Summary
Los cultivos tridimensionales de muestras BMPC pacientes y xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico óseo mantienen la heterogeneidad funcional de sus tumores originales, lo que resulta en quistes, esferoides y organoides complejos similares a tumores. Este manuscrito proporciona una estrategia de optimización y protocolo para el cultivo 3D de muestras derivadas de pacientes heterogéneos y su análisis utilizando IFC.
Abstract
El cultivo tridimensional (3D) de organoides a partir de muestras tumorales de pacientes humanos y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata, conocidos como organoides derivados del paciente (DOP), son un recurso invaluable para estudiar el mecanismo de tumorigenesis y metástasis del cáncer de próstata. Su principal ventaja es que mantienen la heterogeneidad genómica y funcional distintiva del tejido original en comparación con las líneas celulares convencionales que no lo hacen. Además, los cultivos 3D de DOP se pueden utilizar para predecir los efectos del tratamiento farmacológico en pacientes individuales y son un paso hacia la medicina personalizada. A pesar de estas ventajas, pocos grupos utilizan rutinariamente este método en parte debido a la amplia optimización de las condiciones de cultivo de DOP que pueden ser necesarias para diferentes muestras de pacientes. Anteriormente demostramos que nuestro modelo PDX de metástasis ósea de cáncer de próstata, PCSD1, recapitulaba la resistencia de la metástasis ósea del paciente donante a la terapia antiandrógeno. Utilizamos organoides PCSD1 3D para caracterizar aún más los mecanismos de resistencia a los antiandrógenos. Siguiendo una visión general de los estudios publicados actualmente de los modelos PDX y PDO, describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando esferas de membrana de sótano abovedada o flotante (por ejemplo, Matrigel) en condiciones de cultivo optimizadas. También se describen las imágenes de puntadas in vivo y el procesamiento celular para histología. Este protocolo se puede optimizar aún más para otras aplicaciones, incluyendo la mancha occidental, la cocultura, etc. y se puede utilizar para explorar las características de la DOP cultivada en 3D relacionadas con la resistencia a los medicamentos, la tumorigenesis, la metástasis y las terapias.
Introduction
Los organoides cultivados tridimensionales han llamado la atención por su potencial para recapitular la arquitectura in vivo, la funcionalidad celular y la firma genética de sus tejidos originales1,2,3,4,5. Lo más importante es que los organoides 3D establecidos a partir de tejidos tumorales de pacientes o modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) proporcionan oportunidades inestimables para comprender los mecanismos de señalización celular sobre la tumorigenesis y determinar los efectos del tratamiento farmacológico en cada población celular6,7,8,9,10,11,12,13. 5 desarrolló un protocolo estándar para el establecimiento de organoides de próstata humanos y de ratón, que ha sido ampliamente adoptado en el campo de la urología. Además, se ha dedicado un esfuerzo significativo para una mayor caracterización de los organoides 3D y para comprender los mecanismos detallados de la tumorigenesis y la metástasis4,12,14,15. Además del protocolo previamente establecido y ampliamente aceptado para las culturas de organoides 3D, aquí describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando tres métodos de doming diferentes en condiciones de cultivo optimizadas.
En este manuscrito, los organoides 3D se establecieron como un modelo ex vivo de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC). Las células utilizadas para estos cultivos provenían de la serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) y se derivaron directamente de los tejidos tumorales metastásicos del cáncer de próstata del paciente (PCSD18 y PCSD22) o de los modelos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) (muestras denominadas PCSD1, PCSD13 y PCSD17). Debido a que la metástasis ósea espontánea de las células cancerosas de próstata es poco frecuente en los modelos de ratón genéticamente modificados16, utilizamos la inyección directa intrafemoral (IF) de células tumorales humanas en machos Rag2-/-c-/- ratones para establecer los modelos PDX del cáncer de próstata metastásico óseo17.
Una vez que los organoides 3D se establecen a partir de células tumorales de pacientes heterogéneos o xenoinjertos derivados del paciente, es esencial confirmar su identidad como células tumorales de próstata y determinar sus fenotipos en los cultivos organoides 3D. La química de la inmunofluorescencia (IFC) permite la visualización de la expresión proteica in situ en cada célula, a menudo indicando las funciones potenciales para poblaciones celulares específicas2,4. En general, los protocolos IFC para una gran mayoría de muestras, incluidos los tejidos y las células, son sencillos y están totalmente optimizados. Sin embargo, la densidad celular y el número de organoides pueden ser significativamente menores que la del cultivo convencional. Por lo tanto, el protocolo IFC para organoides requiere pasos adicionales para asegurar el procesamiento adecuado y la inserción en parafina para todos los organoides en las muestras. Describimos pasos adicionales para un proceso de preincrustación de agarosa y consejos para etiquetar la ubicación de organoides seccionados en la diapositiva que aumenta la tasa de éxito de IFC en organoides, especialmente cuando las muestras de organoides tienen menor densidad celular de la deseada.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de California en San Diego (UCSD). IRB #090401 La aprobación fue recibida de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCSD para recolectar muestras quirúrgicas de pacientes con fines de investigación. Se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente y se obtuvo una muestra de metástasis quirúrgica de cáncer de próstata ósea a partir de la reparación ortopédica de una fractura patológica en el fémur. Los protocolos de los animales se realizaron bajo el protocolo aprobado por la Universidad de California en San Diego (UCSD) y el Protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) #S10298. Las células del tejido tumoral del paciente disociado mecánica y enzimáticamente se inyectaron intrafemoralmente enratones macho sin o 8 semanas de edad,como se describió anteriormente17. El volumen tumoral de xenoinjerto se determinó utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo y mediciones de pinza. Tras el crecimiento tumoral de hasta 2,0 cm (el tamaño máximo permitido aprobado por IACUC), el tumor fue cosechado para el establecimiento de organoides 3D.
NOTA: La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para establecer organoides 3D y un número de protocolo para cada paso de los procedimientos experimentales.
1. Procesamiento de tejidos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)
NOTA: Este es un paso inicial para el establecimiento organoide de un tumor derivado de un modelo de ratón xenoinjerto. Este protocolo está adaptado de una publicación anterior de Drost et al.5 y hemos modificado las condiciones de los medios de comunicación para incluir la suplementación con suero a medios organoides.
- Procesar la muestra tumoral como se describe a continuación.
- Muestras de tumor de picado a piezas de 1-3 mm3 de tamaño y digerir las muestras con 10 ml de solución de disociación celular durante 45 min a temperatura ambiente.
- Para terminar la digestión, agregue 20 ml de medios completos DMEM a las muestras.
- Filtrar la suspensión a través de un colador de células de 70 m. Utilice una brida de émbolo estéril para empujar cualquier tejido sobrante en la parte superior del colador de células de 70 m.
- Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4oC.
- Lave el pellet celular tres veces con un medio completo adDMEM fresco. Haga coincidir el volumen de medios para el lavado y la resuspensión con el volumen de medios sugerido en la Tabla 3. Por ejemplo, para una condición de cultivo de placa de 24 pocillos, el volumen para el lavado debe ser de 500 l.
NOTA: Como se muestra en la Tabla 3, el protocolo es aplicable a diferentes condiciones de cultivo. - Determine el recuento final de células con el tinte azul Trypan y un hemocitómetro.
- Después de obtener el recuento celular, vuelva a suspender el gránulo celular en 80 ml de 2% de FBS en PBS por 2 x 106 células tumorales.
- Añadir 20 l de cóctel de agotamiento de células de ratón por 2 x 106 células tumorales. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 2-8 oC.
- Ajuste el volumen a 500 l con un 2% de FBS en tampón de PBS por 2 x 106 células tumorales.
NOTA: Se pueden procesar hasta 1 x 107 células tumorales en 2,5 ml de suspensión celular en una columna LS. - Cargue las columnas LS en el separador de columna magnética y coloque un tubo cónico de 15 ml en un bastidor debajo para recoger el flujo.
- Enjuague cada columna con 3 ml de 2% de FBS en el búfer PBS. Deseche el tubo cónico con el lavado que fluye y sustitúyalo por un nuevo tubo cónico estéril de 15 ml.
- Agregue la suspensión celular (hasta 2,5 ml de 1 x 107 células tumorales) a la columna. Recoger el flujo a través de que será el enriquecido con las células tumorales humanas.
- Lave la columna dos veces con 1 ml de 2% de FBS en el búfer PBS.
NOTA: Es importante realizar pasos de lavado tan pronto como la columna esté vacía. Además, trate de evitar la formación de burbujas de aire.
- Alícuota el volumen adecuado de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml para el cultivo deseado configurado (Tabla 3).
- Centrifugar el tubo de 1,5 ml a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
- Retire y deseche con cuidado el sobrenadante.
2. Procesamiento de los tejidos tumorales primarios del paciente
NOTA: Este es un paso inicial para el establecimiento de organoides.
- Siga todos los pasos 1 excepto el proceso de agotamiento de la célula del ratón, que no es necesario para el procesamiento de los tejidos tumorales primarios del paciente.
3. Formar una cúpula redonda en la placa
NOTA: Este manuscrito describe tres formas de hacer una cúpula a partir de una mezcla del pellet celular y la membrana del sótano (por ejemplo, Matrigel) como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. En los pasos 2-4, las células y la membrana del sótano deben mantenerse en hielo para evitar la solidificación de la membrana del sótano.
- Resuspenda el gránulo celular en el volumen adecuado de membrana del sótano (p. ej., 40 l) para una placa de 24 pocillos configurada(Tabla 3).
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para asegurarse de que las células se vuelvan a suspender bien en la membrana del sótano.
- Pipetear el volumen apropiado(Tabla 3) de la mezcla de membrana cell-basement (y opcional 10 l de adDMEM de medios completos) en el centro de la placa de cultivo de tejido precalentado.
- Invierta la placa y coloque inmediatamente la placa boca abajo en la incubadora de cultivo celular CO2 a 5% co2,37 oC durante 15 min. Esto evita que las células se asienten y se adhieran al fondo de la placa mientras permite que la membrana del sótano se solidifique.
- Pipetear el volumen apropiado(Tabla 3) de medio precalentado que contiene 10 M y-27632 dihidrocloruro en cada pocil.
- Coloque la placa del lado derecho dentro de la incubadora de cultivo celular CO2 (5% CO2, 37 oC).
- Cambie el medio cada 3-4 días. Después de 5-7 días, utilice el medio de cultivo sin 10 M Y-27632 dihidrocloruro para mantener los cultivos.
4. Formando una cúpula flotante a partir de una cúpula redonda unida en la placa
- Después del paso 3.7, separe la cúpula usando un rascador de celda.
5. Formación de perlas flotantes
NOTA: Este protocolo se denomina perlas flotantes, ya que la mezcla de membrana de sótano, medios y organoides se ven como cuentas.
- Corte una película de 2 pulgadas x 4 pulgadas de parafina.
- Coloque la película de parafina en la parte superior de los divots de un estante vacío de sujeción de puntas de una caja de punta de pipeta de plástico de 1000 ml.
- Presione suavemente hacia abajo sobre la película de parafina para rastrear los divots usando un dedo índice enguantado, pero sin romper a través de la película de parafina.
- Rocíe la película de parafina con 70% de etanol y encienda la lámpara UV en la campana de cultivo celular para esterilizar la película de parafina preparada durante al menos 30 minutos.
- Preparar una mezcla de células y 20 ml de membrana del sótano. La densidad de sembrado puede ser de 50.000 a 250.000 células por cúpula.
- Pipetear la mezcla de células procesadas a partir del paso 1 o 2, y 20 l de membrana de sótano en el molde de la divot formada en la película de parafina preparada.
- Resuspenda el pellet celular en la membrana del sótano y pipetee la suspensión celular en los divots filmados con parafina preparado.
- Coloque las cuentas solidificadas y la película de parafina en una placa de 6 pocillos. Un pozo en un plato de 6 pocillos puede caber hasta 5 perlas.
- Pipetear 3-5 ml de medio precalentado que contiene 10 M Y-27632 dihidrocloruro en cada pocil mientras se cepillan suavemente las perlas de la película de parafina.
NOTA: Como volumen mínimo, se recomiendan 3 ml. Para un número máximo de perlas (N-5) por pozo, se recomiendan 5 ml de medio. - Colocar la placa dentro de una incubadora de CO2 (5% CO2, 37oC).
- Cambie el medio organoide cada 3-4 días. Después de 5-7 días, utilice el medio de cultivo sin 10 M Y-27632 dihidrocloruro para mantener los cultivos.
6. Costura de imagen de organoides in vivo con microscopio8
NOTA: Ciertos microscopios no pueden alcanzar el perímetro exterior de la placa celular (pared del borde); por lo tanto, sugerimos utilizar los pozos cerca del perímetro de la placa de la celda cuando la costura de la imagen.
- Coloque la placa de cultivo celular en posición ascendente en el soporte de la placa en el microscopio keyence.
- Coloque la lente en el centro de la cúpula objetivo.
- Configure el proceso de costura automática seleccionando el número de fotogramas. Por ejemplo, se pueden elegir 3 x 3 o 5 x 5 para generar 9 imágenes o 25 imágenes en total.
- Pulse el botón de captura para iniciar el proceso de creación de imágenes.
- Abra el software del visor de imágenes y cargue un grupo de imágenes tomadas en el paso 4.
- Haga clic en Punto de imagen para crear una imagen cosida de alta resolución.
NOTA: La captura de imágenes serie 9 o 25 se puede realizar mediante configuración manual o automática para enfocar las celdas.
7. Procesamiento organoide para histología: el método de agarosa spin down
NOTA: Este protocolo está adaptado de una publicación anterior de Vlachogiannis et al.7. Hemos añadido un paso que implica la incrustación de agarosa para incrustar con éxito todas las poblaciones de organoides.
- Elimine los medios existentes del pozo. Tenga cuidado de no aspirar las cúpulas de membrana del sótano.
- Agregue un volumen igual (igual al volumen de medios eliminado del paso 1) volumen de la solución de recuperación de células e incubar durante 60 min a 4 oC.
- Desaloje la cúpula de membrana del sótano usando una pipeta y aplasta la cúpula de la membrana del sótano usando una punta de pipeta. Recoja la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 ml.
- Centrífuga a 300 x g y 4oC durante 5 min.
- Retire el sobrenadante (solución de recuperación celular). Guarde todos los sobrenadores en tubos separados hasta el final cuando se confirme la presencia de organoides en el paso final de peletización.
- Añadir el volumen deseado(Tabla 3) de PBS frío y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para perturbar mecánicamente el pellet.
- Centrífuga a 300 x g y 4oC durante 5 min.
- Retire el sobrenadante (PBS).
- Fijar el pellet en un volumen igualado (por ejemplo, 500 l para un pellet de la condición de cultivo de placa de 24 pozos, Tabla 3) de 4% PFA durante 60 min a temperatura ambiente.
- Después de la fijación, centrífuga a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
- Retire el sobrenadante (PFA).
- Lavar con volumen igualado (p. ej., 500 l para un pellet de la condición de cultivo de placa de 24 pozos, Tabla 3) de PBS y centrífuga a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
- Preparar agarosa caliente (2% agarosa en PBS).
NOTA: Aquí, los gránulos celulares para secciones congeladas se pueden volver a suspender directamente en 200 l de compuesto OCT sin más pasos en el Protocolo 7. - Vuelva a suspender el gránulos celulares en 200 ml de agarosa (2% en PBS).
- Inmediatamente después de añadir agarosa, separa suavemente el pellet celular de la pared del tubo de 1,5 ml con la aguja de 25 G unida a la jeringa de 1 ml. Como se muestra en la Figura 3, si el pellet celular no está separado físicamente de la pared del tubo de 1,5 ml, entonces existe el riesgo de perder todo o parte del pellet celular durante el proceso de incrustación de agarosa.
- Espere hasta que la agarosa del 2% en PBS esté completamente solidificada.
- Separe el bloque de agarosa solidificado del tubo de 1,5 ml utilizando una aguja de 25 G unida a la jeringa de 1 ml.
- Transfiera el bloque de agarosa separado que contiene el pellet celular a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Llene el tubo con 70% EtOH y continúe utilizando el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la incrustación de parafina.
8. Histología y citoquímica inmunofluorescente (IFC) de organoides
- Seleccione la(s) diapositiva(s) para histología o IFC.
- Antes de iniciar el proceso de tinción, descubra dónde se encuentran las celdas en la diapositiva y dibuje un círculo alrededor de las celdas de la diapositiva utilizando un marcador.
- Dibuje el perímetro alrededor del borde o el borde de la diapositiva y donde se encuentran los círculos en la diapositiva de un cuaderno de laboratorio para registrar sus ubicaciones.
- Realice la tinción deseada.
NOTA: Durante este proceso, los círculos marcados desaparecen ya que el fabricante regular no es resistente a los productos químicos. Incluso algunos marcadores permanentes de histología pueden ser borrados durante el proceso de tinción. - Después del proceso de tinción, coloque la diapositiva sobre el dibujo en el cuaderno de laboratorio para encontrar las ubicaciones de las celdas en la diapositiva.
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Representative Results
Los organoides 3D se establecieron con éxito a partir de un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC), así como directamente del tejido de cáncer de próstata metastásico del paciente(Figura 4). Brevemente, nuestros modelos PDX de BMPC fueron establecidos por inyección intra-femoral (IF) de células tumorales en machos Rag2-/- c-/- ratones y luego los tumores PDX fueron cosechados y procesados como se describe en este manuscrito. Como se muestra en la Figura 4,los tejidos tumorales PDX de la serie PCSD dieron como resultado organoides 3D con fenotipos diferenciales que se manifestaron como quistes, esferoides y organoides de mayor complejidad que se formaron utilizando este protocolo.
Una imagen cosida de 25 imágenes de aumento de alta resolución 10x mostró una cúpula entera de membrana del sótano y organoides(Figura 5). Mediante el uso del software de análisis de imágenes, uno tiene la opción de ordenar las celdas o los clústeres de celdas que son más grandes que un cierto tamaño o seleccionar manualmente esferoides o quistes.
Los pasos para la incrustación de agarosa de los cultivos organoides y las puntas para etiquetar la ubicación de los organoides seccionados en la diapositiva aumentan el éxito de realizar IFC en los organoides, especialmente cuando las muestras de organoides tienen una densidad celular menor de la deseada. La Figura 6 muestra un ejemplo de IFC en una sección de parafina de 5 m de espesor de organoides dirigida a la citoqueratina 5 (CK5, marcador de células epiteliales basales), citoqueratina 8 (CK8, marcador de células epiteliales luminales) y DAPI.
Figura 1: Establecimiento y caracterización de organoides cultivados en 3D derivados de tejidos tumorales de pacientes o tejidos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Metodologías para formar una mezcla de pellets celulares y membrana de sótano. Una cúpula adjunta (a), una cúpula flotante (b) y cuentas flotantes (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un paso clave para la incrustación correcta de agarosa. Un proceso para separar el pellet celular de la pared del tubo de 1,5 ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fenotipos diferenciales de organoides de una serie de tumores PCSD PDX, que incluye células individuales, quistes, esferoides y organoides de mayor complejidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de una imagen cosida sin procesar de un total de 25 imágenes de alta resolución y su aplicación para un análisis de seguimiento para contar el número de celdas o medir el área de celdas/clústeres de celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen que muestra los organoides PCSD1 teñidos CK5 y CK8 IFC (5 m de espesor de la sección de parafina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente de stock | Concentración final | Vol (ml) necesario para 500 ml de solución |
| HEPES de 1000 mM | 10 mM | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM | 5 |
| 100x Pen-Strep | 1x | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabla 1: preparación adDMEM/F12 +/+/+. Esta tabla ha sido publicada previamente por Drost et al.5.
| Componente de stock | Concentración final | Vol (L) necesario para la solución de 50 ml | Vol (L) necesario para la solución de 25 ml |
| 50x B27 | 50x Diluido | 1000 | 500 |
| 500 mM N-acetilcisteína | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/ml de EGF | 5 ng/mL | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/mL | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | 10% medio condicionado | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/mL FGF10 | 10 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 50 g/mL FGF2 | 5 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandina E2 | 1 M | 5 | 2.5 |
| 1M Nicotinamida | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 m | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 M DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Llevar hasta 50 ml | Llevar hasta 25 ml | |
| 100 mM Y-27632 Dihidrocloruro | 10 m | 5 | 2.5 |
Tabla 2: Componentes para medios humanos C/S + 10 % FBS. Esta tabla ha sido publicada previamente por Drost et al.5.
| Placa de cultura | Densidad de sembración (células) | Volumen de la membrana del sótano (L) | Medio (L) |
| 48 pozo | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 pozo | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 pozo | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabla 3: Densidad de sembrado, volumen de membrana de sótano y volumen medio necesario para una cúpula. Esta tabla se modifica de una publicación anterior de Drost et al.5.
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Discussion
Los organoides 3D derivados de las células de cáncer de próstata de metástasis ósea del paciente son todavía relativamente raros. Aquí, describimos estrategias y protocolo optimizado para establecer con éxito organoides derivados de pacientes 3D en serie (DOP) de BMPC. Además, los protocolos se describen para asegurar los organoides en muestras con menor densidad celular para el análisis ifC e IHC. Los fenotipos diferenciales en forma de quiste, esferoides y organoides más complejos indican que este protocolo proporciona condiciones de cultivo que permiten a las poblaciones de células tumorales heterogónicas en pacientes conservar su fenotipo y estructura celular. Por lo tanto, se ha demostrado que las condiciones de cultivo descritas aquí, que fueron adaptadas de Drost et al.5 modificadas con suplementación con suero FBS, son óptimas para los cultivos de células derivadas de BMPC pacientes, de modo que conservan su heterogeneidad intra-sujeto e inter-sujeto (manuscrito en preparación).
Nuestro protocolo optimizado es práctico para una configuración experimental con múltiples puntos finales de material de partida limitado de tejidos tumorales primarios o PDX para configurar cultivos de organoides 3D. En general, el establecimiento de organoides 3D a partir de tejidos tumorales primarios del paciente es menos exitoso que el establecimiento de organoides 3D a partir de tejidos tumorales PDX. Por lo tanto, se recomienda tener una mayor densidad de semillas (hasta cuatro veces mayor) de células para el establecimiento de organoides 3D a partir de tejidos tumorales primarios del paciente que de tumores PDX). Un método para aumentar el rendimiento celular durante el procesamiento del tejido tumoral es recuperar cualquier resto de tejido tumoral en la parte superior del colador celular de 70 m pasando de nuevo la suspensión celular filtrada a través del colador.
Se pueden utilizar y adaptar fácilmente tres métodos diferentes para formar un cultivo organoide 3D(Figura 2)dependiendo del análisis de punto final de seguimiento. Por ejemplo, si se desea tener las imágenes cosidas después de establecer organoides 3D, se recomienda una cúpula adjunta, ya que el proceso de costura de la imagen requiere un movimiento en serie de objetivo microscópico para adquirir el número deseado de imágenes (9 o 25). Este proceso resulta en una sutil vibración en el soporte de la placa de cultivo celular. Ambos tipos de la cúpula flotante se moverán libremente debido a la vibración mientras se adquiere la imagen. Además, ambos tipos de cúpulas flotantes se pueden transferir fácilmente de un pozo a otro, por lo que son adecuados para el cocultivo con células adherentes después de establecer cultivos organoides 3D y las células adherentes en los pozos separados. Se ha demostrado que la cúpula adjunta y la cúpula flotante liberadas de estar unidas retienen organoides durante un máximo de 10 semanas. Curiosamente, se ha demostrado que una cúpula flotante del método de cuentas flotantes retiene organoides durante un máximo de 4 meses. El método de cuentas flotantes para producir esferas de membrana de sótano introducidas en nuestro protocolo implica más pasos y habilidades, pero se puede considerar para un cultivo a largo plazo. Paralelamente, a pesar de su uso para el establecimiento de organoides 3D de diferentes tumores y metástasis, el papel del método doming y la forma de la membrana del sótano en la formación de organoides no han sido profundamente determinados. En ese sentido, el método de película de parafina se puede considerar para su uso cuando los otros dos métodos han sido infructuosos.
Para los tres métodos diferentes, este protocolo recomienda el uso de un menor volumen de medios y un mayor volumen de membrana de sótano para el proceso de resuspensión porque las cúpulas durarán más tiempo en cultivo. Una cúpula se forma con una proporción de 1:4 de medios y membrana de sótano. Cabe destacar que este método aumenta la formación de burbujas mientras pipetea la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo ya que el volumen añadido de medios no elude la viscosidad de la membrana del sótano. Por lo tanto, se recomienda configurar tubos de 1,5 ml de tal manera que haya un pellet celular por cada cúpula en lugar de tener un pellet celular para varias cúpulas en un tubo de 1,5 ml. Al hacerlo, la formación de burbujas en un tubo para una cúpula no afectará en serie a otras cúpulas. Si la duración de la condición de cultivo ha sido optimizada previamente y se sabe que es corta (hasta un mes), la membrana del sótano se puede diluir más para eludir el problema de viscosidad de la membrana del sótano. Una resuspensión de pellets celulares para varios pozos se puede preparar en un tubo, utilizando un mayor volumen de medios al volumen deseado de la membrana del sótano para minimizar la pérdida de células y la variabilidad.
Para minimizar la formación de burbujas durante el proceso de pipeteo, pipetee un volumen inferior al volumen real de las células, los medios y la mezcla de membrana del sótano. Por ejemplo, para una cúpula dentro de 24 placas de pozo, 40 l de membrana de sótano y hasta 10 l de medios completos adDMEM se mezclan con el pellet celular. En este caso, la pipeta se puede ajustar para manejar un volumen de 40 l en lugar de 50 l mientras se pipetea hacia arriba y hacia abajo con el fin de minimizar la formación de burbujas. Para este segundo método, la resuspensión de pellets celulares para varios pozos se puede preparar en un tubo para minimizar la pérdida de células y la variabilidad. El estado líquido de la membrana del sótano disponible comercialmente es a menudo variable. Por lo tanto, los nuevos lotes de membrana del sótano necesitan ser probados para el proceso de doming. Si la membrana del sótano es más viscosa de lo habitual, entonces se pueden añadir hasta 10 l adicionales de medios completos adDMEM (detalles escritos en el paso 1) para diluir la mezcla de pellet celular y membrana de sótano.
Aquí, presentamos un protocolo para establecer, imagen y proceso cultivado organoide 3D con consejos detallados para la realización exitosa de los procedimientos deseados. Los medios de cultivo para organoides 3D introducidos en nuestro manuscrito son específicamente para células derivadas de la próstata. Sin embargo, otros detalles descritos en nuestro protocolo son aplicables a diferentes tipos de tejidos tumorales y sitios metastásicos.
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Disclosures
Sanghee Lee y Christina A.M. Jamieson son los editores invitados de JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Caritativa Leo y Anne Albert y la Fundación JM. Agradecemos a los miembros del Centro Oncológico de la Universidad de California En San Diego Moores, el Dr. Jing Yang y el Dr. Kay T. Yeung por permitirnos el uso de su microtome y Randall French, Departamento de Cirugía para la experiencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
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