Summary
Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.
Abstract
İnsan hastalarının tümör örneklerinden organoidlerin üç boyutlu (3D) kültürü ve hasta kaynaklı organoidler (PDO) olarak adlandırılan prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, tümörigenez ve prostat kanseri metastazı. Onların en büyük avantajı, orijinal dokunun ayırt edici genomik ve fonksiyonel heterojenliğini geleneksel hücre hatlarına göre korumalarıdır. Ayrıca, PDO'nun 3D kültürleri ilaç tedavisinin bireysel hastalar üzerindeki etkilerini tahmin etmek için kullanılabilir ve kişiselleştirilmiş tıbba doğru atılmış bir adımdır. Bu avantajlara rağmen, farklı hasta örnekleri için gerekli olabilecek PDO kültür koşullarının kapsamlı optimizasyonu nedeniyle bu yöntemi rutin olarak çok az grup kullanmaktadır. Daha önce prostat kanseri kemik metastazı PDX modelimizin PCSD1'in donör hastanın kemik metastazının anti-androjen tedavisine direncini yeniden kapladığını gösterdik. Biz anti-androjen direnci daha fazla mekanizmaları karakterize PCSD1 3D organoidler kullanılır. PDX ve PDO modellerinin şu anda yayınlanmış çalışmalarının genel bir görünümünü takiben, optimize edilmiş kültür koşullarında kubbeli veya yüzen bazal membran (örneğin, Matrigel) küreler kullanarak PDO'nun 3B kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz. In vivo dikiş görüntüleme ve histoloji için hücre işleme de açıklanmıştır. Bu protokol batı leke, co-kültür, vb dahil olmak üzere diğer uygulamalar için daha optimize edilebilir ve ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve terapötik ile ilgili 3D kültürlü PDO özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir.
Introduction
Üç boyutlu kültürlü organoidler in vivo mimarisi, hücresel işlevsellik ve orijinal dokularının genetik imza sını yeniden özetleme potansiyelleri için dikkatçekti1 ler 1,2,3,4,5. En önemlisi, hasta tümör dokularından veya hasta türetilmiş ksenogreft (PDX) modellerinden kurulan 3D organoidler, tümörigenez üzerine hücresel sinyalizasyon mekanizmalarını anlamak ve ilaç tedavisinin her hücre popülasyonu6,7,8,9,10,11,12,13üzerindeki etkilerini belirlemek için paha biçilmez fırsatlar sağlar. Drost ve ark.5 üroloji alanında yaygın olarak benimsenen insan ve fare prostat organoidlerinin kurulması için standart bir protokol geliştirmiştir. Buna ek olarak, 3D organoidlerin daha fazla karakterizasyonu ve tümörigenez ve metastaz4,12,14,15ayrıntılı mekanizmaları anlamak için önemli çaba adanmıştır. 3D organoid kültürleri için önceden belirlenmiş ve yaygın olarak kabul görmüş protokole ek olarak, optimize edilmiş kültür koşullarında üç farklı doming yöntemi kullanılarak PDO'nun 3D kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz.
Bu yazıda kemik metastatik prostat kanserinin (BMPC) ex vivo modeli olarak 3Boyutlu organoidler oluşturulmuştur. Bu kültürler için kullanılan hücreler Prostat Kanseri San Diego (PCSD) serisi geldi ve doğrudan hasta prostat kanseri kemik metastatik tümör dokuları (PCSD18 ve PCSD22) veya hasta türetilen ksenogreft (PDX) tümör modelleri (pcsd1, PCSD13 ve PCSD17 adlı örnekler) türetilmiştir. Prostat kanseri hücrelerinin spontan kemik metastazı genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde nadir olduğu için16, biz erkek Rag2 içine insan tümör hücrelerinin doğrudan intra-femoral (IF) enjeksiyonu kullanılan-/-γc-/- fareler kemik metastatik prostat kanseri PDX modelleri kurmak için17.
3D organoidler heterojen hasta tümör hücrelerinden veya türetilmiş ksenogreftlerden oluşturulduktan sonra, prostat tümör hücreleri olarak kimliklerini doğrulamak ve 3D organoid kültürlerde fenotiplerini belirlemek esastır. İmmünofloresan kimyası (IFC) her hücrede protein ekspresyonunun görüntülenmesine izin verir, genellikle belirli hücre popülasyonları için potansiyel işlevleri gösteren2,4. Genel olarak, dokular ve hücreler de dahil olmak üzere örneklerin büyük bir çoğunluğu için IFC protokolleri basit ve tamamen optimize edilebistir. Ancak, hücre yoğunluğu ve organoidlerin sayısı önemli ölçüde konvansiyonel kültürdaha düşük olabilir. Bu nedenle, organoidler için IFC protokolü, numunelerdeki tüm organoidler için parafinin uygun şekilde işlenmesini ve gömülmesini sağlamak için ek adımlar gerektirir. Özellikle organoid örneklerinin hücre yoğunluğunun istenildiğinde nisbeten daha düşük olması durumunda, akderose ön gömme işlemi için ek adımlar ve kesitli organoidlerin yerini slaytta etiketlemek için ipuçları açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, California Üniversitesi San Diego (UCSD) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Kılavuzu'ndaki tavsiyelere sıkı bir şekilde uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB #090401 Onayı UCSD Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) araştırma amaçlı hastalardan cerrahi numune toplamak için alındı. Her hastadan bilgilendirilmiş bir ret alındı ve femurdaki patolojik kırığın ortopedik onarımından cerrahi kemik prostat kanseri metastazı örneği alındı. Hayvan protokolleri California San Diego Üniversitesi (UCSD) hayvan refahı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı protokol #S10298 altında yapıldı. Mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırılmış hasta tümör dokusundan hücreler daha önceaçıklandığıgibi 6-8 haftalık erkek Rag2-/-;γc-/- farelere intra-femorally enjekte edildi. Ksenogreft tümör hacmi in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi ve kaliper ölçümleri ile belirlendi. Tümör büyümesi üzerine 2.0 cm (IACUC tarafından onaylanan maksimal izin verilen boyut), tümör 3D organoidler kurulması için hasat edildi.
NOT: Şekil 1, 3B Organoidler oluşturmak için iş akışını ve deneysel prosedürlerin her adımı için bir protokol numarasını gösterir.
1. Hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör dokularının işlenmesi
NOT: Bu bir ksenogreft fare modeli türetilen bir tümör için organoid kurulması için bir ilk adımdır. Bu protokol Drost ve ark.5 tarafından bir önceki yayından uyarlanmıştır ve medya koşullarını organoid ortama serum takviyesi içerecek şekilde modifiye ettik.
- Aşağıda açıklandığı gibi tümör örneğini işleyin.
- 1-3 mm3 boyutlu parçalara kıyma tümör örnekleri ve oda sıcaklığında 45 dakika hücre dissosyasyon çözeltisi 10 mL ile örnekleri sindirmek.
- Sindirimi sonlandırmak için örneklere 20 mL DMEM komple ortam ekleyin.
- Süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. 70 μm hücresüz üst herhangi bir kalan doku itmek için steril bir piston flanş kullanın.
- Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C'de.
- Hücre peletini taze adDMEM tam ortamile üç kez yıkayın. Yıkama ve yeniden süspansiyon için ortam hacmini Tablo 3'teönerilen ortam hacmiyle eşleştirin. Örneğin, 24 kuyu plaka kültür durumu için yıkama hacmi 500 μL olmalıdır.
NOT: Tablo 3'tegösterildiği gibi protokol farklı kültür koşullarına uygulanabilir. - Trypan mavi boya ve hemositometre kullanarak son hücre sayılarını belirleyin.
- Hücre sayımı nı aldıktan sonra, PBS'de %2 FBS'nin 80 μL'lik hücre pelletini 2 x 106 tümör hücresi başına yeniden askıya alın.
- 2 x 106 tümör hücresi başına 20 μL Fare Hücre Tükenmesi Kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve 2-8 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 2 x 106 tümör hücresi başına PBS tamponunda %2 FBS ile hacmi 500 μL'ye ayarlayın.
NOT: 2,5 mL hücre süspansiyonunda 1 x 107 tümör hücresi bir LS kolonüzerinde işlenebilir. - LS kolonlarını manyetik kolon ayırıcısına yükleyin ve akış tanbirini toplamak için altında bir rafa 15 mL konik bir tüp yerleştirin.
- PBS arabelleğinde her sütunu %2 FBS'nin 3 mL'si ile durulayın. Konik tüpü yıkama akışıyla atın ve yeni, steril 15 mL konik tüple değiştirin.
- Hücre süspansiyonu (1 x 107 tümör hücresinin 2,5 mL'sine kadar) sütunun üzerine ekleyin. Insan tümör hücreleri ile zenginleştirilmiş olacak akış-through toplamak.
- PBS arabelleğinde 1 mL %2 FBS ile kolonu iki kez yıkayın.
NOT: Sütun boşalır boşalır atmaz yıkama adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Ayrıca, hava kabarcıkları oluşturan önlemek için deneyin.
- Aliquot istenilen kültür kurmak için 1,5 mL tüp için hücre süspansiyon uygun hacmi (Tablo 3).
- 1,5 mL'lik tüpü 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
- Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın.
2. Hasta primer tümör dokularının işlenmesi
NOT: Bu organoid kurulması için bir ilk adımdır.
- Hasta primer tümör dokularının işlenmesi için gerekli değildir fare hücresi tükenme süreci dışında adım 1, tüm izleyin.
3. Plaka üzerinde ekli yuvarlak bir kubbe oluşturma
NOT: Bu el yazması, Şekil 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi hücre peleti ve bazmembran (örneğin, Matrigel) karışımından kubbe yapmanın üç yolunu açıklar. 2-4. basamaklarda, hücre ve bazal membran, bazmembranın katılaşmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır.
- 24 kuyu plakası için hücre peletini uygun hacimde (örn. 40°L) yeniden askıya alın(Tablo 3).
- Pipet yukarı ve aşağı yavaşça hücrelerin bodrum zarında iyi askıya emin olmak için.
- Pipet, hücre-bodrum membran karışımının uygun hacmini(Tablo 3)(ve isteğe bağlı 10 μL adDMEM komple ortam) önceden ısıtılmış doku kültür plakasının ortasına yerleştirin.
- Plakayı ters çevirin ve plakayı %5 CO2, 37 °C olarak 15 dakika olarak belirlenen CO2 hücre kültürü kuluçka makinesine hemen ters yerleştirin. Bu, hücrelerin yerleşmesini ve taban zarının katılaşmasını sağlarken plaka nın dibine yapışmasını önler.
- Pipet uygun hacimli(Tablo 3)her kuyuya 10 μM Y-27632 dihidroklorür içeren önceden ısıtılmış ortam.
- Plakayı sağ tarafa CO2 hücre kültürü kuluçka makinesinin içine yerleştirin (%5 CO2, 37 °C).
- Her 3-4 günde bir ortamı değiştirin. 5-7 gün sonra, kültürleri korumak için 10 μM Y-27632 dihidroklorür olmadan kültür ortamı kullanın.
4. Plaka üzerinde ekli yuvarlak bir kubbeden yüzen bir kubbe oluşturma
- Adım 3.7 sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak kubbe ayırmak.
5. Yüzen boncukların oluşturulması
NOT: Bu protokol, bodrum zarı, ortam ve organoidlerin karışımı boncuk gibi göründüğü için yüzen boncuklar olarak adlandırılır.
- Parafin film 2 inç x 4 inç parça kesti.
- Parafin filmini 1000 μL plastik pipet ucu kutusundan boş bir uç tutma rafının divotlarının üstüne yerleştirin.
- Eldivenli bir işaret parmağını kullanarak ancak parafin filmini kırmadan divotları izlemek için parafin filmine hafifçe bastırın.
- Sprey parafin filmi% 70 etanol ile ve en az 30 dakika için hazırlanan parafin film sterilize etmek için hücre kültürü başlık UV lambası açın.
- Hücre ve 20 μL bazal membran karışımı hazırlayın. Tohumlama yoğunluğu kubbe başına 50.000 - 250.000 hücre olabilir.
- Pipet, 1 veya 2.
- Hazırlanan parafin filme divots hücre süspansiyon bodrum membran ve pipet hücre pelet resuspend.
- Katılaşmış boncukları ve parafin filmini 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin. 6 kuyulu bir tabakta bir kuyu 5 boncuk sığabilir.
- Pipet 3-5 mL önceden ısıtılmış ortam içeren 10 μM Y-27632 dihidroklorür her kuyuya parafin filmden boncukları hafifçe fırçalarken.
NOT: Minimum hacim olarak 3 mL önerilir. Kuyu başına maksimum sayıda boncuk (N=5) için 5 mL orta boy tavsiye edilir. - Plakayı bir CO2 kuluçka makinesinin içine yerleştirin (%5 CO2, 37 °C).
- Organoid ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. 5-7 gün sonra, kültürleri korumak için 10 μM Y-27632 dihidroklorür olmadan kültür ortamı kullanın.
6. In vivo organoids görüntü mikroskop kullanarak dikiş8
NOT: Bazı mikroskoplar hücre plakasının dış çevresine (kenar duvar) ulaşamaz; bu nedenle, görüntü dikiş yaparken hücre plakasının çevresine yakın kuyular kullanmanızı öneririz.
- Hücre kültür plakasını keyence mikroskobundaki plaka tutucuya yukarı doğru yerleştirin.
- Merceği hedef kubbenin ortasına yerleştirin.
- Çerçeve lerin sayısını seçerek otomatik dikiş işlemini ayarlayın. Örneğin, toplam 9 görüntü veya 25 görüntü oluşturmak için 3 x 3 veya 5 x 5 seçilebilir.
- Görüntüleme işlemini başlatmak için yakalama düğmesine basın.
- Görüntü görüntüleyici yazılımını açın ve adım 4'e göre alınan bir grup görüntü yükleyin.
- Yüksek çözünürlüklü dikişli görüntü oluşturmak için Resim Dikişi'ni tıklatın.
NOT: Seri 9 veya 25 görüntülerinin yakalanması, hücreleri odaklamak için manuel veya otomatik olarak ayarlanılarak gerçekleştirilebilir.
7. Histoloji için organoid işleme: agarose spin down yöntemi
NOT: Bu protokol Vlachogiannis ve ark.7tarafından bir önceki yayınuyarlanmıştır. Tüm organoid popülasyonlarını başarıyla gömmek için agarose gömmeyi içeren bir adım ekledik.
- Varolan ortamı kuyudan kaldırın. Bodrum membran kubbeleri aspire değil dikkatli olun.
- Hücre geri kazanım çözeltisinin hacmine eşit (adım 1'den çıkarılan ortam hacmine eşit) ekleyin ve 4 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
- Bir pipet kullanarak bodrum membran kubbe sitrenin ve bir pipet ucu kullanarak bodrum membran kubbe ezmek. Ayrıştırılmış kubbe ve hücre kurtarma çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
- Santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika.
- Supernatant (hücre kurtarma çözümü) kaldırın. Organoidlerin varlığı son peletleme adımında doğrulandığında sonuna kadar ayrı tüpler de tüm supernatants kaydedin.
- İstenilen hacim(Tablo 3)soğuk PBS ve hafifçe pipet yukarı ve aşağı mekanik olarak rahatsız pelet ekleyin.
- Santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika.
- Supernatant (PBS) çıkarın.
- Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'nın 24 kuyu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA ile eşleşen hacimdeki peleti düzeltin.
- Fiksasyondan sonra 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj.
- Supernatant (PFA) çıkarın.
- Eşleşen hacimle yıkayın (örn. 24 kuyu plaka kültür koşulundan bir pelet için 500 μL, PBS tablo 3)ve santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika için.
- Hazırlamak sıcak agarose (2% PBS agarose).
NOT: Burada, dondurulmuş kesitler için hücre peletleri, Protokol 7'de başka adımlar olmadan 200 μL OCT bileşiğinde doğrudan yeniden askıya alınabilir. - Agarose'un 200 μL'sinde hücre peletini yeniden askıya alın (PBS'de %2).
- Agarose'u ekledikten hemen sonra, hücre peletini 1 mL şırıngaya bağlı 25 G iğneyi kullanarak 1,5 mL tüpün duvarından yavaşça ayırın. Şekil 3'tegösterildiği gibi, hücre peleti 1,5 mL tüpün duvarından fiziksel olarak ayrılmadıysa, agarose gömme işlemi sırasında hücre peletinin tamamını nveya bir kısmını kaybetme riski vardır.
- PBS%2 agarose tamamen katılaşmış kadar bekleyin.
- 1 mL şırıngaya bağlı 25 G iğne kullanarak katılaşmış agarose bloğunu 1,5 mL tüpten ayırın.
- Hücre peletini içeren müstakil agarose bloğunu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Tüpü %70 EtOH ile doldurun ve doku dehidratasyonu ve parafin katıştırma için geleneksel protokolü kullanarak daha da ilerleyin.
8. Organoidlerin Histolojisi ve İmmünofloresan Sitokimyası (IFC)
- Histoloji veya IFC için slayt(lar)ı seçin.
- Boyama işlemini başlatmadan önce, hücrelerin slaytta nerede olduğunu bulun ve bir işaretçi kullanarak slayttaki hücrelerin etrafına bir daire çizin.
- Slaytın kenarının veya tahtanın etrafındaki çevreyi ve konumlarını kaydetmek için bir laboratuvar not defterinde slaytta dairelerin bulunduğu yeri çizin.
- İstediğiniz boyamayı gerçekleştirin.
NOT: Bu işlem sırasında, düzenli yapıcı kimyasallara karşı dirençli olmadığından işaretli daireler kaybolur. Hatta bazı histoloji kalıcı belirteçleri boyama işlemi sırasında silinebilir. - Boyama işleminden sonra, slayttaki hücrelerin konumlarını bulmak için slaytı çizimin üzerine laboratuvar not defterine yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D organoidler kemik metastatik prostat kanseri (BMPC) modelinden ve doğrudan hasta kemik metastatik prostat kanseri dokusundan elde edilen ksenogreft (PDX) modelinden başarılı bir şekilde saptandı(Şekil 4). Kısaca, BMPC PDX modellerimiz erkek Rag2-/- c-/- farelere tümör hücrelerinin intra-femoral (IF) enjeksiyonu ile oluşturulmuş ve daha sonra PDX tümörleri bu el yazmasında açıklandığı şekilde hasat edilerek işlenmiştir. Şekil 4'tegösterildiği gibi, PCSD serisinden PDX tümör dokuları, bu protokol kullanılarak oluşan kistler, sferoidler ve daha yüksek komplekslik organoidleri olarak kendini gösteren diferansiyel fenotiplere sahip 3Boyutlu organoidler ile sonuçlandı.
25 yüksek çözünürlüklü 10x büyütme görüntüleri dikişli bir görüntü bodrum membran ve organoidlerin bütün bir kubbe gösterdi(Şekil 5). Görüntü analizi yazılımı kullanarak, belirli bir boyuttan daha büyük olan hücreleri veya hücre kümelerini sıralama veya küresel veya kistleri el ile seçme seçeneği vardır.
Organoid kültürlerin agarose katıştırma adımları ve slayt üzerinde kesitli organoidlerin yerini etiketlemek için ipuçları organoidler üzerinde IFC performans başarısını artırmak organoidlerin örnekleri istenilenden daha düşük hücre yoğunluğu na sahip özellikle. Şekil 6, sitokeratin 5 (CK5, bazal epitel hücre belirteci), situmal 8 (CK8, luminal epitel hücre belirteci) ve DAPI'yi hedefleyen organoidlerin 5 μm kalınlığındaparafin bölümünde IFC örneği göstermektedir.
Şekil 1: Hasta tümör dokularından veya hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör dokularından elde edilen 3Boyutlu kültürlü organoidlerin kurulması ve karakterizasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre peletleri ve bazal membran karışımını oluşturan metodolojiler. Ekli bir kubbe(a),yüzen bir kubbe (b) ve yüzen boncuklar (c). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Başarılı agarose gömme için önemli bir adım. Hücre peletini 1,5 mL borunun duvarından ayırma işlemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek hücre, kistler, küresel sferoidler ve daha yüksek komplekslik organoidleri içeren bir dizi PCSD PDX tümöründen organoidlerin diferansiyel fenotipleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Toplam 25 yüksek çözünürlüklü görüntüden ham dikişli görüntü örneği ve hücre sayısını saymak veya hücre/hücre kümelerinin alanını ölçmek için bir takip analizi uygulaması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: CK5 ve CK8 IFC lekeli PCSD1 organoidlerini gösteren görüntü (5 μm parafin kesitkalınlığı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Stok Bileşeni | Son Konsantrasyon | Vol (mL) 500 ml çözelti için gerekli |
| 1000 mM HEPES | 10 mM | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM | 5 |
| 100x Kalem-Strep | 1 x | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tablo 1: adDMEM/F12 +/+/+ Hazırlık. Bu tablo daha önce Drost ve ark.5tarafından yayınlanmıştır.
| Stok Bileşeni | Son Konsantrasyon | Vol (3L) 50 mL çözeltisi için gerekli | Vol (3L) 25 mL çözelti si için gerekli |
| 50x B27 | 50x Seyreltilmiş | 1000 | 500 |
| 500 mM N-Asetilsistein | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0.5 mg/mL EGF | 5 ng/mL | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/mL | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 | %10 şartlı orta | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM | 5 | 2.5 |
| 0.1 mg/mL FGF10 | 10 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 50 μg/mL FGF2 | 5 ng/mL | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M Nikotinamid | 10 mM | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 50 ml'ye kadar getirin | 25 mL'ye kadar getirin | |
| 100 mM Y-27632 Dihidroklorür | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tablo 2: C/S Human Media için bileşenler + %10 FBS. Bu tablo daha önce Drost ve ark.5tarafından yayınlanmıştır.
| Kültür Plakası | Tohumlama Yoğunluğu (hücreler) | İnatzar Hacmi (3L) | Orta (3L) |
| 48 iyi | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 iyi | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 iyi | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tablo 3: Tohumlama yoğunluğu, bazal membran hacmi ve bir kubbe için gerekli orta hacim. Bu tablo Drost ve ark.5tarafından önceki bir yayından değiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hasta kemik metastazı prostat kanseri hücrelerinden elde edilen 3D organoidler hala nispeten nadirdir. Burada, BMPC'nin seri 3D hasta kaynaklı organoidlerini (PDO'ları) başarıyla kurmak için stratejileri ve daha da optimize edilmiş protokolü tanımlıyoruz. Buna ek olarak, IFC ve IHC analizi için daha düşük hücre yoğunluğuna sahip numunelerde organoidlerin güvenliğini sağlamak için protokoller tanımlanmıştır. Kist, sferoidler ve daha karmaşık organoidler şeklindeki diferansiyel fenotipler, bu protokolün hastalarda kinoöz tümör hücre popülasyonlarının hücresel fenotiplerini ve yapılarını korumalarına olanak tanıyan kültür koşulları sağladığını göstermektedir. Böylece, FbS serum takviyesi ile modifiye drost ve ark.5'ten uyarlanan kültür koşullarının, hasta BMPC'den türetilmiş hücrelerin kültürleri için en uygun olduğu gösterilmiştir ki, bu durum özne içi ve özneler arası heterojenliğini (el yazması hazırlık taslağı).
Optimize edilmiş protokolümüz, primer veya PDX tümör dokularından 3D organoid kültürleri kurmak için sınırlı başlangıç materyalinden birden fazla uç nokta içeren deneysel bir kurulum için pratiktir. Genel olarak, hasta primer tümör dokularından 3D organoidlerin kurulması, PDX tümör dokularından 3D organoidlerin kurulmasından daha az başarılıdır. Bu nedenle, pdx tümörlerden daha hasta primer tümör dokularından 3D organoidler kurulması için hücrelerin daha yüksek tohumlama yoğunluğu (en fazla dört kat daha yüksek) olması tavsiye edilir. Tümör doku işleme sırasında hücre verimini artırmak için bir yöntem tekrar süzgeç yoluyla filtrelenmiş hücre süspansiyon geçirerek 70 μm hücre süzgeci üstünde kalan herhangi bir tümör dokusu kurtarmaktır.
3D organoid kültürü oluşturmak için üç farklı yöntem(Şekil 2)kullanılabilir ve takip uç nokta analizine bağlı olarak kolayca uyarlanabilir. Örneğin, 3D organoidler kurduktan sonra dikişli görüntülere sahip olmak isteniyorsa, görüntü dikiş işlemi istenen sayıda görüntü elde etmek için mikroskobik hedefin seri bir hareketini gerektirdiğinden (9 veya 25) ekli bir kubbe şiddetle tavsiye edilir. Bu süreç hücre kültürü plaka sahibi ne ince bir titreşim ile sonuçlanır. Yüzen kubbenin her iki türü de görüntüyü edinirken titreşim nedeniyle serbestçe hareket edecektir. Buna ek olarak, yüzen kubbeler her iki tür kolayca bir kuyudan diğerine transfer edilebilir, onları ayrı kuyularda 3D organoid kültürler ve yapışık hücreler kurduktan sonra yapışık hücreler ile co-kültür için uygun hale. Bağlı olan kubbe ve yüzen kubbenin organoidleri 10 haftaya kadar koruduğu gösterilmiştir. İlginçtir, yüzen boncuk yöntemi yüzen bir kubbe kadar 4 ay boyunca organoidler korumak için gösterilmiştir. Bizim protokol tanıtılan bodrum membran küreler üretmek için yüzen boncuk yöntemi daha fazla adım ve beceri içerir ama uzun vadeli bir kültür için düşünülebilir. Buna paralel olarak, farklı tümör ve metastazdan 3Boyutlu organoidlerin kurulmasında kullanılmasına rağmen, organoidoluşumunda doming yönteminin rolü ve bazal membran şekli derinlemesine belirlenmemiştir. Bu anlamda, parafin film yöntemi diğer iki yöntem başarısız olduğunda kullanım için düşünülebilir.
Her üç farklı yöntem için de bu protokol, kubbelerin kültürde daha uzun süre dayanması nedeniyle, yeniden süspansiyon işlemi için daha düşük hacimli ortam ve daha yüksek hacimli bir asma membran kullanılmasını önerir. Bir kubbe medya ve bodrum membran 1:4 oranı ile oluşur. Dikkat, bu yöntem, ortam eklenen hacmi bodrum membran viskozitesini atlatmak olmadığı için hücre süspansiyon yukarı ve aşağı pipetleme sırasında kabarcıkların oluşumunu artırır. Bu nedenle, 1,5 mL tüpte birkaç kubbe için bir hücre peleti yerine her kubbede bir hücre peleti olacak şekilde 1,5 mL tüpler inpiz olması önerilir. Bunu yaparken, bir kubbe için bir tüp içinde kabarcıklar oluşumu seri diğer kubbeler etkilemez. Kültür durumunun süresi daha önce optimize edilmiş ve kısa olduğu biliniyorsa (bir aya kadar), bodrum zarının viskozite sorununu atlatmak için bodrum zarı daha fazla seyreltilebilir. Birkaç kuyu için bir hücre pelet resuspension hücre kaybı ve değişkenliği en aza indirmek için bodrum membran istenilen hacimde medya daha yüksek bir hacim kullanılarak, bir tüp içinde hazırlanabilir.
Pipetleme işlemi sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirmek için, pipet hücrelerin gerçek hacmi daha düşük bir hacim, medya ve bazal membran karışımı. Örneğin, 24 kuyu plakası içindeki bir kubbe için, 40 μL'lik bazal membran ve 10 μL'ye kadar adDMEM komple ortam hücre peleti ile karıştırılır. Bu durumda, pipet kabarcık oluşumunu en aza indirmek için yukarı ve aşağı boru çekerken 50°L yerine 40 μL'lik bir hacimde işlenecek şekilde ayarlanabilir. Bu ikinci yöntem için, hücre kaybı ve değişkenliği en aza indirmek için birkaç kuyu için hücre pelet resuspension tek bir tüp içinde hazırlanabilir. Ticari olarak mevcut olan bazal membranın sıvı durumu genellikle değişkendir. Bu nedenle, bodrum membran yeni toplu doming süreci için test edilmesi gerekir. Eğer bazal membran normalden daha viskoz ise, hücre peleti ve bazal membran karışımını seyreltmek için ilave 10 μL'ye kadar adDMEM komple ortam (adım 1'de yazılı ayrıntılar) eklenebilir.
Burada, istenilen prosedürlerin başarıyla tamamlanması için ayrıntılı ipuçları ile 3D organoid kültürlü kurmak, görüntü ve süreç için bir protokol sıyoruz. El yazmamızda tanıtılan 3D organoidler için kültür medyası özellikle prostat kaynaklı hücreler içindir. Ancak, protokolümüzde açıklanan diğer ayrıntılar farklı tümör dokuları ve metastatik bölgeler için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sanghee Lee ve Christina A.M. Jamieson JoVE Methods Collection'ın konuk editörleridir.
Acknowledgments
Bu çalışma Leo ve Anne Albert Charitable Vakfı ve JM Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz California Üniversitesi San Diego Moores Kanser Merkezi üyeleri, Dr Jing Yang ve Dr Kay T. Yeung bize teknik uzmanlık için mikrotom ve Randall Fransızca, Cerrahi Bölümü kullanımı izin için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
