Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو تشكيل الفرق من المحركات الجزيئية علي الحمض النووي النانو اوريغامي ومراقبه الحركة الفرقة باستخدام المجهر الداخلي انعكاس الكلي.
Abstract
المحركات cytoskeletal هي المسؤولة عن مجموعه واسعه من الوظائف في الخلايا النواة ، بما في ذلك الانقسام ، ونقل البضائع ، والحركية الخلوية ، وغيرها. العديد من هذه الوظائف تتطلب المحركات للعمل في الفرق. علي الرغم من ثروة من المعرفة حول أليات المحركات خلوي الفردية ، نسبيا اقل من المعروف عن أليات والسلوكيات الناشئة من الفرق الحركية ، والامثله التي تشمل التغييرات علي الفرقة processivity والسرعة مع تغيير عدد المحركات والموقع والتكوين. الهيكلية الحمض النووي التكنولوجيا النانويه ، وتقنيه محدده من اوريغامي الحمض النووي ، وتمكن من البناء الجزيئي لابنيه محدده جيدا من الفرق الحركية. يمكن السيطرة علي شكل هياكل البضائع وكذلك نوع وعدد ووضع المحركات علي الهيكل. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولات مفصله لإنتاج هذه الفرق ومراقبتها باستخدام مجموع المجهر الداخلي التفكير المجهري. علي الرغم من ان هذه التقنيات قد تم تطبيقها علي وجه التحديد للمحركات خلوي ، وأساليب قابله للتعميم إلى البروتينات الأخرى التي تجمع في المجمعات لإنجاز مهامهم. وعموما ، فان طريقه اوريغامي الحمض النووي لخلق الفرق المحددة جيدا من البروتينات الحركية يوفر أداه قويه لتشريح أليات التي تؤدي إلى سلوك متحرك الناشئة.
Introduction
Dynein و كينيسن هي بروتينات المحرك خلوي المسؤولة عن وظائف لا تعد ولا تحصي في الخلايا حقيقية النواة1. عن طريق تحويل الطاقة الكيميائية من التحلل ATP في العمل الإنتاجي ، وهذه المحركات translocate علي الأنابيب الدقيقة لسحب وتوزيع الشحنات داخل الخلايا المختلفة. كما انها تنسق في الترتيبات الضخمة داخل الخلايا المرتبطة بالانقسام ، حيث تظهر القوي المدبرة التي تسهم في تحديد المواقع وفصل الكروموسومات. وقد كشفت الفحوصات الهيكلية والبيوكيميائية والبيوفيزيائية ، بما في ذلك ملاحظات جزيء واحد ، أليات هذه المحركات علي المستوي الفردي (المراجعة الجيدة في الاعمال السابقة2،3،4). ومع ذلك ، فان العديد من مهام المحركات تتطلب منهم العمل في فرق صغيره من أنواع المحركات المتشابهة والمختلطة. نسبيا اقل فهمت حول اليه ان ينسق النشاط وحركيه طارئه مطلقه من هذا فرق5,6. وتعزي هذه الفجوة المعرفية ، جزئيا ، إلى صعوبة إنشاء الفرق ذات الميزات القابلة للتحكم ، مثل نوع المحرك ورقم النسخة. علي مدي العقد الماضي ، تم استخدام تقنيات البناء الجزيئية من اوريغامي الحمض النووي لحل هذه المشكلة. للمحركات القائمة علي ميكروتثبول ، وتشمل بعض الامثله علي هذه التحقيقات ملاحظات جزيء واحد من الفرق من dynein سيتوبلاسميك-17،8،9، داخل الشركات11، مختلفه [كينسن] محركات12,13, وخلطاء من كلا [ديينس] و [كينينس]7,14,15. هنا ، ونحن نقدم تفاصيل عن تنقيه والتسميات قله الكرياتالسبعمن المحركات من الخميرة 7،16،17،18،19،20، و للطي وتنقيه اوريغامي الحمض النووي مجزاه مع الامتثال انضباطي8، والتصوير من المحركات الخميرة دفع هياكل الشاسيه7،18.
بناء السيارات الفرق لرصد جزيء واحد في المختبر يتطلب ثلاثه جهود أساسيه. الأول هو التعبير ، وتنقيه ووضع العلامات من السيارات بنيات مناسبه لربط إلى اوريغامي الحمض النووي. والثاني هو إنتاج وتنقيه الهياكل المحددة اوريغامي الحمض النووي (تسمي في كثير من الأحيان "الشاسيه"). والثالث هو اقتران المحركات بهيكل الشاسيه متبوعا بالملاحظة باستخدام المجهر الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF). هنا ، ونحن نقدم البروتوكولات المعمول بها لهذه العملية للمحركات المؤتلف المستندة إلى ميكروتوبولي المنقية من الخميرة ساكاروميسز سيريفيسياي7،16،17،18، 19. وقد تم التحقيق في الفرق المحركات القائمة علي الحمض النووي اوريغامي باستخدام كل من المؤتلف كينيسن15 و dynein7,8,18 يبني في هذا النظام التعبير الخميرة16 و17و18و19. هذا البروتوكول هو صالح لهذه الثوابت ، بالنظر إلى ان يتم التحكم بها من قبل المروج المستحثة الغالاكتوز ، وتنصهر في نفس علامات البروتين لتنقيه (ZZ و tev الانزيم البروتيني رابط) والاقتران الحمض النووي اليغو (snaptag).
سلالات الخميرة محدده تنتج بنيات المحرك محدده. علي سبيل المثال ، تم تنقيه dynein المستخدمة لدراسة دور الامتثال البضائع من سلاله RPY10847،8. وبصفه عامه ، يمكن طلب السلالات التي تحتوي علي ثوابت حركيه مع التعديلات الجينية المناسبة للتعبير والتنقية من المختبرات التي نشرت استخدام تلك المحركات. ويمكن اجراء الثوابت ذات السمات الجديدة مثل الطفرات أو العلامات باستخدام التقنيات الوراثية المؤتلفة ، مثل تحويل خلات الليثيوم21 والمجموعات التجارية. وقد نشرت بروتوكولات مفصله لإنشاء بروتينات المحركات المعدلة في الخميرة لدراسات جزيء واحد19. بالاضافه إلى المحركات يجري تنصهر إلى SNAPtag ، والتي تستخدم لتسميه المحركات يجب ان يكون مترافق إلى الركيزة المفاجئة ، البنزيلغوانين (BG) ؛ البروتوكولات المنشورة سابقا تصف تشكيل وتنقيه BG-oligo تستحضر18. وقد استخدمت الاستراتيجية العامة الموصوفة هنا أيضا للمحركات القائمة علي actin (انظر الاعمال السابقة للاطلاع علي الامثله22و23و24) والمحركات المنقية من الكائنات الحية الأخرى وأنظمه التعبير (انظر السابق يعمل لمثل الامثله7،9،10،11،12،13،14).
وتستخدم الأنابيب المجهرية بلمره (MTs) في هذه التجارب في إجراءين مختلفين. MT التقارب تنقيه المحركات الوظيفية يتطلب MTs التي لا توصف مع المجموعات الوظيفية الأخرى ، في حين ان المحرك الفرقة الحركة TIRF الفحص يتطلب MTs المسمية مع البيوتين والفلوماتورس. في جميع الحالات ، يتم تثبيت MTs مع تاكسول لمنع التشبع. يتم استخدام خطوه تنقيه التقارب MT لأزاله اي المحركات غير motile مع تقارب MT عاليه ، كما يمكن لهذه المحركات تغيير الحركة الفرقة إذا مترافق إلى الشاسيه. اثناء هذه العملية ، المحركات النشطة إلغاء ربط MTs والبقاء في الحل ، بينما المحركات ملزمه ضيق تدور في بيليه MT. وهذا يساعد علي ضمان ان جميع المحركات علي الشاسيه هي من السكان النشطين.
وقد استخدمت مجموعه متنوعة من الهياكل اوريغامي الحمض النووي لدراسة الفرق المحركات خلوي. وبما ان الفهم الألى لنقل الفرقة قد زاد ، فقد نمت هياكل اوريغامي الحمض النووي المستخدمة في التجارب في التعقيد. ومن حيث المبدا ، يمكن تكييف اي هيكل لهذا الغرض شريطه تعديله ليشمل مواقع مرفقات الحمض النووي الوحيدة التي تقطعت بها السبل للمحركات والفلوبوريس. تصاميم الشاسيه المحددة والسمات قد تكون مفيده لسبر اسئله معينه حول السلوك الناشئة من الفرق المحركات. علي سبيل المثال ، وقد استخدمت قضبان جامده لتطوير المعرفة التاسيسيه لكيفيه تاثير عدد النسخ يؤثر علي النقل من قبل فرق من dyneins و kinesins7،15،18، وقد استخدمت منصات 2d لدراسة فرقه ميوزين الملاحة من شبكات الاكتين22. وقد استخدمت الهياكل ذات المرونة المتغيرة أو القابلة للتوقد لفهم ادوار الاقتران المرن بين المحركات والتحقيق في كيفيه تاثير التزامن المتدرج علي الحركة8،24. وفي الاونه الاخيره ، يتم استخدام الهياكل الكروية لاكتساب نظره ثاقبه حول كيفيه تاثير القيود الهندسية علي الربط الحركي للمسار علي ديناميات الحركة25.
في هذا البروتوكول ، نحن نقدم خطوات محدده لتجارب الفرقة علي الشاسيه مجزاه مع صلابة متغير. ويشار أحيانا إلى المواقع الملزمة علي الشاسيه باسم "المقابض" ، بينما يطلق علي سلاسل الحمض النووي التكميلية التي تربط هذه المقابض "مضادات المقابض". يتم تحديد عدد من المحركات علي هذه الشاسيه من قبل الشرائح التي تحتوي علي الدبابيس مقبض الموسعة مع التكامل إلى اليغو مضاده للمقبض علي المحركات المسمي اليغو. يسمح استخدام تسلسلات مختلفه من المؤشرات علي أجزاء مختلفه بربط أنواع مختلفه من المحركات بمواقع محدده علي الشاسيه. يتكون الهيكل المفصل هنا من 7 قطع جامده متسلسلة ، يتالف كل منها من 12 من الحمض النووي المزدوج الذي يتم ترتيبه في حلقتين من الحلقتين المتمركزتين8. الأجزاء جامده تحتوي علي مقابض المحركات وترتبط من خلال المناطق التي يمكن ان تكون مرنه اما الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل أو جامده مزدوجة تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، اعتمادا علي غياب أو وجود ، علي التوالي ، من المواد الغذائية "رابط". التالي فان الامتثال للهيكل هيكل يتحدد من خلال وجود أو غياب هذه "رابط" المواد الغذائية. انظر التقارير السابقة لمزيد من التفاصيل وتسلسل الحمض النووي المحدد8. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام طرق متعددة لتنقيه الشاسيه26. ويرد هنا وصف لطرد التدرج الجلسرين بالنسبة للمناطق المعدلة27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. النمو والتعبير والحصاد من البروتينات الحركية التي تسيطر عليها مروج المستحثة
- باستخدام الخميرة-peptone-سكر العنب (YPD) لوحه الثقافة وعصا التلقيح العقيمة ، والمطلوبة خط سلاله الخميرة المجمدة واحتضان لمده 3-4 يوما في 30 درجه مئوية.
- اليوم الأول من النمو الثقافي: في فتره ما بعد الظهر ، أضافه 10 مل من وسائل الاعلام الثقافة يب مع 2 ٪ سكر العنب إلى 1 "قطر الزجاج أنبوب ثقافة وتطعيمه مع مستعمره واحده من لوحه. تنمو في طبل بكره الدورية بسرعة في 30 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- اليوم الثاني: في فتره ما بعد الظهر ، نقل 10 مل من الثقافة إلى قارورة 250 mL التي تحتوي علي 50 mL من وسائل الاعلام الثقافة يب مع 2 ٪ raffinose. احتضان بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية بينما تهتز في 250 دوره في الدقيقة علي شاكر المدارية.
- اليوم الثالث: في فتره ما بعد الظهر ، نقل 60 mL من الثقافة إلى قارورة 3 لتر تحتوي علي 1 لتر من وسائل الاعلام الثقافة يب مع 2 ٪ غالاكتوز. احتضان بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية بينما تهتز في 250 دوره في الدقيقة علي شاكر المدارية.
- اليوم 4: بدءا من منتصف الصباح ، ورصد الكثافة البصرية (OD) من الثقافة في 600 nm كل 2 ح. عندما تكون الثقافة بين 1.5 OD و 2 ، تابع مع الخطوات التالية لحصاد الخلايا. الحصاد خارج هذا النطاق OD قد يقلل من الغلة بسبب انخفاض عدد الخلايا قبل OD 1.5 ، أو الوميض الخلوي وتدهور البروتين فوق OD 2.
- Decant ثقافة الخلية في زجاجات الطرد المركزي وتدور في ~ 6200 x g في 4 درجه مئوية لمده 8 دقيقه. صب قباله ماده طافي وتجاهل.
- أعاده تعليق بيليه الخلية في زجاجه مع المقطر المزدوج H2س (ddh2س).
- تدور الخلايا في ~ 6200 x ز في 4 درجه مئوية لمده 8 دقيقه. صب قباله ماده طافي وتجاهل.
- اعتمادا علي لزوجه بيليه الخلية ، أضافه ما يصل إلى 2 مل من ddH2O لخلق محلول السائل بما فيه الكفاية لوضع الأنابيب.
- باستخدام وحده تحكم ماصه اليه مزوده ماصه 10 مل ، الاستغناء ببطء الطين الخلية في النيتروجين السائل قطره واحده في كل مره. وهذا سوف تنتج الكريات المجمدة من خلايا الخميرة.
- تخزين الخلايا المجمدة في-80 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه لتنقيه.
2. تنقيه البروتينات الحركية من خلايا الخميرة
- تحلل الخلايا واستخراج البروتين القابل للذوبان
- اعداد 1 مل من محلول جديد من 0.1 M PMSF في الايثانول النقي. انتظر لأضافه PMSF إلى المخازن المؤقتة المائية لأنها غير مستقره في الماء. أيضا ، تجنب التعرض للماء حتى في غضون 20 دقيقه (نصف العمر التقريبي لل PMSF في الماء) من الاستخدام.
- اعداد 50 مل من المخزن المؤقت تحلل 4x علي الجليد مع المكملات الغذائية من المخزون 5x من المخزن المؤقت تحلل ، ولكن لا تقم باضافه PMSF حتى قبل ان يتم تطبيق المخزن المؤقت علي بيليه الخميرة.
- طحن السائل النيتروجين المجمدة الكريات الخميرة إلى مسحوق ناعم مع طاحونة القهوة من نوع شفره التي تم تبريدها مسبقا مع النيتروجين السائل.
ملاحظه: هذا الاستخراج البروتين يبدا عاده مع بيليه الخلية التي تحصد من 2 لتر من ثقافة الخميرة. ويمكن تعديل كميه البداية من ثقافة الخميرة صعودا أو هبوطا مع تعديلات تتناسب مع احجام الخرز مفتش والحمض النووي اوليجوس في الخطوات 2-2-2 و 2-3-1 أدناه. - Aliquot 15 مل من المخزن المؤقت تحلل 4x مع DTT و Mg-ATP علي الجليد وأضافه PMSF إلى العازلة لتحقيق التركيز النهائي من 2 ملم ، واستكمال اعداد المخزن المؤقت تحلل 4x مع المكملات الغذائية.
- جمع مسحوق الخميرة إلى ما قبل المبردة ~ 100 mL كوب زجاج الكاس علي الجليد. أضافه وحده تخزين صغيره من المخزن المؤقت تحلل 4x مع المكملات الغذائية في مسحوق بحيث لا يتجاوز التركيز النهائي للمخزن المؤقت 1x. عاده ، أضافه ~ 1.5 mL من العازلة لكل 10 مل من مسحوق الخميرة.
- بسرعة ذوبان المسحوق إلى المرحلة السائلة عن طريق وضع الكاس في 37 درجه مئوية حمام المياه مع التحريك المستمر باستخدام ملعقة.
- وضع الكاس من محلله مره أخرى علي الجليد مباشره بعد الذوبان ، وتقدير حجم محلله باستخدام أنبوب مخروطي 50 mL ، وأضافه أكثر 4x تحلل العازلة مع المكملات الغذائية بحيث التركيز النهائي للمخزن المؤقت هو ~ 1x. عاده ، 2 لتر من ثقافة الخميرة غله ما مجموعه 25-35 مل من محلله التي تحتوي علي 1x تحلل العازلة.
- توزيع بالتساوي محلله إلى زجاجات الطرد المركزي علي الجليد. توازن بعناية الزجاجات إلى فرق كتله لا يزيد عن 0.01 g بين كل زوج ، وضمان ان كل زجاجه فوق الحد الأدنى لحجم المطلوبة لمنع انهيار زجاجه. الطرد المركزي في ~ 290,000 x g لمده 25 دقيقه في 4 ° c.
- جمع ماده طافي التي تحتوي علي البروتينات القابلة للذوبان في أنبوب مخروطي 50 mL علي الجليد ، وتجاهل بيليه التي تحتوي علي الحطام الخلية والأرغن الكبيرة. تجنب جمع اي أجزاء غائمة من supernatant ، كما انها يمكن ان تسد عمود تدفق الجاذبية المستخدمة في الخطوات اللاحقة. حفظ 10 μl من ماده طافي لتحليل SDS-PAGE.
- مفتش التقارب تنقيه
- اثناء الدوران أعلاه ، قم باعداد عمود لوني لتدفق الجاذبية علي الجليد أو في غرفه بارده.
- نقل 200 μL من 50 ٪ الطين التقارب حبه الوحل إلى العمود باستخدام طرف ماصه P-1000 قطع مع شفره الحلاقة لتكبير قطر ميناء دخولها. إذا تنقيه أكثر أو اقل من 2 لتر من الخلايا الثقافة بيليه ، وضبط حجم الطين حبه تناسبيا ، مع حجم الحد الأدنى من 100 μL.
- Aliquot آخر 15 مل من المخزن المؤقت تحلل 4x مع DTT و Mg-ATP وأضافه PMSF إلى العازلة لتحقيق تركيز نهائي من 2mM. تمييع العازلة 4x علي الجليد إلى 1x عن طريق أضافه ddH2O.
- غسل الخرز 2x مع 5 مل من 1x تحلل العازلة مع المكملات الغذائية.
- أعاده تعليق الخرز في 200 μL من 1x المخزن المؤقت تحلل مع المكملات الغذائية.
- أضافه تعليق حبه إلى استخراج البروتين التي تم الحصول عليها من طرد واحتضان الخليط في 4 درجه مئوية ل 1 ح مع دوران لطيف.
- اثناء الحضانة ، واعداد 25 مل من العازلة غسل (وصفه مفصله في الجدول 1) علي الجليد و 50 ml من 1x العازلة tev (وصفه مفصله في الجدول 1) علي الجليد.
- بعد الحضانة 1 ح ، وتصفيه الخليط lysate حبه علي الجليد أو في غرفه بارده من خلال نفس العمود اللوني المستخدمة في الخطوة 2-2-2 أعلاه. حفظ 10 μL من التدفق من خلال تحليل SDS-PAGE.
- غسل الخرز المتبقية المحرك علي الجليد 2x مع 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل. حفظ 10 μL من الغسيل الأول لتحليل SDS-PAGE.
- غسل الخرز علي الجليد مره واحده مع 5 مل من 1x العازلة TEV. السماح للمخزن المؤقت بالاستنزاف الكامل من العمود.
- وضع العلامات مع الحمض النووي قله الكريات والانقسام TEV
- أزاله العمود اللوني من الاعداد وغطاء أسفل العمود. داخل نفس العمود ، احتضان الخرز الحركي مع 100 μL من 1x العازلة TEV التي تحتوي علي 10-20 μM من BG-oligo المنقي في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 10-15 دقيقه. إذا تنقيه أكثر أو اقل من 2 لتر من الخلايا الثقافة بيليه ، وضبط حجم 1x العازلة TEV وتنقيه BG-oligos نسبيا. زيادة وقت الحضانة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة إذا لزم الأمر لزيادة الغلة ومعدل وسم المحركات ، ولكن يجب ان تدرك ان أوقات الحضانة أطول قد تزيد أيضا من نسبه المحركات المعطلة بسبب المسخ البروتين في RT.
- أعاده تعليق الخرز برفق كل دقيقه من الحضانة.
- غسل المسمي المحرك الخرز 4x مع 4 مل من 1x العازلة TEV باستخدام نفس العمود اللوني والاعداد كما كان من قبل. السماح للغسيل النهائي لاستنزاف تماما من العمود.
- كاب الجزء السفلي من العمود ، وأعاده تعليق المحرك الخرز في اي أكثر من 200 μL من 1x العازلة TEV ، ونقل إلى 2 مل الجولة السفلي أنبوب الطرد المركزي.
- احتضان التعليق مع ~ 0.3 وحدات من الانزيم البروتيني TEV لكل μL من خليط المحركات حبه في 16 درجه مئوية ل 1 ح مع تناوب لطيف. وينبغي تركيب أنبوب وذلك للتقليل من المساحة الاجماليه للأنبوب التي تاتي الخرز في الاتصال.
- الطرد المركزي أنبوب في ميكروطارد المركزية في 21,130 x g ل 30 s في غرفه بارده لتركيز الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب.
- لا يزال في الغرفة الباردة ، واستخدام قطعه 1000 الماصة غيض لنقل الخليط إلى عمود تدور والطرد المركزي في 21,130 x ز ل 30 ق. جمع الترشيح التي تحتوي علي tev-كليفيد ، والمحركات المنقية. وسوف يكون الانزيم البروتيني TEV في الترشيح وكذلك المحركات.
- حفظ 10 μL من الترشيح لتحليل SDS-PAGE. Aliquot الترشيح المتبقية في احجام من 2 μL ل TIRF التجارب أو 50 μL لتنقيه تقارب ميكروتوبولي. فلاش تجميد قسامات في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية.
- أعاده تعليق الخرز المتبقي في عامل التصفية في المخزن المؤقت TEV 1x لتحليل SDS-PAGE. استخدام نفس وحده التخزين من 1x المخزن المؤقت TEV كما هو الحال في الخطوة 3 أعلاه.
3. بوليتوبولي (MT) البلمره
-
اعداد الأنابيب يمزج لاختبارات TIRF
- في غرفه بارده ، تذوب بشكل منفصل الأنابيب المجففة بالتجميد من كل نوع (أنابيب الأبقار غير المسمية ، الأنابيب الحيوية ، والأنابيب الفلورية) في المخزن المؤقت لأعاده التشكيل (وصفه مفصله في الجدول 2) لجعل التركيز النهائي من 10 ملغ/مل. دعوانا نجلس علي الجليد لمده 10 دقيقه.
- اخلط المكونات التالية ودع الجلوس علي الجليد لمده 10 دقائق في غرفه التبريد (يشار إلى التركيزات النهائية بشكل قبلي): 18 μL من أنابيب الأبقار (~ 8.2 ملغم/مل) ، 2 μL من الأنابيب الحيوية (~ 0.9 ملغم/مل) ، و 2 μL من ال0.9 أنابيب الفلورية
- اعداد 3 μl القسامات من الخليط الأنابيب وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. تخزين الخلائط في-80 درجه مئوية.
- في غرفه بارده ، تذوب بشكل منفصل الأنابيب المجففة بالتجميد من كل نوع (أنابيب الأبقار غير المسمية ، الأنابيب الحيوية ، والأنابيب الفلورية) في المخزن المؤقت لأعاده التشكيل (وصفه مفصله في الجدول 2) لجعل التركيز النهائي من 10 ملغ/مل. دعوانا نجلس علي الجليد لمده 10 دقيقه.
-
اعداد أنابيب لتنقيه تقارب MT من المحركات
- في غرفه بارده ، حل الأنابيب البقري المجفف بالتجميد في العازلة أعاده تشكيل لجعل التركيز النهائي من 10 ملغ/مل. دعوانا نجلس علي الجليد لمده 10 دقيقه.
- اعداد 3 μl القسامات من الخليط الأنابيب وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. تخزين الخلائط في-80 درجه مئوية.
-
البلمره من الأنابيب إلى MTs
- أزاله 3 μl قسامه من الأنابيب من-80 درجه مئوية الفريزر وبسرعة كبيره وذوبان لفتره وجيزة إلى المرحلة السائلة من خلال عقد الجزء السفلي من الأنبوب. وضع علي الفور علي الجليد واحتضان لمده 3 دقائق علي الأقل.
- طبقه برفق 3 μL من 2x البلمره مزيج (وصفه مفصله في الجدول 2) علي راس حل الأنابيب. اخلطه عن طريق تحريك الأنبوب برفق ، ولكن لا تخلطه بالأنابيب ، حيث قد تؤدي قوي القص إلى تعطيل النواة المترية والاستطالة.
- احتضان الخليط في حمام مائي في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
- طبقه بلطف 6 μL من RT 1x BRB80 مع المكملات الغذائية (وصفه مفصله في الجدول 2) علي راس وتخلط بالوخز. لا تخلط بالأنابيب.
- احتضان الخليط عند 37 درجه مئوية لمده 10 دقائق علي الأقل.
- المضي قدما إلى تنقيه التقارب MT ، أو إذا كان القيام اختبارات TIRF ، احتضان MTs في الظلام في RT بين عشيه وضحيها لتشكيل أطول MTs.
- تخزين بلمره MTs لأسابيع في الظلام في RT.
4. الميكروتوبولي (MT) تنقيه التقارب
-
أزاله الأنابيب أونبوليميريزيد بواسطة طرد
- مزيج المكونات التالية لجعل 60 ٪ وساده الجلسرين: 1x BRB80 (بدون ملاحق ؛ وصفه مفصله في الجدول 2) ، 20 ΜM تاكسول (المذاب في dmso) ، 1 مم dtt ، و 60 ٪ الجلسرين.
- نقل 60 μl من وساده الجلسرين إلى أنبوب اولتراسينتريفوجي. طبقه بلطف 12 μL من MTs بلمره المسمي سابقا علي راس وساده. لمنع قص MTs ، نقلها باستخدام طرف ماصه قطع.
- الطرد المركزي الخليط في ~ 97,300 x g في 22 درجه مئوية لمده 15 دقيقه. بعد الدوران ، تبقي الأنابيب الزائدة في الطبقة السائلة العليا ، في حين ان MTs تشكل بيليه في الجزء السفلي. وضع علامة علي الحافة الخارجية للأنبوب قبل تدور للمساعدة في تحديد موقع بيليه ، كما بيليه قد لا تكون مرئية مع العين المجردة.
- أزاله الطبقة السائلة بعناية (~ 12 μL) فوق وساده الجلسرين وحفظ 10 μL لتحليل SDS-PAGE.
- شطف برفق واجهه بين طبقه السائل ووسادة مع 20 μL من 1x BRB80 مع المكملات الغذائية. أزاله وتجاهل 20 μL شطف.
- بعناية أزاله وساده الجلسرين (~ 60 μL) وحفظ 10 μL لتحليل SDS-PAGE. يجب الحرص علي عدم إزعاج بيليه MT.
- شطف برفق بيليه مع 60 μL من 1x BRB80 مع المكملات الغذائية (وصفه مفصله في الجدول 2). يجب الحرص علي عدم إزعاج بيليه MT. تخلص من محلول الشطف.
- أعاده تعليق بيليه MT في 24 μL من Taxol-تكمله تحلل العازلة (وصفه مفصله في الجدول 3) باستخدام طرف ماصه قطع.
-
تنقيه المحركات الوظيفية بواسطة اللوني التقارب القائم علي MT
- أزاله 2 50 μL من المحركات المنقية من الخميرة من-80C الفريزر وذوبان بسرعة إلى المرحلة السائلة. وضع علي الفور علي الجليد.
- أضافه المكونات التالية إلى أنبوب جديد اولتراسينتريفوجي في الترتيب المشار اليه واحتضان الخليط في RT لمده 10 دقيقه: (1) 100 μl من المحركات تنقيه من الخميرة ، (2) 29 μl من 5x ATP/taxol ميكس (وصفه مفصله في الجدول 3) ، ثم (3) 12 μl من المنقي MTs تران سفيريد مع طرف ماصه قطع.
- الطرد المركزي الخليط في ~ 97,300 x g و 22 درجه مئوية لمده 15 دقيقه. بعد تدور ، والمحركات الوظيفية تبقي في supernatant ، و MTs تشكل بيليه ، جنبا إلى جنب مع المحركات غير وظيفية ملزمه لهم.
- جمع supernatant ، فلاش تجميد في aliquots 2 μL ، وتخزين في-80 درجه مئوية.
- حفظ 10 μl من ماده طافي لتحليل SDS-PAGE. أعاده تعليق بيليه في 141 μL من 1x BRB80 لتحليل SDS-PAGE ، أيضا. استخدام معايير البروتين ، مثل actin ، لخلق منحني قياسي لقياس تركيز المحركات المنقية كما هو موضح سابقا17.
- استخدم معلومات التركيز هذه عند اقتران المحركات بالشاسيه في الخطوة 6.1.3.
5. إنتاج هيكل اوريغامي الحمض النووي مجزاه
-
تشكيل الشاسيه
- تامر الاساسيه قله عدد الكريات المذكورة في الجداول المنشورة سابقا8 في 96 لوحات جيدا الرطب في 250 Μm في تريس العازلة ، أو الجافة ومن ثم أعاده التعليق عليها إلى 250 μm مع العازلة تريس.
- إنشاء تجمع من المواد الغذائية الاساسيه عن طريق خلط 5 μL من كل الاساسيه الرئيسية (انظر الجدول S1 في Driller-Colangelo 20168).
- إنشاء تجمع المواد الغذائية linker عن طريق خلط 5 μL من كل الاساسيه رابط (انظر الجدول الأساسي رابط في 2016 الحفار-Colangelo8).
- إنشاء تجمع من المواد الغذائية الملزمة فلوفيتوري عن طريق خلط 5 μL من كل الاساسيه التعامل مع فلوكوفيري (انظر الجدول التعامل مع فلوكوفيري في الحفار-Colangelo 20168).
- مزيج 50 μL قابله للطي ردود الفعل مع المكونات التالية: 1x العازلة للطي; 100 nM 8064 سقالة; 600 nM الاساسيه تجمع الرئيسية; 600 nM الاساسيه فلوكوفيري تجمع الدبابيس; 9 μM فلوكوفيري حبلا (انظر فلوكوفيري الجدول المضاد للمقبض في الحفار Colangelo 20168) ؛ لكل موقع ربط السيارات ، اما 4.2 μM الموسعة خيوط التعامل أو خيوط 600 nM بدون مقابض حسب الرغبة (انظر المحرك مقبض/المواد الغذائية الجدول antihandle في الحفار-Colangelo 20168) ؛ 600 نانومتر الlinkers كما هو مطلوب8; اضافيه 6 مم MgCl2; والماء.
- اضعاف في الدورية الحرارية باستخدام البرنامج التالي: التسخين السريع إلى 80 درجه مئوية ، والتبريد في زيادات درجه واحده إلى 65 درجه مئوية علي مدي 75 دقيقه ، ثم تبريد اضافيه في الزيادات درجه واحده إلى 30 درجه مئوية علي 17.5 ح.
- فحص جوده قابله للطي علي 2 ٪ هلام الاغاروز in 0.5 x العازلة tbe (انظر الجدول 4 للوصفة) تستكمل مع 11 مم mgcl2 والحمض النووي هلام وصمه عار (انظر جدول المواد). تشغيل هلام في 0.5 x العازلة TBE تستكمل مع 11 مم MgCl2 في 70 V لمده 60-90 دقيقه. تشغيل الهلام في حمام الماء المثلج أو في غرفه بارده لمنع التدفئة المفرطة والمسخ اللاحقة من هياكل الشاسيه.
- صوره الهلام باستخدام الظروف المناسبة للبقع هلام الحمض النووي المستخدمة في الخطوة 5.1.7.
-
تنقيه الشاسيه
- في وقت متاخر من بعد ظهر اليوم قبل تنقيه ، وخلق التدرجات الجلسرين بلطف طبقات 80 μL كل من 45 ٪ ، 40 ٪ ، 35 ٪ ، 30 ٪ ، 25 ٪ ، 20 ٪ ، و 15 ٪ الجلسرين في 1x اوريغامي العازلة للطي في أنبوب الطرد المركزي (انظر الجدول 4 للوصفة). يجب ان تكون الحدود بين الطبقات مرئية قليلا.
- احتضان التدرجات في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- في صباح اليوم التالي ، أضافه 45 ٪ الجلسرين في 1x اوريغامي العازلة للطي إلى حل الشاسيه مطوية إلى تركيز نهائي من 10 ٪ الجلسرين. تخلط برفق وطبقه علي الأعلى من التدرج في أنبوب الطرد المركزي.
- تدور التدرج مع الشاسيه في 243,000 x g ل 130 دقيقه في 4 ° c.
- جمع 50 μL الكسور من الأنبوب في الاتجاه الأعلى إلى الأسفل.
- يلقي 2 ٪ هلام اجبرز في 0.5 x العازلة TBE تستكمل مع 11 مم MgCl2 والحمض النووي هلام وصمه عار.
- تحميل 5 μL من كل كسر علي هلام وتشغيل هلام في 0.5 x العازلة TBE تستكمل مع 11 مم MgCl2 ل 90-120 دقيقه في 70 V. تشغيل الهلام في حمام الماء المثلج أو في غرفه بارده لمنع التدفئة المفرطة والمسخ اللاحقة من هياكل الشاسيه.
- صوره الهلام باستخدام الظروف المناسبة للبقع هلام الحمض النووي المستخدمة في الخطوة 5.2.6.
- حدد الكسور للتجارب المستقبلية التي تظهر هياكل مونواريك مطوية جيدا خاليه من المواد الغذائية غير المدمجة.
- تركيزات كميه من كسور مختاره باستخدام طرق طيفيه مناسبه ، مثل امتصاص الاشعه فوق البنفسجية عند 260 نانومتر. استخدم معلومات التركيز هذه عند اقتران المحركات بالشاسيه في الخطوة 6.1.3.
6. جعل الشرائح الفحص الغرف
- جعل غرفه الفحص الشريحة عن طريق التصاق قطعتين من الشريط علي الوجهين إلى شريحة زجاجيه ووضع كوفيرسليب علي القمه. الغرفة هي المساحة الضيقة المحصورة بين الشرائح الزجاجية والمنزلقة ، محاطه بشريطين من الشرائط. ويوضح الشكل 1 غرفه الفحص.
- عند اعداد الشريحة مع الحلول ، واستخدام ماصه لتدفق اي السوائل في الغرفة من جانب واحد ، واستخدام شريط من ورقه فلتر لجمع تدفق السائل علي الجانب الآخر.
7. موتور--فرقه الحركة TIRF الفحص
- اقتران المحركات بهيكل الحمض النووي
- علي الجليد ، واعداد الطازجة 1 مل كل من DTT-تكمله BRB80 ، Taxol-تكمله تحلل العازلة ، والكازين-Taxol-تكمله تحلل العازلة (وصفات مفصله في الجدول 5). نقل 200 μL من كل المخزن المؤقت إلى أنبوب RT.
- لا يزال علي الجليد ، واستخدام الباردة الكازين-Taxol-تكمله تحلل العازلة لاعداد الطاقة 4x ويمزج الزبال 4x (وصفات مفصله في الجدول 5).
- احتضان 10 μL من ~ 300 nM المحركات المنقية مع 5 μL من ~ 10 نانومتر الحمض النووي الشاسيه علي الجليد لمده 15-30 دقيقه. وقد أظهرت هذه التركيزات من المحركات لتشبع الشاسيه ' السيارات ربط المواقع لهذا الوقت الحضانة.
ملاحظه: الاشغال الحركية ليست 100 ٪ ، من المرجح بسبب المؤشرات المفقودة المقبض في هياكل الشاسيه الفردية8،28. - اثناء الحضانة ، تمييع البيوتين-و فلوروكوفيري-المسمي MTs 100x مع العازلة RT Taxol-تكمله تحلل ، واعداد الراتنج الترشيح هلام المناسبة لحجم الفصل اللوني العمود الاستبعاد باتباع الاجراء المبين أدناه.
- أزاله المحركات الزائدة من اقتران الشاسيه بالموتور بواسطة الفصل اللوني لعمود الاستبعاد
- في أنبوب مخروطي 50 mL ، يغسل 5 مل من هلام الترشيح الراتنج 2x مع 45 mL من ddH2O. لكل غسل ، خلط الراتنج مع الماء في أنبوب مخروطي ، وتدور الخليط في 460 x g لمده 1 دقيقه. تجاهل ماده طافي وحفظ الراتنج.
- غسل الراتنج 2x مع 45 mL من 1x العازلة تحلل (وصفه مفصله في الجدول 5) باستخدام نفس الطريقة الموصوفة أعلاه.
- أعاده تعليق الراتنج غسلها في 1x تحلل العازلة في نسبه 1:1 ، بحيث يصبح الراتنج ~ 50 ٪ الطين في العازلة. يمكن تخزين الراتنج غسلها في 4 درجه مئوية لمده شهر واحد علي الأقل.
- نقل 800 μL من تعليق الراتنج إلى عمود تدور. استنزاف العازلة الزائدة عن طريق تدفق الجاذبية لمده 5 دقائق. أزاله اي المخزن المؤقت المتبقية مع 2 s تدور في 1,000 x g. يجب ان يكون حجم الراتنج النهائي حوالي 350-400 μL.
- تمييع مزيج المحرك والشاسيه مع الكازين-Taxol-تكمله تحلل العازلة إلى حجم النهائي من 50 μL. نقل المزيج المخفف إلى عمود تدور معباه مع الراتنج.
- الطرد المركزي العمود تدور في 1,000 x g ل 6 s (هذا الوقت يشمل التسارع والتباطؤ الوقت). جمع المحركات النقية الشاسيه الاقتران عن طريق حفظ الترشيح وتجاهل العمود الذي يحتفظ المحركات الزائدة.
- اعداد الشرائح للتصوير
- تدفق 13 μL من 1 مغ/مل الزلال المصل البقري بيوتينيلاتيد (البيوتين-جيش الصرب البوسنيين) في غرفه الفحص الشريحة. احتضان لمده 2 دقيقه للسماح ملزمه للجيش الصربي البوسني إلى الزجاج.
- غسل الغرفة 2x مع 20 μL من RT DTT-تكمله BRB80 بواسطة تتدفق في المخزن المؤقت علي جانب واحد من الغرفة وفتل السوائل الزائدة بعيدا عن الجانب الآخر باستخدام شريط من ورقه فلتر.
- تدفق في 20 μL من 0.5 ملغ/مليلتر سترافيدين. احتضان لمده 2 دقيقه للسماح للربط من العقديات إلى البيوتين علي جيش الصرب البوسنيين.
- غسل الغرفة 2x مع 20 μL من المخزن المؤقت تحلل التكميلية RT Taxol.
- تدفق بلطف في 20 μL من MTs المخفف مع طرف ماصه قطع. احتضان لمده 2 دقيقه للسماح ربط بين البيوتين علي MTs و العقديات.
- غسل 2x مع 20 μL من المخزن المؤقت تحلل التكميلية من الكازين-Taxol. احتضان لمده 2 دقيقه للسماح الكازين لتتخلل الغرفة بأكملها.
- تمييع المحركات المنقية-الشاسيه الاقترانات 5x إلى 10x إلى الظروف جزيء واحد (~ 10-100 pM) مع الباردة الكازين-Taxol-تكمله تحلل العازلة. تخلط المكونات التالية معا لإنتاج مزيج المحرك النهائي الشاسيه: 10 μL من تخفيف الشاسيه المحرك ، 5 μL من مزيج الطاقة 4x ، و 5 μL من مزيج الزبال 4x.
- تدفق في 20 μL من المحرك النهائي خليط الشاسيه إلى غرفه الشريحة الفحص والمضي قدما إلى المجهر TIRF.
- التصوير والحصول علي البيانات
- صوره الشريحة فورا مع مجهر TIRF. عاده ، تبقي كل شريحة صالحه للاستعمال لمده تتراوح بين 30 و 60 دقيقه.
- الحصول علي صوره ثابته في قناه MT ، وفيلم في قناه الشاسيه. للمحركات في هذا البروتوكول ، 10 دقيقه أفلام مع معدل اطار 0.5 fps ووقت التعرض من 200 ms المناسبة.
- من فيلم الشاسيه ، وتوليد واحد كيموجراف لكل MT في imagej أو صوره مماثله لمعالجه البرامج29. تحليل السرعات وتشغيل أطوال السيارات الشاسيه الفرق من خلال قياس المنحدرات والمسافات الافقيه من أشواط علي كيموجراف30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكانت التنقيات الناجحة من المحركات وهياكل الشاسيه المدعومة من قبل الكهربائي هلام. وأكد تحليل SDS-PAGE الاستخراج الناجح لل dynein من الخميرة (الشكل 2) ، كما الترشيح النهائي التي تم جمعها في الخطوة 2.3.7 أظهرت واضحة ، والفرقة حاده في موقف ~ 350 كده. كما هو متوقع ، وكان هذا النطاق dynein غائبه من الجريان ويغسل ان أزاله البروتينات غير المرغوب فيها ، والخرز من الذي كان المشقوق dynein. وتشير الملاحظة إلى ان تنقيه التقارب مع مفتش وانقسام الانزيم البروتيني TEV كانت علي حد سواء عاليه الكفاءة. بالاضافه إلى ذلك ، كان الانزيم البروتيني TEV موجودا أيضا في الترشيح النهائي وشكلت فرقه واضحة في ~ 50 كده.
وتم أيضا تاكيد النجاح الذي حققته العملية الناجحة لتنقيه البروتينات من dynein و كينيسن مع تحليل SDS-PAGE (الشكل 3). في حين ظهرت dynein حتى كفرقه واحده واضحة في ~ 350 كده ، وأظهرت كينيسن حتى وتلطيخ قليلا عصابات متعددة في ~ 120 كده ، وربما بسبب وجود كل من اشكال فوسفوريلاتيد والفوسفات من البروتين14 والغلات المتغيرة في oligo--وضع العلامات. وكشفت مقارنه بين عصابات dynein و كينيسن قبل وبعد هذا تنقيه التقارب MT انخفاض في تركيز المحرك ، كما يدل علي ذلك انخفاض في كثافة الفرقة ، والتي كان من المرجح بسبب أزاله المحركات غير وظيفية. وعلي الرغم من الانخفاض ، كانت تركيزات المحركات المحتفظ بها كافيه لاختبارات TIRF الفعالة. بالاضافه إلى الانزيم البروتيني TEV, كميه ملحوظة من الأنابيب (~ 51 كده) كان موجودا في سوبرناتانت النهائي, علي الأرجح بسبب التحلل التدريجي لل MTs اثناء التجربة, أو أزاله غير مكتملة من الأنابيب الزائدة من خلال طرد. ومع ذلك ، فان الحركة الثابتة لفرق الشاسيه الحركية المعروضة في اختبارات TIRF تشير إلى ان الأنابيب والانزيم البروتيني TEV لم تتداخل مع وظائف المحرك (انظر الشكل 6).
وقد هدات للطي هياكل اوريغامي الحمض النووي من قبل الكهربائي هلام الاغاروز. ويصور الشكل 4 نتائج الهلام الذي يحلل طي هيكل مرن مجزا مع موقعين ملزمين للسيارات. ويشير التحول في التنقل بين حبلا سقالة صافيه تكشفت (لين 1) ورد فعل للطي (لين 2) للطي اوريغامي. بالاضافه إلى ذلك ، يشير رد الفعل القابل للطي في Lane 2 إلى وجود بعض البنية المعدنية للهيكل. عاده ما تحدث المعالجة ، وتتطلب التنقية اللاحقة للهياكل الاحاديه المطوية بشكل جيد. المواد الغذائية الزائدة غير المدمجة كانت أيضا مرئية ، وعرض درجه عاليه من التنقل من خلال هلام.
تم تنقيه ردود فعل اوريغامي مطوية لأزاله المواد الغذائية غير المدمجة الزائدة والمولدات من هيكل الشاسيه. الشكل 5 يظهر نتائج تنقيه التدرج الجلسرين من هيكل مرن مع 7 مواقع ملزمه السيارات. الكسور المبكرة تتوافق مع كثافة الجلسرين المنخفضة في الأعلى من الأنبوب. انها تحتوي علي المواد الغذائية الزائدة. الكسور المتاخره تتوافق مع كثافة الجلسرين عاليه في الجزء السفلي من الأنبوب وتحتوي علي المولدات والمجاميع من الهياكل مطوية. في هذا الجل ، يشير الجزء 7 إلى كسر مناسب يحتوي علي هيكل أحادي الطي مطوي بشكل جيد. لاحظ ان الهيكل المطوي بشكل جيد معزول عن كل من المواد الغذائية الزائدة والمولدات. في حين ان هذا الهلام هو ممثل ، وكسر 7 غالبا ما يحتوي علي الشاسيه صالحه للاستعمال ، كل تجربه تنقيه غله نتائج مختلفه قليلا والكسور يجب ان تكون دائما التهاوي لتحديد اي كسر هو الأفضل لاختبارات الحركة.
حركيه السيارات الشاسيه الفرق يمكن اكتشافها بسهوله وقابله للقياس علي kymographs المتولدة من الأفلام TIRF. علي سبيل المثال ، والرسوم البيانية (الشكل 6) من الشاسيه مرنه مترافق إلى سبعه بروتينات dynein ("7d" الفرق) تظهر للغاية بروسيسيفي أشواط في سرعات متسقة نسبيا ، مما يدل علي ان الفرق كانت نشطه و متحرك في النظام المعاد تشكيله ، وان تنقيه التقارب MT أزاله بنجاح معظم الdyneins غير وظيفية ، التي يمكن ان تبطئ أو مماطله الفرق. وقد تم تنفيذ نفس التجربة tirf بنجاح علي أنواع الشاسيه الأخرى مع الامتثال المختلفة وأرقام المحركات للكشف عن اثار هذه العوامل علي dynein العمل الجماعي8,9.
الشكل 1: تخطيط غرفه فحص الشرائح. يجلس المشبك علي قمة شريطين من الشرائط المزدوجة الوجه. الحلول هي الأنابيب في جانب واحد ، واستخراج مع ورقه فلتر من جهة أخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل SDS-صفحه لتنقيه dynein من الخميرة. وكانت خلايا الخميرة تفكيك وطرد لجمع محلله (حاره 1) التي تحتوي علي مجموع البروتينات القابلة للذوبان. تم استغلال التقارب بين مفتش علي حبات العمود والعلامة ZZ علي بناء dynein المؤتلف لهذا تنقيه. تم جمع التدفق من خلال (حاره 2) من خليط محلله والخرز بعد ان مرت من خلال عمود اللوني. تم غسلها الخرز dynein-ملزمه مع المخازن المؤقتة ، وغسل الاولي مع المخزن المؤقت للغسيل (حاره 3) تم جمعها. ثم تمت المترافقة مع dynein إلى oligo الحمض النووي. بعد الانقسام البروتيني TEV ، طرد في عمود تدور فصل الترشيح التي تحتوي علي dynein (حاره 4) والخرز المتبقية (حاره 5). تم تشويه جميع العينات التي تم جمعها من تنقيه مع 1x LDS عينه العازلة و 1x وكيل الحد ، وتحميلها علي 4-12 ٪ Bis-تريس هلام. تم تشغيل هلام في 1x MOPS العازلة في 200 V ل ~ 1 h ، وملطخه مع SYPRO هلام البروتين الأحمر وصمه عار للتصوير تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية. وعلي وجه الخصوص ، فان النطاق الواضح والحاد في ~ 350 كده في حاره 4 يشير إلى وجود dynein المنقي المركزة في الترشيح النهائي ، في حين ان الفرقة في ~ 50 كده في نفس المسار يشير إلى المشاركة في الوجود البروتيني TEV. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل SDS-صفحه لتنقيه تقارب MT من dynein وظيفية والبروتينات كينيسن. تم خلط كينيسين ودينيين تنقيه من الخميرة (الحارات 1 و 3) مع بلمره MTs و ATP ، وأجريت نبذ حلول لفصل المحركات الوظيفية في supernatants (الممرات 2 و 4) من المحركات غير الوظيفية التي تشارك في بيليه مع MTs. عينات المحرك قبل وبعد تنقيه والتحريف مع 1x LDS عينه العازلة و 1x وكيل الحد ، وتحميلها علي 4-12 ٪ Bis-تريس هلام. تم تشغيل هلام في 1x MOPS العازلة في 200 V ل ~ 1 h ، وملطخه مع SYPRO هلام البروتين الأحمر وصمه عار للتصوير تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية. ويبدو ان شده العصابات الحركية (~ 120 كده لأجل kinesin ، و ~ 350 كده ل dynein) تنخفض بعد تنقيه تقارب MT ، مما يشير إلى انخفاض في تركيزات المحركات. وكانت التركيزات الملحوظة للأنابيب والانزيم البروتيني TEV موجودة في عينات المحركات بعد التنقية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل هلام اجبرز من هيكل اوريغامي الحمض النووي مطوية. يتم تقييم الهياكل اوريغامي الحمض النووي مطوية من قبل الكهربائي هلام. Lane 1 هو حبلا السقالة الصافية التي تكشفت في حين ان الممر 2 هو نتاج رد الفعل القابل للطي. تم تشغيل هلام في 70 V في حمام الماء المثلج لمده 90 دقيقه في 0.5 x العازلة TBE تستكمل مع 11 مم MgCl2. ويشير التحول في التنقل إلى طي اوريغامي. وكانت الدبابيس الغير مدمجه والشاسيات مرئية أيضا في Lane 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل هلام اجبرز لتنقيه التدرج الجلسرين من الشاسيه الحمض النووي اوريغامي. يمكن تحديد نوعيه تنقيه التدرج الجلسرين بواسطة الكهربائي هلام من الكسور من الانحدار الطرد المركزي. انخفاض عدد الكسور هي من اعلي الأنبوب وتتوافق مع كثافة منخفضه من الجلسرين. الكسور المرقمة عاليه هي من الجزء السفلي من الأنبوب وتتوافق مع كثافة عاليه من الجلسرين. المواد الغذائية الزائدة ، والشاسيه موحودي ، والشاسيه مولتيمريك كلها مرئية. يحتوي الجزء 7 علي هيكل مناسب لمجهر TIRF لأنها أحاديه والمواد الغذائية الزائدة غائبه. تم تشغيل هلام في 70 V في حمام الماء المثلج لمده 120 دقيقه في 0.5 x العازلة TBE تستكمل مع 11 مم MgCl2. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الرسوم البيانية التي تبين حركيه الفرق في الشاسيه علي MTs واحد. بروتينات dynein المستخرجة من الخميرة وتنقيتها مع MTs تم مترافق إلى هياكل الشاسيه مرنه. وكان لكل هيكل سبعه مواقع ملزمه لdynein وشكلت "7D" الفرقة. تم تسجيل حركه هذه الفرق علي MTs في فيلم 10 دقيقه (200 ms التعرض, 0.5 fps) خلال فحص TIRF. تم إنشاء kymographs من MTs اثنين من هذا الفيلم في ImageJ عن طريق تتبع علي طول MT واحد. القضبان الحمراء العمودية والافقيه في الزاوية اليسرى العليا من كل صوره تشير إلى 2 دقيقه و 20 μm ، علي التوالي. يسجل كل خط ساطع حركه فرقه واحده ، مع معكوس الميل الذي يشير إلى السرعة والازاحه الافقيه التي تشير إلى طول الشوط. مع [تيرف] اختبارات و كيموجرافي, يصبح الحركية من [موتور-فهيكل] فرق بسهوله قابل للكشف ومباشره يمكن قياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | الخطوة (ق) المستخدمة | التعليق |
| 5x تحلل العازلة | 150 mM HEPES (pH 7.4) | - | تصفيه تعقيم المخزن المؤقت. ويمكن تخزينها في RT في حاويه مختومه بشكل صحيح لمده عام. |
| 250 mM KAcetate | |||
| 10 مم MgAcetate | |||
| 5 مم EGTA (pH 7.5) | |||
| 50 ٪ الجلسرين | |||
| 4x تحلل العازلة مع ملاحق | 4x تحلل العازلة | 2.1-2.2 | جعل هذا المخزن المؤقت 4x من المخزن المؤقت تحلل 5x أعلاه. جهز المخزن المؤقت بدون PMSF أولا ، وأضف المركب (المذاب في الايثانول النقي) إلى الحاجز الصغير الخاص بالمخزن المؤقت مباشره قبل كل خطوه تتطلبه. |
| 4 مم DTT | |||
| 0.4 mM Mg-ATP | |||
| 2 مم PMSF | |||
| غسل العازلة | 1x تحلل العازلة مع ملاحق | 2.2 | لجعل المخزن المؤقت ، أضافه KCl ، تريتون X-100 ، و ddH2O إلى المخزن المؤقت تحلل 4x مع Dtt و MG-ATP ، ولكن لا تقم باضافه pmsf حتى الحق قبل الاستخدام. |
| 250 mM KCl | |||
| 0.1% تريتون X-100 | |||
| 5x العازلة TEV | 50 مم تريس-HCl (pH 8.0) | - | تصفيه تعقيم المخزن المؤقت. ويمكن تخزينها في RT في حاويه مختومه بشكل صحيح لمده عام. |
| 150 mM KCl | |||
| 10% الجلسرين | |||
| 1x العازلة TEV | 1x العازلة TEV | 2.2-2.3 | لجعل المخزن المؤقت ، أضافه DTT ، Mg-ATP ، تريتون X-100 ، و ddH2O إلى 5x المخزون tev المخزن المؤقت ، ولكن لا تقم باضافه pmsf حتى الحق قبل الاستخدام. |
| 1 مم DTT | |||
| 0.1 mM Mg-ATP | |||
| 0.1% تريتون X-100 | |||
| 0.5 mM PMSF | |||
الجدول 1: المخازن المؤقتة لتنقيه تقارب مفتش البروتينات الحركية من خلايا الخميرة (القسم 2 من البروتوكول).
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | الخطوة (ق) المستخدمة | التعليق |
| 5x BRB80 | 400 مم أنابيب | - | تصفيه تعقيم المخزن المؤقت. ويمكن تخزينها في RT في حاويه مختومه بشكل صحيح لمده عام. |
| 10 مم MgCl2 | |||
| 5 مم EGTA | |||
| ضبط درجه الحموضة إلى 6.8 مع كوة | |||
| 1x BRB80 مع المكملات الغذائية | 1x BRB80 | 3.3 ال& 4.1-4.2 | يجب ان تكون مصنوعة حديثا من الأسهم 5x BRB80 لكل تجربه. |
| 20 ميكرومتر تاكسول (المذاب في DMSO) | |||
| 1 مم DTT | |||
| 2x البلمره ميكس | 2x BRB80 (بدون ملاحق) | 3.3 | فلاش تجميد المزيج في الارصفه الصغيرة وتخزين في-80 oC. |
| 2 مم DTT | |||
| 2 ملم مغ-GTP | |||
| 20% DMSO | |||
| أعاده تشكيل المخزن المؤقت | 1x BRB80 (بدون ملاحق) | 3.1 | يجب ان تكون طازجه لكل تجربه. |
| 1 مم DTT | |||
| 1 مم مغ-GTP | |||
الجدول 2: المخازن المؤقتة للبلمره المجهرية (الباب 3 من البروتوكول).
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | الخطوة (ق) المستخدمة | التعليق |
| Taxol-تكمله تحلل العازلة | 1x تحلل العازلة | 4.1 | يجب ان تكون طازجه لكل تنقيه. |
| 20 ميكرومتر تاكسول (المذاب في DMSO) | |||
| 1 مم DTT | |||
| 5x ATP/تاكسول ميكس | 1x تحلل العازلة | 4.2 | يجب ان تكون طازجه لكل تنقيه. |
| 25 ملم مغ-ATP | |||
| 50 μM Taxol (المذاب في DMSO) | |||
| 5 مم DTT | |||
الجدول 3: المخازن المؤقتة لتنقيه تقارب البولية المجهرية للبروتينات الحركية الوظيفية (الباب 4 من البروتوكول).
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | الخطوة (ق) المستخدمة | التعليق |
| 20x اوريغامي العازلة للطي | 100 مم تريس الأس الهيدروجيني 8.0 | - | يمكن تخزينها في RT في حاويه مختومه بشكل صحيح لمده تصل إلى سنه. |
| 20 مم أدتا | |||
| 200 mM MgCl2 | |||
| 1x اوريغامي العازلة للطي | 5 مم تريس الأس الهيدروجيني 8.0 | 5.1-5.2 | جعل المخزن المؤقت الطازجة عن طريق تمييع الأسهم 20x مع ddH2س قبل كل تجربه. |
| 1 مم أدتا | |||
| 10 مم MgCl2 | |||
| 0.5 x TBE | 45 مم ثلاثي الفوسفات 8.0 | 5.1-5.2 | يمكن تخزينها في RT في حاويه مختومه بشكل صحيح لمده تصل إلى سنه. |
| 45 mM حمض البوريك | |||
| 1 مم أدتا | |||
الجدول 4: المخازن المؤقتة لإنتاج هيكل اوريغامي الحمض النووي المجزاه (البروتوكول الباب 5).
| اسم المخزن المؤقت | تكوين | الخطوة (ق) المستخدمة | التعليق |
| DTT-تكمله BRB80 | 1x BRB80 | 7.3 | يجب ان تكون طازجه قبل كل تجربه TIRF. |
| 1 مم DTT | |||
| Taxol-تكمله تحلل العازلة | 1x تحلل العازلة | 7.1 & 7.3 | يجب ان تكون طازجه قبل كل تجربه TIRF. |
| 20 ميكرومتر تاكسول (المذاب في DMSO) | |||
| 1 مم DTT | |||
| الكازين-تاكسول-تكمله تحلل العازلة | 1x تحلل العازلة | 7.1-7.3 | يجب ان تكون طازجه قبل كل تجربه TIRF. |
| 20 ميكرومتر تاكسول (المذاب في DMSO) | |||
| 1 مم DTT | |||
| ~ 2.5 ملغ/مل الكازين (المذاب في تريس-HCl في pH 8.0) | |||
| 1x تحلل العازلة | 30 مم HEPES (pH 7.4) | 7.2 | جعل هذا المخزن المؤقت الطازجة عن طريق تمييع الأسهم 5x (وصفه مفصله في الجدول 1) مع ddH2O. |
| 50 mM KAcetate | |||
| 2 مم MgAcetate | |||
| 1 مم EGTA (pH 7.5) | |||
| 10 ٪ الجلسرين | |||
| 4x مزيج الطاقة | 22.5 μL 1x الكازين-تاكسول-سوبليمينفتيد تحلل العازلة | 7.3 | يجب ان تكون طازجه قبل كل تجربه TIRF; وحدات التخزين المشار اليها هي للحجم النهائي من 25 μL. |
| 1 μL 0.1 M Mg-ATP | |||
| 1 μL 40% الجلوكوز | |||
| 0.5 μL β-Mercaptoethanol | |||
| 4x الزبال ميكس | 24 μL 1x الكازين-تاكسول-تكمله تحلل العازلة | 7.3 | يجب ان تكون طازجه قبل كل تجربه TIRF; وحدات التخزين المشار اليها هي للحجم النهائي من 25 μL. |
| 1 μL 1x الأوكسجين الكاسح النظام | |||
الجدول 5: المخازن المؤقتة والخلائط الخاصة بحركية الفرقة الحركية (الباب 7 من البروتوكول). تفاصيل عن نظام الزبال الأوكسجين المستخدمة لجعل ميكس الزبال يمكن العثور عليها في مكان آخر17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات البناء الجزيئية من الحمض النووي اوريغامي توفر وسيله فريدة من نوعها لبناء الفرق الحركية مع البنيات المحددة ، وأرقام المحركات ، وأنواع ، وتمكين الدراسات من كيف تنشا السلوك الناشئة من تكوينات المحرك محدده31. كما تواصل الدراسات الهيكلية والخلوية لتوضيح أمثله من المحركات خلوي العاملة في فرق, تقنيات لعزل والتحقيق في أليات البيوفيزيائية والبيوكيميائية للمحركات في الفرق تنمو في المرافق. علي سبيل المثال ، وقد أظهرت البرد-EM ان dynactin يمكن ان تربط 2 المحركات dynein الفردية ، وان هذه الأزواج لها حركيه مختلفه من المحركات الفردية10. الاضافه إلى ذلك ، تم استخدام البناء المستندة إلى الحمض النووي لتحديد ما إذا كان dynein الثدييات ، عند تفعيلها من قبل dynactin و bicD2 ، يمكن ان تتطابق مع قوه kinesin-1 في سيناريو الساحبة للحرب14. وفي دراسة أخرى مختلطة المحركات ، استخدمت اوريغامي الحمض النووي لفصل اثار المحركات القطبية المعاكسة والبروتينات الملزمة التنظيمية التي تفصلها مكانيا علي هيكل اوريغامي15. كما تم العثور علي المزيد من المحددات الهيكلية والتنظيمية لحركيه, وينبغي ان تكون التقنيات المستندة إلى الحمض النووي اوريغامي مفيده في تحديد المساهمين البيوكيميائية والبيوفيزيائية محدده لحركيه الناشئة من الفرق الحركية. تقنيات البناء الجزيئية التي تتيحها اوريغامي الحمض النووي مفيده بشكل خاص لان النتائج ظواهريه الناشئة من الفرق من الصعب التنبؤ بها. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدد لا يحصي من العوامل التي تسهم في حركيه المحركات الفردية داخل الفرقة5,6,31.
وتشمل الامثله علي هياكلنا السابقة قضبان متجانسة وقضبان مجزاه مع صلابة متغيرة. وتستكشف الجهود الحالية الهياكل الكروية فضلا عن25. وقد استخدم آخرون مورفولوجيات مثل الهياكل المستوه وقضبان22،24. المثل ، باستخدام مقابض السيارات مع متواليات الحمض النووي المتعامد ، يمكن ربط أنواع مختلفه من المحركات إلى هيكل الهيكل نفسه7،14،15،18. هذا النهج يتيح دراسات للإجراءات المتعارضة من dyneins و kinesins ، ناقص-الاضافه إلى نهاية الموجهة kinesins ، وناقص-الاضافه إلى نهاية الموجهة myosins. كما انه يتيح إدخال متحولة بين الفرق البرية من نوع آخر ، مما يسمح للمساهمين البيوكيميائية محدده لحركيه الناشئة لتكون فك رموز7. وبسبب القدرة علي ربط الفلوروبيورس متعددة لكل هيكل الفردية ، والتصوير في TIRF والتحليل اللاحق من قبل كيموجرافي أو تتبع الجسيمات هو ممكن. وتبين التقارير السابقة تحليل البيانات الكيموجرافيه والتقييم الإحصائي لهياكل الشاسيه مع الامتثال المتغير8. في حين أثبتت المحركات خلوي ان يكون التطبيق المبكر مثيره لاستخدام اوريغامي الحمض النووي كلوحه الخبز الجزيئية32، والبروتينات الأخرى ونظم البروتين سوف تستفيد أيضا من هذه الطرق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر ك. تشاو ، ج. مورغان ، و ا. دريلر-كولانجلو للمساهمة في تقنيات الشاسيه المجزاه الحمض النووي اوريغامي. كما نشكر الأعضاء السابقين في مختبرات Reck-بيترسون وشيه علي المناقشات المفيدة والمساهمات في التطوير الأصلي لهذه التقنيات. نشكر j. Wopereis ومركز سميث كليه لمجهر والتصوير و ل. Bierwert ومركز سميث كليه لعلم الاحياء الجزيئية. ونحن نعترف بامتنان برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي NSF للحصول علي المجهر TIRF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
