Summary
该协议的目标是在DNA折纸纳米结构上形成分子马达组合，并使用全内反射荧光显微镜观察整体运动。
Abstract
细胞骨骼马达负责真核细胞的各种功能，包括线粒体、货物运输、细胞运动等。其中许多功能需要电机在组合中运行。尽管对单个细胞骨骼电机的机制有丰富的知识，但相对而言，对电机组合的机制和紧急行为知之甚少，例如，对组合过程和速度的变化。更改电机编号、位置和配置。结构DNA纳米技术，以及DNA折纸的特定技术，使电机组合的清晰结构的分子结构成为可能。货物结构的形状以及电机在结构上的类型、数量和位置都可以控制。在这里，我们提供详细的协议，用于生成这些集合，并使用总的内部反射荧光显微镜观察它们。尽管这些技术已专门应用于细胞骨骼电机，但这些方法可应用于在复合物中组装以完成任务的其他蛋白质。总体而言，DNA折纸法用于创建定义明确的运动蛋白组合，为解剖导致紧急活动性行为的机制提供了强有力的工具。
Introduction
Dynein和激酶是细胞骨骼运动蛋白，在真核细胞1中负责多种功能。通过将ATP水解的化学能转化为生产工作，这些电机在微管上转换，以运输和分配各种细胞内货物。他们还协调与线粒体相关的大规模细胞内重组，其中它们表现出有助于染色体定位和分离的编排力。结构、生化和生物物理检测，包括单分子观察，揭示了这些马达在个体层面的机制（在以前的工程2，3，4）中得到了很好的审查。但是，电机的许多任务要求它们在类似和混合电机类型的小集合中工作。相对而言，对这些合奏团5、6的活动和最终紧急运动机制的理解较少。这种知识差距部分是由于难以创建具有可控功能（如电机类型和拷贝号）的合奏。近十年来，DNA折纸的分子构造技术一直被用来解决这个问题。对于基于微管的电机，这些研究的一些例子包括细胞质dynein-17，8，9，内鞭抗dynein11的单分子观测，各种运动因子电机12，13，和混合的dyneins和激酶7，14，15。在这里，我们提供从酵母7，16，17，18，19，20，电机的纯化和寡核苷酸标签的详细信息。折叠和纯化分段的DNA折纸与可调的符合性8，和酵母马达的成像推动底盘结构7，18。
构建体外单分子观察的电机组合需要三个主要的努力。第一种是适合附着DNA折纸的电机结构的表达、纯化和标记。第二种是生产并纯化已定义的DNA折纸结构（通常称为"底盘"）。第三是电机与底盘结构的结合，然后使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜进行观察。在这里，我们为从酵母糖精7、16、17、18中纯化的重组微管基电机提供既定的协议。19.DNA折纸为基础的运动组合已被研究使用重组运动体15和dynein7，8，18结构产生在这个酵母表达系统16 ，17，18，19.该协议对这些结构有效，因为它们由乳突素诱导启动子控制，并融合到相同的蛋白质标记进行纯化（ZZ和TEV蛋白酶链接器）和DNA寡聚结合（SNAPtag）。
特定的酵母菌株产生特定的运动结构。例如，用于研究货物合规作用的dynein从应变RPY10847，8中纯化。一般来说，含有具有表达和纯化适当基因修饰的电机结构的菌株可以从公布使用这些马达的实验室要求。具有突变或标记等新特性的构造可以使用重组基因技术进行，例如醋酸锂转化21和商业试剂盒。为单分子研究在酵母中制造修饰的马达蛋白的详细方案已经发表于19。除了与 SNAPtag 融合的电机外，用于标记电机的寡聚物必须与 SNAP 基板苯基板（BG）结合使用;先前公布的协议描述了BG-寡聚物18的形成和纯化。此处描述的总体策略也用于基于actin的电机（参见前面的工作示例 22、23、24）和从其他生物体和表达系统纯化的电机（参见前一例作品的例子7，9，10，11，12，13，14。
聚合微管 （MT） 用于两种不同的实验过程。功能电机的 MT 亲和力纯化需要未与其他功能组标记的 MT，而电机组合运动 TIRF 测定要求标有生物锡和荧光团的 MT。在所有情况下，使用 taxol 稳定了 MT，以防止变性。MT 亲和力纯化步骤用于移除任何具有高 MT 亲和力的非移动电机，因为这些电机在与底盘结合时可以改变整体运动性。在此过程中，有源电机可解合 MT 并保持在溶液中，而紧密结合的电机在 MT 颗粒中向下旋转。这有助于确保机箱上的所有电机都来自活动总体。
各种DNA折纸结构已被用来研究细胞骨骼运动组合。随着对整体运输的机械认识的增加，实验中使用的DNA折纸结构也越来越复杂。原则上，任何结构都可以为此目的加以调整，只要它被修改为包括电机和荧光道的单链DNA连接位点。特定的底盘设计和属性对于探究有关电机组合的紧急行为的特定问题可能很有用。例如，硬棒已用于开发复制数如何影响组由 dyneins 和运动体7、15、18和 2D 平台组成的传输的基本知识，用于研究肌苷组合actin网络的导航22.具有可变或可调灵活性的结构已经用于理解电机之间弹性耦合的作用，并探讨步进同步如何影响运动性8，24。最近，球形结构被用来深入了解电机轨道绑定的几何约束如何影响运动25的动态。
在此协议中，我们为具有可变刚度的分段机箱上的集成实验提供了具体步骤。机箱上的绑定位点有时称为"句柄"，而绑定这些手柄的补充 DNA 序列称为"防手柄"。这些底盘上的电机数量取决于哪些段包含扩展手柄订书针，与寡核标记电机上的防手柄寡聚物具有互补性。在不同段使用不同的处理序列，允许将不同类型的电机绑定到机箱上的特定位置。此处详述的底盘由 7 个顺序刚性段组成，每个段由 12 个双链 DNA 螺旋组成，排列在 2 个同心环8中。刚性段包含电机手柄，并通过可具有柔性单链 DNA 或刚性双链 DNA 的区域连接，具体取决于"链接器"订书针的缺失或存在。因此，机箱结构的合规性取决于是否存在这些"链接器"订书针。有关更多详细信息和特定 DNA 序列8，请参阅以前的报告。此外，多种方法可用于净化机箱26。此处介绍了速率区甘油梯度离心方法27。
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Protocol
1. 由锥子诱导启动子控制的运动蛋白的生长、表达和收获
- 使用酵母-肽-dextrose （YPD） 培养板和无菌接种棒，在 30°C 下进行所需的冷冻酵母菌株和孵育 3-4 天。
- 文化生长的第一天：下午，将10 mL的YP培养基与2%的dextrose加到直径为1"的玻璃培养管中，并在板中加入一个菌落。在 30°C 的快速旋转滚筒中生长过夜。
- 第2天：下午，将10mL的培养被转移到一个250 mL的烧瓶中，里面装有50 mL的YP培养基，含有2%的拉菲诺。在30°C下孵育过夜，同时在轨道摇床上以250rpm摇动。
- 第3天：下午，将60 mL的培养被转移到一个3升瓶中，里面装有1L的YP文化介质，含有2%的半乳酸。在30°C下孵育过夜，同时在轨道摇床上以250rpm摇动。
- 第 4 天：从上午中开始，每 2 小时监控 600 nm 培养基的光学密度 （OD）。当培养在 OD 1.5 和 2 之间时，继续执行以下步骤来收集单元格。在此 OD 范围之外收获可能会降低产量，因为 OD 1.5 之前细胞计数较低，或细胞静止和蛋白质降解高于 OD 2。
- 将细胞培养物倒入离心瓶中，在4°C下以+6200 x g旋转8分钟。倒入上清液并丢弃。
- 用双蒸馏 H2O （ddH2O） 在瓶中重新悬浮细胞颗粒。
- 在4°C下以+6200 x g旋转细胞8分钟。倒出上清液并丢弃。
- 根据细胞颗粒的粘度，加到2 mL的ddH2O，以创建足以移液的溶液流体。
- 使用装有 10 mL 移液器的电动移液器控制器，一次缓慢地将电池浆液分配到液氮中。这将产生酵母细胞的冷冻颗粒。
- 将冷冻细胞储存在-80°C，直到准备纯化。
2. 从酵母细胞中纯化运动蛋白
- 细胞溶解和可溶性蛋白质提取
- 在纯乙醇中制备1mL的0.1M PMSF新溶液。等待将 PMSF 添加到水缓冲液中，因为它在水中不稳定;此外，避免接触水，直到使用20分钟（PMSF在水中的大约半年寿命）。
- 在冰上准备50 mL的4x裂变缓冲液，补充来自裂变缓冲液的5x库存，但不要在缓冲液应用于酵母颗粒之前添加PMSF。
- 将液氮冷冻酵母颗粒研磨成细粉，用刀片式咖啡研磨机预冷冻液氮。
注：这种蛋白质提取通常从从2 L酵母培养的细胞颗粒开始。酵母培养的起始量可以向上或向下调整，在下面的步骤2.2.2和2.3.1中对IgG珠子和DNA寡聚物的体积进行相应的调整。 - 在冰上加入DTT和Mg-ATP的4x裂液缓冲液的15 mL，并将PMSF添加到缓冲液中，最终浓度达到2 mM，完成4x裂液缓冲液与补充剂的准备。
- 将酵母粉收集到冰上预冷却的 100 mL 玻璃烧杯中。将少量的4x利沙缓冲液与补充剂添加到粉末中，使缓冲液的最终浓度不超过1倍。通常，每10 mL酵母粉添加±1.5 mL的缓冲液。
- 将烧杯放入 37°C 水浴中，用铲子不断搅拌，快速将粉末解冻至液相。
- 解冻后立即将莱沙烧杯放回冰上，使用50 mL锥形管估计液化体积，并用补充剂加入更多4x莱沙缓冲液，使缓冲液的最终浓度为±1倍。通常，2 L的酵母培养产生含有1x莱沙缓冲液的25-35 mL的莱沙。
- 均匀地将奶瓶分发到冰上的离心机瓶中。小心地平衡瓶子，每对之间的质量差不超过0.01克，确保每瓶都超过防止瓶子破裂所需的最小体积。在 +290，000 x g下，在 4°C 下离心 25 分钟。
- 在冰上50 mL锥形管中收集含有可溶性蛋白质的上清液，并丢弃含有细胞碎片和大细胞器的颗粒。避免收集上清液的任何多云部分，因为它们会堵塞后续步骤中使用的重力流柱。保存 10 μL 的上清液用于 SDS-PAGE 分析。
- IgG 亲和纯化
- 在上述旋转过程中，在冰上或冷室中设置重力流色谱柱。
- 使用带剃刀刀片的 P-1000 移液器尖端切割将 200 μL 的 50% IgG 亲和珠浆转移到柱中，以扩大其入口端口的直径。如果纯化大于或小于2 L的细胞培养颗粒，则按比例调整珠浆的体积，最小体积为100μL。
- 使用 DTT 和 Mg-ATP 对 4x 裂莱缓冲液再加15 mL，并将 PMSF 添加到缓冲液中，最终浓度达到 2mM。通过添加 ddH2O，将冰上的 4 倍缓冲液稀释至 1 倍。
- 用5 mL的1x利沙缓冲液清洗珠子2x与补充剂。
- 用补充剂在200 μL的1x赖沙缓冲液中重新悬浮珠子。
- 将珠悬浮液加入离心所得的蛋白质提取物中，在4°C下孵育混合物1小时，温和旋转。
- 在孵育期间，在冰上制备25 mL的洗涤缓冲液（表1中详述的配方）和冰上50 mL的1x TEV缓冲液（表1中详述的配方）。
- 1 h 孵育后，通过上述步骤 2.2.2 中使用的同一色谱柱过滤冰上或冷室中的流合酶-珠混合物。为 SDS-PAGE 分析节省 10 μL 的流量。
- 用 5 mL 的洗涤缓冲液在冰上 2x 上清洗剩余的电机绑定珠子。为 SDS-PAGE 分析保存 10 μL 的第一次洗涤。
- 用 5 mL 的 1x TEV 缓冲液在冰上清洗珠子一次。允许缓冲区从列中完全耗尽。
- 用DNA寡核苷酸和TEV裂解标记
- 从设置中取出色谱柱，并盖住色谱柱的底部。在同一列中，用100μL的1x TEV缓冲液孵育电机珠，在室温（RT）下孵育含有10-20μM的纯化BG-寡核10-15分钟。如果纯化大于或小于2 L的细胞培养颗粒，则按比例调整1x TEV缓冲液的体积并按比例纯化BG-寡聚物。如果需要提高电机标签的产量和速率，根据制造商的说明增加孵育时间，但请注意，由于RT的蛋白质变性，孵育时间延长也可能增加功能失调电机的比例。
- 在孵育的每一分钟轻轻重新悬浮珠子。
- 使用相同的色谱柱和设置，使用 4 mL 的 1x TEV 缓冲液清洗标记的电机珠 4x。允许最终洗涤从柱中完全排出。
- 盖住柱的底部，将电机磁珠重新悬浮在不超过 200 μL 的 1x TEV 缓冲液中，并转移到 2 mL 圆底微离心管中。
- 在16°C下，用±0.3单位的TEV蛋白酶在16°C下孵育悬浮液，轻轻旋转1小时。应安装管子，以尽量减少珠子接触的管的总表面积。
- 在冷室中，以 21，130 x g的微型离心机将管离心 30 s，将混合物浓缩在管底部。
- 仍然在冷藏室，使用切割P-1000移液器尖端将混合物转移到旋转柱和离心机在21，130 x g为30s。收集含有TEV切割，纯化电机的滤液。TEV 蛋白酶将位于滤液和电机中。
- 保存 10 μL 的滤液，用于 SDS-PAGE 分析。将剩余的滤液以2μL的体积压用，用于TIRF实验或50μL，用于微管亲和纯化。闪蒸将等分冻结在液氮中，并储存在-80°C。
- 在 1x TEV 缓冲区中重新悬浮过滤器中剩余的珠子，以便进行 SDS-PAGE 分析。使用与上述步骤 2.3.4 相同的 1x TEV 缓冲区卷。
3. 微管 （MT） 聚合
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用于 TIRF 测定的图布林混合物的制备
- 在冷藏室中，在重组缓冲液中分别溶解每种类型的冻干性图布林（未标记牛tubulin、生物素化图布林和荧光图布林），最终浓度为10mg/mL。 在冰上坐10分钟。
- 混合以下成分，让在寒冷室中坐10分钟（最终浓度以括号方式表示）：18 μL牛tubulin（±8.2mg/mL），2μL生物素化图布林（±0.9毫克/mL），2μL荧光图布林（±0.9毫克/mL）。
- 在液氮中制备3μL等分的土布林混合物和闪冻液。将混合物储存在-80°C。
- 在冷藏室中，在重组缓冲液中分别溶解每种类型的冻干性图布林（未标记牛tubulin、生物素化图布林和荧光图布林），最终浓度为10mg/mL。 在冰上坐10分钟。
-
用于电机 MT 亲和纯化的图布林制备
- 在冷室中，在重组缓冲液中溶解冻干牛结肉素，使最终浓度达到10mg/mL。在冰上坐10分钟。
- 在液氮中制备3μL等分的土布林混合物和闪冻液。将混合物储存在-80°C。
-
将图布林聚合到MT中
- 从 -80°C 冷冻箱中取出 3 μL 等分量的 tubulin，通过握住管的底部，快速、短暂地解冻至液相。立即放在冰上，孵育至少3分钟。
- 在tubulin溶液顶部轻轻将3μL的2x聚合混合物（表2中详述的配方）轻轻分层。通过轻轻轻拂管子进行混合，但不要通过移液混合，因为剪切力可能会破坏 MT 成核和伸长。
- 在37°C的水浴中孵育混合物30分钟。
- 轻柔层 6 μL 的 RT 1x BRB80 与补充剂 （配方详细在表 2） 的顶部，并通过轻拂混合.请勿通过移液进行混合。
- 在37°C下孵育混合物至少10分钟。
- 继续MT亲和纯化，或者如果做TIRF测定，在RT过夜的黑暗中孵育MT，形成更长的MT。
- 在 RT 的黑暗中存储聚合的 MT 数周。
4. 微管 （MT） 亲和纯化
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通过离心去除未聚合的土布林
- 混合以下成分，使60%甘油垫：1x BRB80（无补充剂;食谱详见表2），20μM Taxol（溶解在DMSO中），1 mM DTT和60%甘油。
- 将 60 μL 的甘油缓冲转移到超离心管中。将未标记的 MT 轻轻分层 12 μL，以前聚合在垫子顶部。为了防止切割 MT，请使用切割移液器尖端进行转移。
- 在22°C下将混合物在+97，300 x g下离心15分钟。旋转后，多余的图布林留在上层液体层中，而 MT 在底部形成颗粒。在旋转前标记管的外边缘，以帮助定位颗粒，因为肉眼可能无法看到颗粒。
- 小心地去除甘油缓冲液上方的液层（±12 μL），并保存10μL进行SDS-PAGE分析。
- 用 20 μL 的 1x BRB80 补充剂轻轻冲洗液层和垫子之间的界面。取出并丢弃 20 μL 冲洗液。
- 小心地取出甘油垫（+60 μL），并保存10μL用于SDS-PAGE分析。小心不要干扰 MT 颗粒。
- 用60μL的1x BRB80补充剂轻轻冲洗颗粒（配方详见表2）。小心不要干扰 MT 颗粒。丢弃冲洗溶液。
- 使用切割移液器尖端将MT颗粒重新悬浮在24 μL的Taxol补充赖液缓冲液中（表3中详述的配方）。
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通过基于MT的亲和色谱纯化功能电机
- 从-80C冷冻箱中取出从酵母中纯化的两个50μL等分的电机，并迅速解冻至液相。立即放在冰上。
- 按照指示顺序将以下组件添加到新的超离心管中，并在 RT 上孵育混合物 10 分钟：（1） 从酵母中纯化的电机的 100 μL，（2） 29 μL 的 5x ATP/Taxol 混合物（表 3中详细说明的配方），然后 （3） 12 μL 纯化 MC 转录用切割移液器尖端进行推断。
- 将混合物在+97，300 x g和22°C下离心15分钟。旋转后，功能性电机留在上清液中，MT 与绑定到它们的非功能性电机形成颗粒。
- 收集上清液，在2μL等分液中闪冻结，并储存在-80°C。
- 保存 10 μL 的上清液用于 SDS-PAGE 分析。在 141 μL 的 1x BRB80 中重新悬浮颗粒，用于 SDS-PAGE 分析。使用蛋白质标准，如actin，创建一个标准曲线，以量化纯化电机的浓度，如前面详细17。
- 在步骤 6.1.3 中将电机与底盘结合时，使用此浓度信息。
5. 分段DNA折纸底盘的生产
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底盘的形成
- 在 Tris 缓冲液中，在 250 μM 处将 96 个井盘中列出的钉钉寡核苷酸订购，然后在 Tris 缓冲液中将其重新悬浮到 250 μM。
- 通过混合每个核心订书针的 5 μL 创建核心订书针池（参见 Driller-Colangelo 20168 中的表 S1 ）。
- 通过混合每个链接器订书针的 5 μL 创建链接器订书针池（请参阅 Driller-Colangelo 20168中的链接器订书针表）。
- 通过混合每个荧光管订书钉的5μL来创建荧光酸结合订书针池（参见Driller-Colangelo 20168中的荧光管表）。
- 将 50 μL 折叠反应与以下组件混合：1x 折叠缓冲液;100 nM 8064 脚手架;600 nM 核心订书针池;600 nM 荧光酸主食池;9 μM 荧光酸绞线（参见 Driller-Colangelo 2016 8 中的氟磷抗手柄表）;对于每个电机绑定位点，4.2 μM 扩展手柄股或 600 nM 绞线，无需所需的手柄（参见 Driller-Colangelo 20168中的电机手柄/防手柄订书针表）;600 nM 链接器，如所需8;额外的 6 mM MgCl2;和水。
- 使用以下程序折叠热循环器：快速加热至 80°C，以单度增量冷却至 65°C 超过 75 分钟，然后以单度增量额外冷却至 30°C，超过 17.5 小时。
- 在0.5x TBE缓冲液中的2%角糖凝胶（见食谱表4）的检测折叠质量，辅以11 mM MgCl2和DNA凝胶染色（见材料表）。在 0.5x TBE 缓冲液中运行凝胶，在 70 V 时辅以 11 mM MgCl2 60-90 分钟。 在冰水浴或冷室中运行凝胶，以防止机箱结构过度加热和随后变性。
- 使用适用于步骤 5.1.7 中使用的 DNA 凝胶染色的条件对凝胶进行成像。
-
机箱净化
- 在净化前一天的傍晚，在离心管中轻轻分层80 μL，每层45%、40%、35%、30%、25%、20%和15%的甘油（1x折纸折叠缓冲液中加入其中，以形成甘油梯度（有关配方见表4）。图层之间的边界应略微可见。
- 在4°C过夜孵育梯度。
- 第二天早上，在1x折纸折叠缓冲液中加入45%的甘油，加入折叠的底盘溶液中，最终浓度为10%甘油。在离心管的梯度顶部轻轻混合并分层。
- 在 4°C 下，将机箱在 243，000 x g下旋转 130 分钟。
- 从顶部到底部方向从管中收集 50 μL 分数。
- 在0.5x TBE缓冲液中铸造2%的甘露胶，辅以11 mM MgCl2和DNA凝胶染色。
- 在凝胶上加载5μL，在0.5x TBE缓冲液中加入运行凝胶，辅以11mM MgCl2，在70 V下运行凝胶90-120分钟，在冰水浴或冷藏室中运行凝胶，以防止过度加热和随后底盘结构变性。
- 使用适用于步骤 5.2.6 中使用的 DNA 凝胶染色的条件对凝胶进行成像。
- 为未来的实验选择分数，这些部分具有折叠良好的单体结构，没有未合并的订书针。
- 使用适当的光谱方法（如 260 nm 处的紫外线吸收）对所选分数的量化浓度。在步骤 6.1.3 中将电机与底盘结合时，使用此浓度信息。
6. 制作滑动测定室
- 将两条双面胶带粘在玻璃幻灯片上，并在顶部放置一个盖玻片，从而制作一个滑动测定室。房间是夹在盖玻片和玻璃滑梯之间的狭窄空间，两侧是两条胶带。图 1说明了测定室。
- 使用溶液准备滑轨时，使用移液器将任何液体从一侧流入造型室，并使用滤纸条收集另一侧的流体流动。
7. 电机组合运动 TIRF 测定
- 电机与 DNA 底盘的结合
- 在冰上，准备新鲜 1 mL 每个 DTT 补充 BRB80， 分类醇补充的莱沙缓冲液， 和 casein-Taxol 补充的莱糖缓冲液 （配方详细在表 5）.将每个缓冲液的 200 μL 转移到 RT 管中。
- 仍在冰上，使用冷壳素-分类醇补充的莱沙缓冲液来制备4倍能量和4倍清除剂混合物（表5中详述的配方）。
- 在冰上孵育 10 μL 的 ±300 nM 纯化电机，5 μL 的 ±10 nM DNA 机箱在冰上孵育 15-30 分钟。这些电机浓度已被证明使底盘的电机结合点在此潜伏时间饱和。
注：电机占用率不是100%，可能是由于个别底盘结构8、28中手柄钉缺失所致。 - 在孵育过程中，使用RT Taxol补充的赖沙缓冲液稀释生物素和荧光素标记的MTs100x，并按照下述步骤制备适合尺寸排除柱色谱的凝胶过滤树脂。
- 通过尺寸排除柱色谱从电机底盘上去除多余的电机
- 在 50 mL 锥形管中，用 45 mL 的 ddH2O 清洗凝胶过滤树脂的 5 mL 2x。每次清洗时，将树脂与圆锥管中的水混合，在 460 x g下旋转混合物 1 分钟。丢弃上清液并保存树脂。
- 使用上述相同方法使用 45 mL 的 1x 解结缓冲液（表 5中详细说明的配方）清洗树脂 2x。
- 将洗涤的树脂重新悬浮在1x赖沙缓冲液中，比例为1：1，使树脂在缓冲液中变成±50%的浆料。洗涤的树脂可在4°C下储存至少1个月。
- 将树脂悬浮液的 800 μL 转移到旋转柱上。通过重力流排空多余的缓冲液5分钟。在1000 x g下以2秒旋转的旋转下，取出任何剩余的缓冲液。最终树脂体积应约为 350-400 μL。
- 用 casein-Taxol 补充的莱沙缓冲液稀释电机底盘混合物，最终体积为 50 μL。将稀释后的混合物转移到装有树脂的旋转柱上。
- 将旋转柱在 1，000 x g下离心 6 s（这一次包括加速和减速时间）。通过保存滤液收集纯电机底盘联结物，并丢弃保留多余的电机的柱。
- 为成像准备幻灯片
- 流量13 μL 1mg/mL生物素化牛血清白蛋白（生物素-BSA）进入滑动测定室。孵育2分钟，以便将BSA与玻璃结合。
- 用 20 μL 的 RT DTT 补充 BRB80 将腔室 2x 洗涤，在造型室一侧的缓冲液中流动，并使用滤纸条将多余的液体从另一侧冲洗。
- 流量在20μL的0.5毫克/mL链球菌。孵育2分钟，使链球菌与BSA上的生物锡结合。
- 用 20 μL 的 RT Taxol 补充的莱沙缓冲液清洗腔室 2 倍。
- 用切割移液器尖端轻轻流过 20 μL 的稀释的 MT。孵育2分钟，使MT和链球菌双星的生物锡结合。
- 用20 μL的RT卡辛-卡索补充莱沙缓冲液洗涤2倍。孵育2分钟，使色文渗透到整个腔室。
- 将纯化电机底盘与冷壳素-Taxol补充的莱沙缓冲液一起稀释5x至10x与单分子条件（±10-100 pM）的结合。将以下组件混合在一起，产生最终的电机底盘混合物：电机底盘稀释10μL，4倍能量混合5μL，4x清除器混合物5μL。
- 将最终电机底盘混合物的 20 μL 流到测定滑动室，然后进行 TIRF 显微镜检查。
- 成像和数据采集
- 立即使用 TIRF 显微镜对幻灯片进行成像。通常，每张幻灯片的使用在 30 到 60 分钟之间。
- 在 MT 通道中获取静止图像，在机箱通道中获取影片。对于此协议中的电机，帧速率为 0.5 fps 且曝光时间为 200 ms 的 10 分钟短片是合适的。
- 从机箱电影，生成一个Kymograph为每个MT在ImageJ或类似的图像处理软件29。通过测量在kymograph30上运行的斜坡和水平距离，分析电机底盘合奏的速度和运行长度。
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Representative Results
通过凝胶电泳对电机和底盘结构的成功纯化进行了测定。SDS-PAGE分析证实从酵母中成功提取丁二代（图2），因为步骤2.3.7中收集的最终滤液显示了一个清晰、锋利的带状物，位置为+350 kDa。不出所料，这个dynein带没有从流流和洗涤，去除不需要的蛋白质，和珠子，从其中Dynein被切。观察表明，IgG亲和纯化提纯和TEV蛋白酶裂解均具有高效率。此外，TEV蛋白酶也存在于最终的滤液中，并在+50 kDa处形成了一个明确的带。
通过SDS-PAGE分析也证实了丁宁和激酶蛋白的MT亲和纯化成功（图3）。虽然dynein在±350 kDa处以明显的单波段出现，但激酶在±120 kDa处出现轻微涂抹多个带，这可能是因为蛋白质14的磷酸化和脱磷酸化形式的存在以及蛋白质14的可变产量寡头标签。此 MT 亲和纯化前后的 dynein 和激酶带之间的比较显示，电机浓度降低，这从带强度的降低中表明，这可能是由于非功能性电机的去除。尽管减少了，但保留的电机浓度足以进行有效的 TIRF 检测。除了TEV蛋白酶外，最终的上清液中存在相当数量的图布林（+51 kDa），很可能是由于在实验中MT逐渐分解，或者通过离心不完全去除多余的图布林。然而，TIRF 测定中显示的电机底盘组合的一致运动性表明，图布林和 TEV 蛋白酶不会干扰电机功能（参见图 6）。
DNA折纸结构的折叠由阿加糖凝胶电泳测定。图 4描述了凝胶分析具有 2 个电机绑定点位的柔性分段底盘折叠的结果。纯展开的脚手架绞线（Lane 1）和折叠反应（Lane 2）之间的移动变化表示折纸折叠。此外，车道 2 中的折叠反应表明底盘结构存在某种多面化。通常会发生多面化，需要随后对折叠良好的单体结构进行纯化。未合并的过量订书针也可见，通过凝胶表现出高度的流动性。
折叠折纸反应被纯化，以去除机箱结构中多余的未合并订书针和多把。图 5显示了具有 7 个电机绑定位点的柔性底盘的甘油梯度纯化结果。早期分数对应于管顶部的低甘油密度。它们包含多余的订书针。晚期分数对应于管底部的高甘油密度，包含折叠结构的多聚体和聚合体。在此凝胶中，分数 7 表示包含良好折叠单体机箱的合适分数。请注意，折叠良好的结构与多余的订书针和多工器隔离。虽然这种凝胶具有代表性，并且小数 7 通常包含可使用的机箱，但每个纯化实验产生的结果略有不同，并且应始终对分数进行检测，以确定哪个分数最适合运动性测定。
电机底盘组合的动量在 TIRF 电影生成的 kymograph 上易于检测和测量。例如，与七个 dynein 蛋白质（"7D"组合）结合的柔性底盘的 kymograph（图 6）以相对一致的速度显示高度过程运行，表明组合在重组的系统，和MT亲和净化成功地删除了大多数功能不全，不动的发电机，可以减缓或停止合奏。同样的TIRF实验已经成功地在其他底盘类型与不同的符合性和电机编号，揭示了这些因素对Dynein团队合作8，9的影响。
图1：滑动测定室的原理图。盖玻片位于两条双面胶带上。溶液一侧移液，另一侧用滤纸提取。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SDS-PAGE分析从酵母中纯化的丁物。酵母细胞被解压缩和离心，以收集含有总可溶性蛋白质的解结酶（通道1）。利用柱珠上的IgG和重组的dynein构造上的ZZ标记之间的亲和力进行这种净化。流通（通道2）在流过色谱柱后从流沙和珠子的混合物中收集。用缓冲液清洗了王朝的珠子，并收集了第一次用洗涤缓冲液（通道3）清洗。戴因随后与DNA寡聚物结合。TEV蛋白酶裂解后，旋转柱中的离心分离了含有dynein（通道4）的滤液和残余珠子（通道5）。从纯化中采集的所有样品均使用1xLDS样品缓冲液和1x还原剂变性，并加载到4-12%的Bis-Tris凝胶中。凝胶在200 V的1x MOPS缓冲液中运行，±1小时，并沾染SYPRO红蛋白凝胶染色剂，用于在紫外线下成像。值得注意的是，4 号车道 #350 kDa 处的清晰、锋利的波段表示最终滤液中存在浓缩纯化 dynein，而同一通道中 ±50 kDa 的频段表示 TEV 蛋白酶的共同存在。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：SDS-PAGE对功能性丁和激酶蛋白的MT亲和力纯化分析。从酵母（通道1和3）中纯化的Kinesin和dynein与聚合性MT和ATP混合，并进行了超离心化，将上生体（通道2和4）中的功能电机与与MT共同结合的非功能性电机分离。纯化前后的电机样品使用1xLDS样品缓冲液和1x还原剂变性，并加载到4-12%的Bis-Tris凝胶上。凝胶在200 V的1x MOPS缓冲液中运行，±1小时，并沾染SYPRO红蛋白凝胶染色剂，用于在紫外线下成像。MT亲和纯化后，运动带的强度（运动因子为120 kDa，dynein为+350 kDa）出现下降，表明电机浓度下降。在净化后马达样品中存在明显的图布林和TEV蛋白酶浓度。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：折叠DNA折纸结构的甘蔗凝胶分析。折叠DNA折纸结构通过凝胶电泳进行评估。车道 1 是纯展开的脚手架链，而车道 2 是折叠反应的产物。凝胶在70V在冰水浴运行90分钟在0.5x TBE缓冲液补充11 mM MgCl2。移动性的变化表示折纸折叠。在 2 号巷中，还可以看到未合并的订书针和底盘多路器。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：甘油梯度纯化DNA折纸底盘的甘油凝胶分析。甘油梯度纯化的质量可以通过从离心机梯度中分馏分的凝胶电泳来确定。低数分数来自管的顶部，对应于低密度的甘油。高编号分数来自管的底部，对应于高密度的甘油。多余的订书针、单体机箱和多体机箱都可见。分数 7 包含适合 TIRF 显微镜的机箱，因为它们是单体和多余的订书针。凝胶在70V在冰水浴运行120分钟在0.5x TBE缓冲液补充11 mM MgCl2。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：显示单台 MT 上 Dynein-底盘组合的动能的 Kymograph。从酵母中提取并与MT一起纯化的Dynein蛋白与灵活的底盘结构结合。每个机箱有七个绑定点，并形成了一个"7D"合奏。在 TIRF 测定期间，这些合奏团在 MT 上的移动记录在 10 分钟电影（200 ms 曝光，0.5 fps）中。两个 MT 的 Kymograph 是通过沿单个 MT 进行跟踪从 ImageJ 中的此影片生成的。每个图像左上角的垂直和水平红色条分别指示 2 分钟和 20 μm。每个亮线记录一个合奏团的移动，斜率的反向指示速度和水平位移指示运行长度。通过 TIRF 测定和 kymxxx，电机底盘组合的动能变得易于检测和直接测量。请点击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲区名称 | 组成 | 已使用的步骤 | 评论 |
| 5x 莱西缓冲器 | 150 mM HEPES （pH 7.4） | - | 过滤器对缓冲液进行消毒。它可以在RT中储存在一个妥善密封的容器中一年。 |
| 250 mM 醋酸酯 | |||
| 10 mM 毫克醋酸酯 | |||
| 5 mM EGTA （pH 7.5） | |||
| 50%甘油 | |||
| 4x 莱西缓冲与补充 | 4x 莱西缓冲器 | 2.1-2.2 | 从上面的 5x 莱沙缓冲器中制作此 4x 缓冲区。先准备一个没有PMSF的缓冲液，并在需要它的每个步骤之前将化合物（溶解在纯乙醇中）添加到缓冲液的一个小等分中。 |
| 4 mM DTT | |||
| 0.4 mM 毫克-ATP | |||
| 2 mM PMSF | |||
| 清洗缓冲液 | 1x 莱西缓冲与补充 | 2.2 | 要制作缓冲器，请使用 DTT 和 Mg-ATP 向 4x 裂变缓冲器添加 KCl、Triton X-100 和 ddH2O，但在使用前不要添加 PMSF。 |
| 250 mM KCl | |||
| 0.1% 特里顿 X-100 | |||
| 5x TEV 缓冲器 | 50 mM Tris-HCl （pH 8.0） | - | 过滤器对缓冲液进行消毒。它可以在RT中储存在一个妥善密封的容器中一年。 |
| 150 mM KCl | |||
| 10% 甘油 | |||
| 1x TEV 缓冲器 | 1x TEV 缓冲器 | 2.2-2.3 | 要制作缓冲器，在 5x 库存 TEV 缓冲器中添加 DTT、Mg-ATP、Triton X-100 和 ddH2O，但在使用前不要添加 PMSF。 |
| 1 mM DTT | |||
| 0.1 mM 毫克-ATP | |||
| 0.1% 特里顿 X-100 | |||
| 0.5 mM PMSF | |||
表1：来自酵母细胞的电蛋白IgG亲和纯化的缓冲液（协议第2节）。
| 缓冲区名称 | 组成 | 已使用的步骤 | 评论 |
| 5x BRB80 | 400 mM 管道 | - | 过滤器对缓冲液进行消毒。它可以在RT中储存在一个妥善密封的容器中一年。 |
| 10 mM MgCl2 | |||
| 5 mM EGTA | |||
| 使用 KOH 将 pH 调整到 6.8 | |||
| 1x BRB80 带补充剂 | 1x BRB80 | 3.3 和 4.1-4.2 | 必须从 5x BRB80 库存新鲜制成，用于每个实验。 |
| 20 μM 分类醇（溶解在 DMSO 中） | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2x 聚合混合 | 2x BRB80 （无补充剂） | 3.3 | 闪光灯冻结在小等分的混合和存储在-80o C。 |
| 2 mM DTT | |||
| 2 mM Mg-GTP | |||
| 20% DMSO | |||
| 重建缓冲区 | 1x BRB80 （无补充剂） | 3.1 | 每个实验都必须新鲜制作。 |
| 1 mM DTT | |||
| 1 mM Mg-GTP | |||
表2：微管聚合缓冲器（协议第3节）。
| 缓冲区名称 | 组成 | 已使用的步骤 | 评论 |
| 分类补充莱沙缓冲液 | 1x 莱西缓冲器 | 4.1 | 每次纯化都必须新鲜制作。 |
| 20 μM 分类醇（溶解在 DMSO 中） | |||
| 1 mM DTT | |||
| 5x ATP/分类混合 | 1x 莱西缓冲器 | 4.2 | 每次纯化都必须新鲜制作。 |
| 25 mM Mg-ATP | |||
| 50 μM 分类醇（溶解在 DMSO 中） | |||
| 5 mM DTT | |||
表3：功能性运动蛋白微管亲和纯化的缓冲器（协议第4节）。
| 缓冲区名称 | 组成 | 已使用的步骤 | 评论 |
| 20x 折纸折叠缓冲器 | 100 mM Tris pH 8.0 | - | 可在 RT 中正确密封的容器中存放长达一年。 |
| 20 mM EDTA | |||
| 200 mM MgCl2 | |||
| 1x 折纸折叠缓冲器 | 5 mM Tris pH 8.0 | 5.1-5.2 | 在每个实验前用 ddH2O 稀释 20x 库存，使缓冲液新鲜。 |
| 1 mM EDTA | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 0.5 x TBE | 45 mM TrispH 8.0 | 5.1-5.2 | 可在 RT 中正确密封的容器中存放长达一年。 |
| 45 mM 硼酸 | |||
| 1 mM EDTA | |||
表4：用于生产分段DNA折纸底盘的缓冲器（协议第5节）。
| 缓冲区名称 | 组成 | 已使用的步骤 | 评论 |
| DTT 补充 BRB80 | 1x BRB80 | 7.3 | 必须在每次 TIRF 实验前新鲜制作。 |
| 1 mM DTT | |||
| 分类补充莱沙缓冲液 | 1x 莱西缓冲器 | 7.1 和 7.3 | 必须在每次 TIRF 实验前新鲜制作。 |
| 20 μM 分类醇（溶解在 DMSO 中） | |||
| 1 mM DTT | |||
| 盒辛-克索补充莱沙缓冲液 | 1x 莱西缓冲器 | 7.1-7.3 | 必须在每次 TIRF 实验前新鲜制作。 |
| 20 μM 分类醇（溶解在 DMSO 中） | |||
| 1 mM DTT | |||
| ±2.5毫克/毫升色素（溶解在Tris-HCl中，pH8.0） | |||
| 1x 莱西缓冲器 | 30 mM HEPES （pH 7.4） | 7.2 | 用 ddH2O 稀释 5x 库存（表 1 中详细说明的配方），使此缓冲液新鲜。 |
| 50 mM 醋酸酯 | |||
| 2 mM 毫克醋酸酯 | |||
| 1 mM EGTA （pH 7.5） | |||
| 10%甘油 | |||
| 4 倍能量组合 | 22.5 μL 1x 盒素-塔索-全脂液缓冲液 | 7.3 | 必须在每次 TIRF 实验前新鲜制作;指示的体积为 25 μL 的最终体积。 |
| 1 μL 0.1 M Mg-ATP | |||
| 1 μL 40% 葡萄糖 | |||
| 0.5 μL β-美尔卡托乙醇 | |||
| 4x 清理器混合 | 24 μL 1x 盒素-分类醇补充莱沙缓冲液 | 7.3 | 必须在每次 TIRF 实验前新鲜制作;指示的体积为 25 μL 的最终体积。 |
| 1 μL 1x 氧气清除器系统 | |||
表5：电机组合运动TIRF测定的缓冲和混合（协议第7节）。用于制造清除机混合的氧气清除系统的细节可以在17别的地方找到。
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Discussion
DNA折纸的分子构造技术提供了一种独特的方法来构建具有定义架构、电机编号和类型的电机组合，从而能够研究出位行为如何产生于特定的电机配置31。随着结构和细胞研究不断阐明细胞骨骼电机在团队中工作的例子，隔离和研究组合中电机的生物物理和生化机制的技术正在发挥作用。例如，Cryo-EM 已经表明，丁辛可以结合 2 个单独的 dynein 电机，并且这种配对具有不同于单个电机10的动能。此外，DNA结构用于确定哺乳动物的dynein，当由丁克辛和bicD2激活时，在拔河情景14中，其力是否与激酶-1的力相媲美。在另一项混合运动研究中，DNA折纸用于通过在折纸结构15上的空间分离来分离相对极性电机及其调节结合蛋白的影响。随着运动性的更多结构和调控决定因素被发现，基于DNA折纸的技术应证明有助于确定运动组合的突发性运动的具体生化和生物物理贡献者。DNA折纸启用的分子构造技术特别有用，因为整体的突发现象学结果难以预测。这在一定程度上是由于无数的因素，有助于在合奏5，6，31中单个电机的活力。
我们以前结构的示例包括单片棒和具有可变刚度的分段棒。目前的努力探索球形结构以及25。另一些则采用了形态学，如平面结构和杆22，24。同样，通过使用具有正交DNA序列的电机手柄，不同类型的电机可以绑定到同一底盘结构7，14，15，18。这种方法使研究对dyneins和运动体、负和加端定向运动体以及负和加端定向肌苷的相反行为进行了研究。它还允许在野生型合奏中引入突变体，允许对紧急运动的特定生化贡献者被破译7。由于能够将多个荧光光道与每个单独结构结合，因此在 TIRF 中成像以及随后通过 kyxing 或粒子跟踪进行分析是可能的。以前的报告显示了对具有可变符合性的底盘结构的kymxx数据分析和统计评估8。虽然细胞骨骼马达已被证明是使用DNA折纸作为分子面包板32的令人兴奋的早期应用，但其他蛋白质和蛋白质系统也将从这些方法中受益。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢K.Chau、J.Morgan和A.Driller-Colangelo为分段DNA折纸底盘技术做出贡献。我们还感谢Reck-Peterson和Shih实验室的前成员为这些技术的最初发展进行了有益的讨论和贡献。我们感谢J.沃佩雷斯和史密斯学院显微镜和成像中心以及L.比尔韦特和史密斯学院分子生物学中心。我们非常感谢 NSF MRI 计划购置了 TIRF 显微镜。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
References
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