller deler av cellepellet under agarose innebyggingsprosessen.
- Vent til 2% oppsto i PBS er helt størknet.
- Løsne den størknet agaroseblokken fra 1,5 ml rør ved hjelp av en 25 G kanyle festet til 1 ml sprøyten.
- Overfør den frittliggende agaroseblokken som inneholder cellepelleten til et nytt 1,5 ml rør.
- Fyll røret med 70% EtOH og fortsett videre ved hjelp av den konvensjonelle protokollen for vevdehydrering og parafininnebygging.
8. Histologi og immunofluorescerende cytokjemi (IFC) av organoider
- Velg lysbildene for histologi eller IFC.
- Før du tar ibruk fargeprosessen, finn ut hvor cellene er plassert på lysbildet og tegn en sirkel rundt cellene på lysbildet ved hjelp av en markør.
- Tegn omkretsen rundt kanten eller boarder av lysbildet og hvor sirkler er plassert på lysbildet i et laboratorium notatblokk for å registrere sine plasseringer.
- Utfør ønsket farging.
MERK: Under denne prosessen forsvinner merkede sirkler siden vanlig produsent ikke er motstandsdyktig mot kjemikaliene. Selv noen histologi permanente markører kan slettes under farging prosessen. - Etter fargingsprosessen plasserer du lysbildet over tegningen i laboratorienotisboken for å finne plasseringen av cellene på lysbildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D organoider ble vellykket etablert fra en pasient avledet xenograft (PDX) modell av bein metastatisk prostatakreft (BMPC) samt direkte fra pasient ben metastatisk prostatakreft vev (Figur 4). Kort ble våre PDX-modeller av BMPC etablert ved intra-femoral (IF) injeksjon av tumorceller i mannlige Rag2-/- c-/- mus og deretter PDX svulster ble høstet og behandlet som beskrevet i dette manuskriptet. Som vist i figur 4,pDX tumor vev fra PCSD-serien resulterte i 3D organoider med differensial fenotyper som manifesterte som cyster, sfæroider og høyere kompleksitet organoider som dannet ved hjelp av denne protokollen.
Et sydd bilde fra 25 høyoppløsnings 10x forstørrelsesbilder viste en hel kuppel av kjellermembran og organoider (Figur 5). Ved hjelp av bildeanalyseprogramvare har man muligheten til å sortere ut cellene eller celleklyngene som er større enn en bestemt størrelse, eller for å manuelt velge sfæroider eller cyster.
Trinnene for agarose innebygging av organoidkulturer og tips for å merke plasseringen av seksjonerte organoider på lysbildet øke suksessen med å utføre IFC på organoider spesielt når prøvene av organoider har en lavere celletetthet enn ønsket. Figur 6 viser et eksempel på IFC på en 5 μm tykk parafindel av organoider rettet mot cytokeratin 5 (CK5, basal epitelcellemarkør), cytokeratin 8 (CK8, luminal epitelcellemarkør) og DAPI.
Figur 1: Etablering og karakterisering for 3D-kultiverte organoider avledet enten fra pasientens tumorvev eller pasientavledet xenograft (PDX) tumorvev. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Metoder for å danne en blanding av cellepellets og kjellermembran. En vedlagt kuppel (a), en flytende kuppel (b) og flytende perler (c). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Et viktig skritt for vellykket agarose innebygging. En prosess for å løsne cellepelletfra veggen av 1,5 ml rør. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Differensialfetyper av organoider fra en rekke PCSD PDX svulster, som inkluderer enkeltceller, cyster, sfæroider og høyere kompleksitet organoider. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempel på et råsydd bilde fra totalt 25 høyoppløselige bilder og programmet for en oppfølgingsanalyse for å telle antall celler eller måle området av celler/celleklynger. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Bilde som viser CK5 og CK8 IFC-beiset PCSD1 organoider (5 μm tykkelse av parafinseksjon). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Lagerkomponent | Endelig konsentrasjon | Vol (ml) nødvendig for 500 ml oppløsning |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM (andre) | 5 |
| 100x penn-strep | 1x (andre) | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabell 1: adDMEM/F12 +/+/+ Klargjøring. Denne tabellen er tidligere publisert av Drost et al.5.
| Lagerkomponent | Endelig konsentrasjon | Vol (μL) som trengs for 50 ml oppløsning | Vol (μL) som trengs for 25 ml oppløsning |
| 50x B27 | 50x fortynnet | 1000 | 500 |
| 500 mM N-Acetylcysteine | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/ml EGF | 5 ng/ml | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/ml Noggin | 100 ng/ml | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | 10% betinget medium | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/ml FGF10 | 10 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 50 μg/ml FGF2 | 5 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M Nikotinamid | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| FBS (andre) | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Ta opp til 50 ml | Ta opp til 25 ml | |
| 100 mM Y-27632 Dihydroklorid | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tabell 2: Komponenter for C/S Human Media + 10 % FBS. Denne tabellen er tidligere publisert av Drost et al.5.
| Kultur Plate | Seeding Tetthet (celler) | Kjeller membran volum (μL) | Middels (μL) |
| 48 godt | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 godt | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 godt | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabell 3: Seeding tetthet, kjeller membran volum, og middels volum som trengs for en kuppel. Denne tabellen endres fra en tidligere publikasjon av Drost et al.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D organoider avledet fra pasientens benmetastase prostatakreftceller er fortsatt relativt sjeldne. Her beskriver vi strategier og ytterligere optimalisert protokoll for å etablere seriell 3D-pasient avledet organoider (PDOer) av BMPC. I tillegg er protokoller beskrevet for å sikre organoider i prøver med lavere celletetthet for IFC og IHC analyse. Differensialfetyper i form av cyste, sfæroider og mer komplekse organoider indikerer at denne protokollen gir kulturforhold som gjør det mulig for heterogonøse tumorcellepopulasjoner hos pasienter å beholde sin cellulære fenotype og struktur. Dermed har kulturforholdene beskrevet her, som ble tilpasset drost et al.5 modifisert med FBS serumtilskudd, vist seg å være optimale for kulturene til pasientBMPC-avledede celler slik at de beholder sin intra-subjekt og inter-subjektiske heterogenitet (manuskript i forberedelse).
Vår optimaliserte protokoll er praktisk for et eksperimentelt oppsett med flere endepunkter fra begrenset startmateriale fra primær- eller PDX-tumorvev for å sette opp 3D-organoiderkulturer. Generelt er etablering av 3D organoider fra pasientens primære tumorvev mindre vellykket enn etablering av 3D organoider fra PDX tumorvev. Derfor anbefales det å ha en høyere såingtetthet (opptil fire ganger høyere) av celler for etablering av 3D organoider fra pasientens primære tumorvev enn fra PDX svulster). En metode for å øke celleutbyttet under tumorvevsbehandling er å gjenopprette eventuelle tumorvevrester på toppen av 70 μm cellesil ved å sende den filtrerte cellesuspensjonen gjennom silen igjen.
Tre forskjellige metoder for å danne en 3D organoid kultur (Figur 2) kan brukes og lett tilpasses avhengig av oppfølgingendepunktanalyse. For eksempel, hvis man ønsket å ha sydd bilder etter å ha etablert 3D organoider, anbefales en vedlagt kuppel sterkt siden bildesømprosessen krever en seriell bevegelse av mikroskopisk mål for å skaffe ønsket antall bilder (enten 9 eller 25). Denne prosessen resulterer i en subtil vibrasjon til innehaveren av cellekulturplate. Begge typer av den flytende kuppelen vil fritt bevege seg på grunn av vibrasjonen mens du anskaffer bildet. I tillegg kan begge typer flytende kupler lett overføres fra en brønn til den andre, noe som gjør dem egnet for co-kultur med tilhengerceller etter å ha satt opp 3D organoid kulturer og de overholdte cellene i de separate brønnene. Den vedlagte kuppelen og den flytende kuppelen som frigjøres fra å være festet, har vist seg å beholde organoider i opptil 10 uker. Interessant, en flytende kuppel fra flytende perler metoden har vist seg å beholde organoider i opptil 4 måneder. Den flytende perler metoden for å produsere kjeller membran kuler introdusert i vår protokoll innebærer flere trinn og ferdigheter, men kan vurderes for en langsiktig kultur. Parallelt, til tross for deres bruk for etablering av 3D organoider fra forskjellige svulster og metastase, har rollen til domingmetoden og kjellermembranformen på organoider dannelse ikke blitt dypt bestemt. I den forstand kan parafinfilmmetoden vurderes for bruk når de to andre metodene har vært mislykket.
For alle tre forskjellige metoder anbefaler denne protokollen å bruke et lavere volum av medier og et høyere volum av kjellermembran for resuspensjonsprosessen fordi kuplene vil vare lenger i kulturen. En kuppel er dannet med et 1:4-forhold mellom media og kjellermembran. Merk, denne metoden øker dannelsen av bobler mens pipettering av cellesuspensjonen opp og ned siden det ekstra volumet av media ikke omgå viskositeten til kjellermembranen. Derfor anbefales det å sette opp 1,5 ml rør slik at det er en cellepellet per hver kuppel i stedet for å ha en cellepellet for flere kupler i ett 1,5 ml rør. Ved å gjøre det vil dannelsen av bobler i ett rør for en kuppel ikke serielt påvirke andre kupler. Hvis varigheten av kulturtilstanden tidligere er optimalisert og er kjent for å være kort (opptil en måned), kan kjellermembranen fortynnes mer for å omgå viskositetsspørsmålet til kjellermembranen. En cellepellet resuspension for flere brønner kan tilberedes i ett rør, ved hjelp av et høyere volum av media til ønsket volum av kjellermembran for å minimere celletap og variasjon.
For å minimere bobledannelse under pipttingsprosessen, pipette et lavere volum enn det faktiske volumet av cellene, media og kjellermembranblandingen. For eksempel, for en kuppel innenfor 24 brønnplater, blandes 40 μL kjellermembran og opptil 10 μL adDMEM komplette medier med cellepellet. I dette tilfellet kan pipetten settes til å håndtere et volum på 40 μL i stedet for 50 μL mens piptting opp og ned for å minimere bobledannelse. For denne andre metoden kan cellepelletresuspensjon en gang til flere brønner tilberedes i ett rør for å minimere celletap og variasjon. Den flytende statusen til kommersielt tilgjengelig kjellermembran er ofte variabel. Derfor må nye partier av kjellermembran testes for domingsprosessen. Hvis kjellermembranen er mer viskøs enn vanlig, kan opptil ytterligere 10 μL adDMEM komplette medier (detaljer skrevet i trinn 1) legges til for å fortynne blandingen av cellepellet og kjellermembran.
Her presenterer vi en protokoll for å etablere, bilde og behandle kultivert 3D organoid med detaljerte tips for vellykket gjennomføring av de ønskede prosedyrene. Kulturmedier for 3D-organoider introdusert i vårt manuskript er spesielt for prostata-avledede celler. Andre detaljer som er beskrevet i vår protokoll, gjelder imidlertid for ulike typer tumorvev og metastatiske steder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sanghee Lee og Christina A.M. Jamieson er gjesteredaktører av JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Leo og Anne Albert Charitable Foundation og JM Foundation. Vi takker University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmer, Dr. Jing Yang og Dr. Kay T. Yeung for å tillate oss bruk av deres mikrotome og Randall French, Department of Surgery for teknisk ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
