Summary
Målet med denne protokol er at danne ensembler af molekylære motorer på DNA origami nanostrukturer og observere ensemblet motilitet ved hjælp af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi.
Abstract
Cytoskelet motorer er ansvarlige for en bred vifte af funktioner i eukaryote celler, herunder mitose, fragt transport, cellulære motilitet, og andre. Mange af disse funktioner kræver, at motorerne opererer i ensembler. På trods af et væld af viden om mekanismerne i individuelle cytoskelet motorer, forholdsvis mindre er kendt om mekanismerne og emergent opførsel af motor ensembler, eksempler på som omfatter ændringer i ensemble processivitet og hastighed med ændring af motor nummer, placering og konfiguration. Strukturel DNA nanoteknologi, og den specifikke teknik af DNA origami, muliggør Molekylær opførelse af veldefinerede arkitekturer af motor ensembler. Formen af laste strukturer samt type, antal og placering af motorer på strukturen kan alle styres. Her giver vi detaljerede protokoller til fremstilling af disse ensembler og observere dem ved hjælp af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi. Selv om disse teknikker er blevet specifikt anvendt til cytoskelet motorer, metoderne er generaliserbart til andre proteiner, der samles i komplekser til at udføre deres opgaver. Samlet set, DNA origami metode til at skabe veldefinerede ensembler af motor proteiner giver et kraftfuldt værktøj til at dissekere de mekanismer, der fører til emergent motile sædceller adfærd.
Introduction
Dynein og kinesin er cytoskeletale motor proteiner, der er ansvarlige for myriader af funktioner i eukaryote celler1. Ved at omdanne den kemiske energi af ATP hydrolyse til produktivt arbejde, translokerer disse motorer på mikrotubuler til at trække og distribuere forskellige intracellulære Cargos. De koordinerer også i de massive intracellulære rearrangementer forbundet med mitose, hvor de udviser orkestret kræfter, der bidrager til positionering og adskillelse af kromosomer. Strukturelle, biokemiske og biofysiske analyser, herunder observationer af det enkelte molekyle, har afsløret mekanismerne for disse motorer på individuelt niveau (gennemgået i tidligere værker2,3,4). Mange af motorernes opgaver kræver imidlertid, at de arbejder i små ensembler af både lignende og blandede motortyper. Forholdsvis mindre er forstået om de mekanismer, der koordinerer aktiviteten og den ultimative emergent motilitet af disse ensembler5,6. Denne videnkløft skyldes til dels vanskeligheden ved at skabe ensembler med kontrollerbare funktioner, såsom motortype og kopi nummer. I løbet af det seneste årti, har den molekylære konstruktion teknikker af DNA origami været ansat til at løse dette problem. For de mikrotubulære baserede motorer omfatter nogle eksempler på disse undersøgelser enkelt molekyle observationer af ensembler af cytoplasmisk dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, forskellige kinesin-motorer12,13og blandinger af både dyneiner og kinesiner7,14,15. Her giver vi oplysninger om rensning og oligonukleotid mærkning af motorer fra gær7,16,17,18,19,20, foldning og rensning af segmenteret DNA-origami med tunbar overholdelse8, og billeddannelse af gærmotorer, som fremdriver chassis strukturerne7,18.
Konstruere motor ensembler til in vitro enkelt molekyle observation kræver tre primære indsats. Den første er udtrykket, rensning og mærkning af motorkonstruktioner egnet til fastgørelse til DNA origami. Den anden er produktion og rensning af definerede DNA origami strukturer (ofte betegnet "chassis"). Og den tredje er konjugation af motorerne til chassis struktur efterfulgt af observation ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Her giver vi etablerede protokoller for denne proces for rekombinante microtubule-baserede motorer renset fra gær Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. DNA-origami-baserede motor ensembler er blevet undersøgt ved hjælp af både rekombinant kinesin15 og dynein7,8,18 konstruktioner produceret i dette gærekspressions system16 ,17,18,19. Denne protokol gælder for disse konstruktioner, da de styres af den galactoseinducerede promotor og sammensmeltet med de samme protein Tags til rensning (ZZ og TEV proteaselinker) og til DNA-oligo konjugering (SNAPtag).
Specifikke gærstammer producerer specifikke motoriske konstruktioner. For eksempel, dynein bruges til at studere rollen af lasten overholdelse blev renset fra stamme RPY10847,8. Generelt kan der anmodes om stammer, som indeholder motorkonstruktioner med passende genetiske modifikationer til ekspression og rensning, fra de laboratorier, der har offentliggjort brugen af disse motorer. Konstruktioner med nye egenskaber såsom mutationer eller Tags kan laves ved hjælp af rekombinante genetiske teknikker, såsom lithium acetat transformation21 og kommercielle kits. Detaljerede protokoller til oprettelse af modificerede motor proteiner i gær til enkelt molekyle studier er blevet offentliggjort19. Ud over de motorer, der er smeltet til snaptag, skal oligonukleotider anvendes til at mærke motorerne være konjugeret til snap substrat, benzylguanin (BG); tidligere udgivne protokoller beskriver dannelsen og rensningen af BG-oligo-konjugater18. Den overordnede strategi, der er beskrevet her, har også været anvendt til actin-baserede motorer (Se tidligere værker for eksempel22,23,24) og motorer renset fra andre organismer og udtryks systemer (Se tidligere værker for eksempel7,9,10,11,12,13,14).
Polymeriserede mikrotubuler (MTs) anvendes i disse eksperimenter i to forskellige procedurer. MT affinitet rensning af funktionelle motorer kræver MTS, der ikke er mærket med andre funktionelle grupper, mens motor-ensemble motilitet tirf assay kræver MTS mærket med biotin og fluorophores. I alle tilfælde, MTs er stabiliseret med Taxol for at forhindre denaturering. MT Affinity oprensnings trinnet bruges til at fjerne alle ikke-motile motorer med en høj MT affinitet, da disse motorer kan ændre ensemble motilitet, hvis det bøjes til et chassis. Under denne proces frigør de aktive motorer MTs og forbliver i opløsning, mens stram-bindende motorer spinne ned i MT pellet. Dette hjælper med at sikre, at alle motorer på chassiset er fra en aktiv population.
En række DNA origami strukturer er blevet brugt til at studere cytoskelet motor ensembler. Som den mekanistiske forståelse af ensemble transport er steget, DNA origami strukturer ansat i eksperimenter er vokset i kompleksitet. I princippet kan enhver struktur tilpasses til dette formål, forudsat at den er modificeret til at omfatte enkeltstrenget DNA-fastgørelses steder for motorer og fluorophorer. Specifikke chassis design og egenskaber kan være nyttige til at prøve særlige spørgsmål om motor ensembler emergent opførsel. For eksempel er stive stænger blevet brugt til at udvikle fundamentale viden om, hvordan kopi nummer påvirker transport af hold af dyneiner og kinesiner7,15,18, og 2D platforme er blevet brugt til at studere myosin ensemble navigation af actin-netværk22. Strukturer med variabel eller tunbar fleksibilitet er blevet brugt til at forstå rollerne af elastisk kobling mellem motorer og til at sonde, hvordan stepping synkronisering påvirker motilitet8,24. For nylig bruges sfæriske strukturer til at få indblik i, hvordan geometriske begrænsninger af motor-track bindingen påvirker dynamikken i motilitet25.
I denne protokol tilbyder vi specifikke trin til ensemble eksperimenter på segmenteret chassis med variabel stivhed. Bindingssteder på chassiset omtales sommetider som "håndtag", mens komplementære DNA-sekvenser, der binder disse håndtag, betegnes som "anti håndtag". Antallet af motorer på disse chassiser bestemmes af, hvilke segmenter der indeholder udvidede håndtag, med komplementaritet til antihåndtaget oligo på de oligo-mærkede motorer. Ved hjælp af forskellige håndtag sekvenser på forskellige segmenter giver mulighed for binding af forskellige typer af motorer til specifikke steder på chassiset. Chassiset, der er beskrevet her, består af 7 sekventielle stive segmenter, der hver består af 12 dobbeltstrengede DNA-skruelinjer arrangeret i 2 koncentriske ringe8. De stive segmenter indeholder motor håndtag og er forbundet gennem regioner, der kan være enten fleksibelt enkeltstrenget DNA eller stiv dobbeltstrenget DNA, afhængigt af fravær eller tilstedeværelse af henholdsvis "linker" hæfteklammer. Chassis strukturens overensstemmelse bestemmes således af tilstedeværelsen eller fraværet af disse "linker" hæfteklammer. Se tidligere rapporter for yderligere oplysninger og specifikke DNA-sekvenser8. Desuden kan flere metoder bruges til at rense chassis26. Den hastighed-Zonal glycerol gradient Centrifugerings metode27 er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst, ekspression og høst af motor proteiner, der styres af en galactose induceret promotor
- Ved hjælp af en gær-peptone-dextrose (YPD) kultur plade og en steril inokulerende pind, stribe ønskede frosne gær stamme og inkubere i 3-4 dage ved 30 °C.
- Dag 1 i kultur vækst: om eftermiddagen tilsættes 10 mL YP-kultur medier med 2% dextrose til et glas kulturrør med 1 "diameter og inokulerer det med en enkelt koloni fra pladen. Vokse i en hurtigt roterende tromle ved 30 °C natten over.
- Dag 2: om eftermiddagen overføres 10 mL af kulturen til en 250 mL kolbe indeholdende 50 mL YP-kultur medier med 2% raffinose. Inkubér natten over ved 30 °C under omrystning ved 250 rpm på en orbital shaker.
- Dag 3: om eftermiddagen overføres 60 mL kultur til en 3 L kolbe indeholdende 1 liter YP-kultur medier med 2% galactose. Inkubér natten over ved 30 °C under omrystning ved 250 rpm på en orbital shaker.
- Dag 4: Start i midten af formiddagen, overvåge den optiske tæthed (OD) af kulturen ved 600 nm hver 2 h. Når kulturen er mellem en OD 1,5 og 2, Fortsæt med følgende trin for at høste cellerne. Høst uden for dette OD område kan reducere udbyttet på grund af lavt celletal før OD 1,5, eller cellulære inaktive og protein nedbrydning over OD 2.
- Cellekulturen hældes i centrifuge flasker og spinne ved ~ 6200 x g ved 4 °c i 8 min. Hæld supernatanten af, og kassér den.
- Resuspension celle pellet i flasken med dobbelt-destilleret H2o (DDH2o).
- Drej cellerne ved ~ 6200 x g ved 4 °c i 8 min. Hæld supernatanten af, og kassér den.
- Afhængigt af viskositeten af celle pellet tilsættes op til 2 mL ddH2O for at skabe en opløsning, der er tilstrækkelig til pipettering.
- Ved hjælp af en motoriseret pipette regulator monteret med en 10 mL pipette, dispenserer langsomt celle opslæmningen i flydende nitrogen én dråbe ad gangen. Dette vil producere frosne pellets af gærceller.
- De frosne celler opbevares ved-80 °C, indtil de er klar til rensning.
2. rensning af motor proteiner fra gærceller
- Cellelyse og opløseligt proteinekstraktion
- Der forberedes 1 mL frisk opløsning af 0,1 M PMSF i ren ethanol. Vent med at tilføje PMSF til vandige buffere, da den er ustabil i vand; undgå også udsættelse for vand, indtil inden for 20 min (den omtrentlige halveringstid af PMSF i vand) af brug.
- Forbered 50 mL 4X lysis buffer på is med kosttilskud fra 5x bestanden af lysis buffer, men tilsæt ikke PMSF indtil lige før bufferen påføres gærpellet.
- Grind de flydende kvælstof-frosne gær pellets i et fint pulver med en klinge-type kaffemølle, der er blevet præ-kølet med flydende nitrogen.
Bemærk: denne proteinekstraktion starter typisk med celle pellet høstet fra 2 L gærkultur. Udgangsbeløbet for gærkulturen kan justeres op eller ned med tilsvarende justeringer af mængderne af IgG-perler og DNA-oligoer i trin 2.2.2 og 2.3.1 nedenfor. - Aliquot 15 mL af 4X lysis buffer med DTT og mg-ATP på is og tilsæt PMSF til bufferen for at opnå en endelig koncentration på 2 mM, færdiggøre forberedelsen af 4X lysis buffer med kosttilskud.
- Saml gærpulveret i et forkølet ~ 100 mL glasbæger på is. Tilsæt en lille mængde af 4X lysis buffer med kosttilskud i pulveret, således at den endelige koncentration af bufferen ikke overstiger 1x. Tilsæt typisk ~ 1,5 mL af bufferen for hver 10 mL gærpulver.
- Hurtigt tø pulveret til den flydende fase ved at placere bægerglasset i et 37 °C vandbad med konstant omrøring ved hjælp af en spatel.
- Placer bægerglasset på is umiddelbart efter optøning, estimere lysmængden ved hjælp af et 50 mL konisk rør, og tilsæt mere 4X lyse buffer med kosttilskud, således at den endelige koncentration af bufferen er ~ 1x. Typisk, 2 L af gær kultur giver i alt 25-35 mL lysat indeholder 1x lysis buffer.
- Jævnt distribuere lyset til centrifuge flasker på is. Balance flaskerne omhyggeligt til en masse forskel ikke mere end 0,01 g mellem hvert par, hvilket sikrer, at hver flaske er over den mindste mængde, der kræves for at forhindre flaske kollaps. Centrifugeres ved ~ 290.000 x g i 25 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten, der indeholder opløselige proteiner, opsamles i et 50 mL konisk rør på is, og den pellet, der indeholder cellerester og store organeller, kasseres. Undgå at indsamle overskyede dele af supernatanten, da de kan tilstoppe tyngdekraften-flow kolonnen, der anvendes i de efterfølgende trin. Spar 10 μL af supernatanten til SDS-Sideanalyse.
- IgG affinitet rensning
- I løbet af spin ovenfor, oprette en tyngdekraften-flow kromatografikolonne på is eller i et koldt rum.
- Overfør 200 μL 50% IgG affinitet perle gylle til søjlen ved hjælp af en P-1000 pipettespids skåret med en barberkniv til at forstørre diameteren af sin indgangsport. Hvis du renser mere eller mindre end 2 L cellekultur pellet, justere mængden af perle gylle proportionalt, med et minimum volumen på 100 μL.
- Alikvot yderligere 15 mL af 4X lysis-bufferen med DTT og mg-ATP og tilsæt PMSF til bufferen for at opnå en endelig koncentration på 2 mm. Fortynd 4X-bufferen på is til 1x ved at tilføje ddH2O.
- Vask perlerne 2x med 5 mL 1x lyse buffer med kosttilskud.
- Resuspendere perlerne i 200 μL 1x lyse buffer med kosttilskud.
- Tilsæt vulst suspensionen til protein ekstrakten, som er fremstillet ved centrifugering, og Inkuber blandingen ved 4 °C i 1 time med blid rotation.
- Under inkubationen forberedes 25 mL af vaskebufferen (opskrift beskrevet i tabel 1) på is og 50 ml 1X TEV buffer (opskrift beskrevet i tabel 1) på is.
- Efter inkubationen på 1 h filtreres lysperlens blanding på is eller i kølerummet gennem den samme kromatografikolonne, der anvendes i trin 2.2.2 ovenfor. Spar 10 μL gennemstrømningen til SDS-Sideanalyse.
- De resterende motor bundne perler vaskes på is 2x med 5 mL vaskebuffer. Spar 10 μL af den første vask til SDS-Sideanalyse.
- Vask perlerne på is én gang med 5 mL 1x TEV buffer. Lad bufferen løbe helt ud af kolonnen.
- Mærkning med DNA-oligonukleotider og TEV-spaltning
- Fjern kromatografi søjlen fra opsætningen og hætten bunden af søjlen. Inden for samme kolonne Inkubér motor-perlerne med 100 μL 1x TEV buffer indeholdende 10-20 μM af det rensede BG-oligo ved stuetemperatur (RT) i 10-15 min. Hvis du renser mere eller mindre end 2 L cellekultur pellet, justere volumen af 1x TEV buffer og renset BG-oligos forholdsmæssigt. Forøg inkubationstiden i henhold til producentens anvisninger, hvis det er nødvendigt for at øge udbyttet og hastigheden af motor mærkningen, men vær opmærksom på, at længere inkubationstider også kan øge andelen af dysfunktionelle motorer på grund af proteindenaturering ved RT.
- Forsigtigt resuspendere perlerne hvert minut af inkubationen.
- Vask den mærkede motor-perler 4X med 4 mL 1x TEV buffer ved hjælp af den samme kromatografikolonne og setup som før. Lad den endelige vask helt dræne fra søjlen.
- Cap bunden af søjlen, resuspendere motor-perler i højst 200 μL 1x TEV buffer, og overføre til en 2 mL rund bund mikrocentrifuge rør.
- Suspensionen inkubates med ~ 0,3 enheder TEV proteasehæmmere pr. μL motor-perle blanding ved 16 °C i 1 time med blide rotationer. Røret skal monteres således at minimere den samlede overfladeareal af røret, som perlerne kommer i kontakt.
- Centrifugeglasset centrifugeres i en mikrocentrifuge ved 21.130 x g i 30 s i et koldt rum for at koncentrere blandingen i bunden af røret.
- Stadig i kølerummet, skal du bruge en cut P-1000 pipettespids til at overføre blandingen til en spin kolonne og centrifugeres ved 21.130 x g for 30 s. Saml filtratet indeholdende TEV-spaltet, renset motorer. TEV proteasen vil være i filtratet og motorerne.
- Spar 10 μL af filtratet til SDS-Sideanalyse. Aliquot det resterende filtrat i volumener på 2 μL for TIRF-eksperimenter eller 50 μL for affinitet i mikrotubulær rensning. Flashen fryser aliquoterne i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C.
- Resuspendere perlerne tilbage i filteret i 1x TEV buffer til SDS-Sideanalyse. Brug det samme rumfang 1x TEV buffer som i trin 2.3.4 ovenfor.
3. mikrotubule (MT) polymerisering
-
Fremstilling af Tubulin blandinger til TIRF assays
- I et kølerum opløses separat den lyofiliserede Tubulin af hver type (ikke-mærket bovint Tubulin, biotinyleret Tubulin og fluorescerende Tubulin) i rekonstitutionsbuffer (opskrift beskrevet i tabel 2) for at lave en endelig koncentration på 10 mg/ml. Lad sidde på is i 10 min.
- Bland følgende komponenter, og lad dem sidde på is i 10 minutter i kølerummet (de endelige koncentrationer er angivet i parentes): 18 μL kvæg Tubulin (~ 8,2 mg/mL), 2 μL biotinyleret Tubulin (~ 0,9 mg/mL) og 2 μL fluorescerende Tubulin (~ 0,9 mg/mL).
- Forbered 3 μL aliquoter af tubulinblandingen og flash fryse i flydende nitrogen. Blandingerne opbevares ved-80 °C.
- I et kølerum opløses separat den lyofiliserede Tubulin af hver type (ikke-mærket bovint Tubulin, biotinyleret Tubulin og fluorescerende Tubulin) i rekonstitutionsbuffer (opskrift beskrevet i tabel 2) for at lave en endelig koncentration på 10 mg/ml. Lad sidde på is i 10 min.
-
Fremstilling af Tubulin til MT affinitet rensning af motorer
- I et kølerum opløses frysetørret bovint Tubulin i rekonstitutionsbufferen for at foretage en endelig koncentration på 10 mg/mL. Lad sidde på is i 10 min.
- Forbered 3 μL aliquoter af tubulinblandingen og flash fryse i flydende nitrogen. Blandingerne opbevares ved-80 °C.
-
Polymerisering af Tubulin til MTs
- Fjern en 3 μL alikvot Tubulin fra-80 °C-fryseren, og ret hurtigt og kort tø til den flydende fase ved at holde bunden af røret. Anbring straks på is og Inkuber i mindst 3 minutter.
- Forsigtigt lag 3 μL 2x polymeriserings blanding (opskrift beskrevet i tabel 2) oven på tubulinopløsningen. Bland ved forsigtigt at fslikke røret, men Bland ikke ved pipettering, da forskydnings kræfterne kan forstyrre MT-Nukleering og forlængelse.
- Blandingen inkubates i et vandbad ved 37 °C i 30 minutter.
- Forsigtigt lag 6 μL RT 1x BRB80 med kosttilskud (opskrift beskrevet i tabel 2) på toppen og mix af flicking. Bland ikke ved pipettering.
- Blandingen inkubates ved 37 °C i mindst 10 minutter.
- Fortsæt til MT affinitet rensning, eller hvis du gør tirf assays, der inkuberes ved MTs i mørket på rt natten til at danne længere MTs.
- Opbevar polymeriseret MTs i ugevis i mørke ved RT.
4. microtubule (MT) affinitet rensning
-
Fjernelse af ikke-polymeriserede tubuliner ved centrifugering
- Bland følgende komponenter for at lave en 60% glycerol pude: 1x BRB80 (uden kosttilskud; opskrift beskrevet i tabel 2), 20 ΜM Taxol (OPLØST i DMSO), 1 mm DTT og 60% glycerol.
- Overfør 60 μL af glycerolpuden til en ultracentrifuge tube. 12 μL forsigtigt lag af den ikke-mærkede MTs polymeriseret tidligere på toppen af puden. For at forhindre klipning af MTs, overføre dem ved hjælp af en skåret pipettespids.
- Blandingen centrifugeres ved ~ 97.300 x g ved 22 °c i 15 minutter. Efter spin forbliver de overskydende tubuliner i det øverste flydende lag, mens MTs danner en pellet i bunden. Marker den yderste kant af røret før spin for at hjælpe med at finde pellet, da pellet måske ikke er synlig med det blotte øje.
- Fjern forsigtigt det flydende lag (~ 12 μL) over glycerolpuden, og spar 10 μL til SDS-Sideanalyse.
- Skyl forsigtigt grænsefladen mellem flydende lag og pude med 20 μL 1x BRB80 med kosttilskud. Fjern og kassér 20 μL skylning.
- Fjern forsigtigt glycerolpuden (~ 60 μL), og spar 10 μL til SDS-Sideanalyse. Pas på ikke at forstyrre MT pellet.
- Skyl forsigtigt pellet med 60 μL 1x BRB80 med tillæg (opskriften er beskrevet i tabel 2). Pas på ikke at forstyrre MT pellet. Kassér skylle opløsningen.
- MT-pellet opslæmmes i 24 μL Taxol-suppleret lyse buffer (opskrift beskrevet i tabel 3) ved hjælp af en afskårne pipettespids.
-
Rensning af funktionelle motorer ved MT-baseret affinitets kromatografi
- Fjern 2 50 μL aliquoter af motorer renset fra gær fra-80C fryser og tø hurtigt til den flydende fase. Placer straks på isen.
- Tilsæt følgende komponenter til en ny ultracentrifuge tube i den angivne rækkefølge og Inkuber blandingen ved RT i 10 min: (1) 100 μL af motorerne renset fra gær, (2) 29 μL 5x ATP/Taxolmix (opskrift beskrevet i tabel 3), derefter (3) 12 μl renset MTs Tran med en skåret pipettespids.
- Blandingen centrifugeres ved ~ 97.300 x g og 22 °c i 15 minutter. Efter spin forbliver funktionelle motorer i supernatanten, og MTs danner en pellet sammen med de ikke-funktionelle motorer, der er bundet til dem.
- Supernatanten opsamles, flash fryser i 2 μL aliquoter og opbevares ved-80 °C.
- Spar 10 μL af supernatanten til SDS-Sideanalyse. Resuspension pellet i 141 μL 1x BRB80 for SDS-Sideanalyse, også. Brug protein standarder, såsom actin, til at skabe en standardkurve til kvantificering af koncentrationen af de rensede motorer som tidligere detaljeret17.
- Brug denne koncentrations information, når du konjugerer motorer til chassiset i trin 6.1.3.
5. produktion af segmenteret DNA origami chassis
-
Dannelse af chassis
- Bestil de korte oligonukleotider, der er anført i tidligere udgivne tabeller8 i 96 brønd plader våd ved 250 ΜM i Tris buffer, eller tør og derefter resuspendere dem til 250 ΜM med Tris buffer.
- Opret en pulje af kerne hæfteklammerne ved at blande 5 μL af hver kerne hæfteklammer (se tabel S1 i driller-Colangelo 20168).
- Opret en pulje af linker hæfteklammer ved at blande 5 μL af hver linker hæftning (Se linker hæfte tabel i driller-Colangelo 20168).
- Opret en pulje af fluoroforet binding hæfteklammer ved at blande 5 μl af hver fluoroforet håndtag hæfteklammer (Se fluoroforet håndtag tabel i driller-colangelo 20168).
- Bland 50 μL folde reaktioner med følgende komponenter: 1x folde buffer; 100 nM 8064 stilladset; 600 nM Core hæfte bassin; 600 nm fluoroforet hæfte bassin; 9 μM fluoroforet strand (Se fluoroforet anti håndtag bord i driller-colangelo 20168); for hver motor bindingssted, enten 4,2 μM Extended håndtag tråde eller 600 nM tråde uden håndtag som ønsket (Se motor håndtag/anti håndtag hæfteklammer bord i driller-Colangelo 20168); 600 nM linkers som ønsket8; yderligere 6 mM MgCl2; og vand.
- Fold i en termisk variator ved hjælp af følgende program: hurtig opvarmning til 80 °c, køling i enkelt grad intervaller til 65 °c over 75 min, derefter yderligere afkøling i enkelt grad intervaller til 30 °c over 17,5 h.
- Analyse foldnings kvalitet på en 2% agopstået gel i 0,5 x TBE-buffer (Se tabel 4 for opskrift) suppleret med 11 mm mgcl2 og DNA-gel bejdse (jf. tabel over materialer). Kør gel i 0,5 x TBE-buffer suppleret med 11 mM MgCl2 ved 70 V i 60-90 min. Run gels i et isvandbad eller i et koldt rum for at forhindre Overdreven opvarmning og efterfølgende denaturering af chassis konstruktioner.
- Billedet af gelen med betingelser, der egner sig til den DNA-gel plet, som anvendes i trin 5.1.7.
-
Rensning af chassis
- I den sene eftermiddag dagen før rensning, oprette glycerol gradienter ved forsigtigt lagdeling 80 μl hver af 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, og 15% glycerol i 1x origami folde buffer i et centrifugeglas (Se tabel 4 for opskrift). Grænserne mellem lagene skal være lidt synlige.
- Inkubatgradienter ved 4 °C natten over.
- Næste morgen tilsættes 45% glycerol i 1x origami folde buffer til den foldede chassis opløsning til en endelig koncentration på 10% glycerol. Bland forsigtigt og lag på toppen af gradienten i centrifugeglasset.
- Drej gradienten med chassiset ved 243.000 x g i 130 min ved 4 °c.
- Saml 50 μL fraktioner fra røret i top til bund retning.
- Støbt en 2% agopstået gel i 0,5 x TBE-buffer suppleret med 11 mM MgCl2 og DNA-gel bejdning.
- Læg 5 μL af hver fraktion på gelen og Kør gel i 0,5 x TBE-buffer suppleret med 11 mM MgCl2 for 90-120 min ved 70 V. Run gels i et isvandbad eller i et koldt rum for at forhindre Overdreven opvarmning og efterfølgende denaturering af chassis konstruktioner.
- Billedet af gelen med betingelser, der egner sig til den DNA-gel plet, som anvendes i trin 5.2.6.
- Vælg brøker til fremtidige eksperimenter, der udviser velfoldede monomere strukturer fri for ikke-inkorporerede hæfteklammer.
- Kvantificerede koncentrationer af udvalgte fraktioner ved hjælp af passende spektroskopiske metoder, såsom UV-absorption ved 260 nm. Brug denne koncentrations information, når du konjugerer motorer til chassiset i trin 6.1.3.
6. gør slide analyse kamre
- Lav en slide analyse kammer ved at stikke to strimler af dobbeltsidet tape til en glas slide og placere en dækglas på toppen. Kammeret er den smalle plads klemt mellem dækglas og glas slide, flankeret af de to strimler af tape. Figur 1 illustrerer analysekammeret.
- Når du forbereder sliden med opløsninger, skal du bruge en pipette til at flyde enhver væske ind i kammeret fra den ene side og bruge en strimmel filtrerpapir til at indsamle væskestrømmen på den anden side.
7. motor ensemble motilitet TIRF-analyse
- Konjugering af motorer til DNA-chassis
- På is, Forbered frisk 1 mL hver af DTT-suppleret BRB80, Taxol-suppleret lysis buffer, og kasein-Taxol-suppleret lyse buffer (opskrifter beskrevet i tabel 5). Overfør 200 μL af hver buffer til et RT-rør.
- Stadig på is, brug den kolde kasein-Taxol-suppleret lysis buffer til at forberede 4X energi og 4X Scavenger blandinger (opskrifter beskrevet i tabel 5).
- Inkuber 10 μL ~ 300 nM-rensede motorer med 5 μL ~ 10 nM DNA-chassis på is i 15-30 min. Disse koncentrationer af motorer har vist sig at mægle chassisets motor bindingssteder for denne inkubationstid.
Bemærk: motor belægning er ikke 100%, sandsynligvis på grund af en støchastisk manglende håndtag hæfteklammer i individuelle chassis strukturer8,28. - Under inkubationen fortyndes biotin-og fluorophore-mærket MTs 100x med RT Taxol-suppleret lysis-buffer, og Forbered en gel-filtrerings harpiks, der passer til størrelses udelukkelses kolonne kromatografi ved at følge proceduren skitseret nedenfor.
- Fjernelse af overskydende motorer fra motor-chassis konjugater ved størrelses udelukkelse kolonne kromatografi
- I et 50 mL konisk rør vaskes 5 mL gelfiltreringsharpiks 2x med 45 mL ddH2O. Bland harpiks med vand i det koniske rør for hver vask, og drej blandingen ved 460 x g i 1 min. kassér supernatanten og Gem harpiksen.
- Harpiks 2x vaskes med 45 mL 1x lysis-buffer (opskriften er beskrevet i tabel 5) med samme metode som beskrevet ovenfor.
- Resuspendere den vaskede harpiks i 1x lysis buffer i en 1:1 ratio, således at harpiksen bliver en ~ 50% gylle i buffer. Den vaskede harpiks kan opbevares ved 4 °C i mindst 1 måned.
- Overfør 800 μL af harpiks suspensionen til en spin kolonne. Dræne den overskydende buffer ved Gravity flow i 5 min. Fjern eventuelle resterende buffer med et 2 s spin på 1.000 x g. Den endelige harpiks volumen bør være omkring 350-400 μL.
- Motor-chassis blandingen fortyndes med kasein-Taxol-suppleret lyse buffer til et endeligt rumfang på 50 μL. Overfør den fortyndede blanding til spin søjlen pakket med harpiks.
- Centrifuge spin søjlen ved 1.000 x g for 6 s (denne gang er inklusive acceleration og deceleration tid). Saml de rene motor-chassis konjugater ved at gemme filtratet og kassere den kolonne, der bevarer de overskydende motorer.
- Klargøring af slides til billeddannelse
- Der gennemstrømnings 13 μL 1 mg/mL biotinyleret bovint serumalbumin (biotin-BSA) i et prøvekammer af glas. Inkuber i 2 min. for at tillade binding af BSA til glas.
- Vask kammeret 2x med 20 μL af RT DTT-suppleret BRB80 ved at flyde i bufferen på den ene side af kammeret og fugtspredende den overskydende væske væk fra den anden side ved hjælp af en strimmel filtrerpapir.
- Flow i 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin. Inkuber i 2 min for at tillade binding af streptavidin til biotin på BSA.
- Vask kammeret 2x med 20 μL af RT Taxol-suppleret lyse buffer.
- Flow forsigtigt i 20 μL af det fortyndede MTs med en skåret pipettespids. Inkuber i 2 min for at tillade binding mellem biotin på MTs og streptavidin.
- Vask 2x med 20 μL af RT Casein-Taxol-suppleret lyse buffer. Inkuber i 2 min. for at tillade, at kasein gennemsyrer hele kammeret.
- Fortynde de rensede motor-chassis konjugater 5x til 10x til enkelt-molekyle betingelser (~ 10-100 pM) med den kolde kasein-Taxol-suppleret lysis buffer. Bland følgende komponenter sammen for at fremstille en endelig blanding af motor og chassis: 10 μL af fortyndingen af motor chassiset, 5 μL 4X energimix og 5 μL 4X Scavenger-mix.
- Strømmen i 20 μL af den endelige motor-chassis blanding til analysen slide kammer og Fortsæt til TIRF mikroskopi.
- Billeddannelse og dataindsamling
- Billede diaset straks med et TIRF mikroskop. Typisk, hvert dias forbliver brugbar for mellem 30 og 60 min.
- Hent et stillbillede i MT-kanalen og en film i chassis kanalen. For motorerne i denne protokol, 10 min film med en frame rate på 0,5 fps og eksponeringstid på 200 MS er passende.
- Fra chassiset film, generere en kymograph for hver MT i ImageJ eller en lignende billedbehandling software29. Analyser hastigheder og løbe længder af motor-chassis ensembler ved at måle skråninger og horisontale afstande af kørsler på kymograph30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykkede rensninger af motorer og chassis konstruktioner blev analyseret af gel elektroforese. SDS-Sideanalyse bekræftede den vellykkede udvinding af dynein fra gær (figur 2), da det endelige filtrat indsamlet i trin 2.3.7 viste et klart, skarpt bånd ved positionen ~ 350 kDa. Som forventet var dette dynein-bånd fraværende fra strømning og Wash, der fjernede uønskede proteiner, og perlerne, hvorfra dynein blev kløvet. Observationen antyder, at IgG affinitet rensning og TEV proteasehæmmere spaltning var begge meget effektive. Desuden var TEV proteasehæmmere også til stede i det endelige filtrat og dannede et klart bånd ved ~ 50 kDa.
Den vellykkede MT affinitet rensning af dynein og kinesin proteiner blev også bekræftet med SDS-Sideanalyse (figur 3). Mens dynein dukkede op som et klart enkelt bånd ved ~ 350 kDa, dukkede kinesin op som en smule udtværing af flere bands på ~ 120 kDa, muligvis på grund af tilstedeværelsen af både phosphorylerede og defosforylerede former af protein14 og variable udbytter i oligo-mærkning. En sammenligning mellem dynein og kinesin-båndene før og efter denne MT affinitets rensning afslørede en reduktion i motorens koncentration, som indikeret af faldet i bånd intensiteten, hvilket sandsynligvis skyldtes fjernelsen af ikke-funktionelle motorer. På trods af reduktionen var koncentrationerne af motorer, der var tilbageholdt, tilstrækkelige til effektive TIRF assays. Ud over TEV protease var en mærkbar mængde Tubulin (~ 51 kDa) til stede i den endelige supernatant, sandsynligvis på grund af den gradvise nedbrydning af MTs under forsøget eller ufuldstændig fjernelse af det overskydende Tubulin gennem centrifugering. Den konsekvente motilitet af motor-chassis-ensembler, der er vist i TIRF assays, tyder dog på, at Tubulin og TEV proteasehæmmere ikke forstyrrer motoriske funktioner (Se figur 6).
Foldning af DNA origami strukturer blev analyseret af agrose gel elektroforese. Figur 4 skildrer resultaterne af en gel, der analyserer foldningen af et fleksibelt segmenteret chassis med 2 motor bindingssteder. Skiftet i mobilitet mellem den rene, ufoldede stilladser strand (Lane 1) og folde reaktionen (Lane 2) indikerer, at origami foldes. Desuden indikerer folde reaktionen i Lane 2 tilstedeværelsen af nogle multimerisering af chassis strukturer. Multimerisering opstår typisk, og kræver efterfølgende rensning af de velfoldede monomere strukturer. De uinkorporerede overskydende hæfteklammer var også synlige og viste en høj grad af mobilitet gennem gelen.
Foldede origami reaktioner blev renset for at fjerne overskydende uindarbejdet hæfteklammer og multimere af chassis struktur. Figur 5 viser resultaterne af en glycerol gradient rensning af et fleksibelt chassis med 7 motor bindingssteder. De tidlige fraktioner svarer til den lave glycerol tæthed i toppen af røret. De indeholder de overskydende hæfteklammer. De sene fraktioner svarer til de høje glycerol tætheer i bunden af røret og indeholder multimere og aggregater af foldede strukturer. I denne gel indikerer fraktion 7 en passende fraktion, der indeholder godt foldet monomere chassis. Bemærk, at den velfoldede struktur er isoleret fra både overskydende hæfteklammer og multimere. Mens denne gel er repræsentativ, og fraktion 7 ofte indeholder brugbart chassis, giver hvert rensnings eksperiment lidt forskellige resultater og fraktioner bør altid være analyseret for at afgøre, hvilken fraktion der er bedst til motilitet assays.
Den motilitet af motor-chassis ensembler er let detekterbare og målbare på kymografer genereret fra TIRF film. F. eks. viser kymografer (figur 6) i et fleksibelt chassis, der er konjugeret med syv dynein-proteiner ("7d"-ensembler), meget processive kørsler ved relativt ensartede hastigheder, hvilket viser, at ensembler var aktive og motile sædceller i rekonstitueret system, og at MT affinitet rensning med held fjernet de fleste af de ikke-funktionelle, immobile dyneiner, der kunne bremse eller stall ensembler. Det samme tirf eksperiment er blevet udført med succes på andre Chassistyper med forskellige compliance og motor numre for at afsløre virkningerne af disse faktorer på dynein teamwork8,9.
Figur 1: skematisk af slide analysekammeret. Dæksedlen sidder på toppen af to strimler af dobbeltsidet tape. Opløsninger er pipetteret i den ene side, og ekstraheret med filtrerpapir på den anden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: SDS-Sideanalyse af oprensning af dynein fra gær. Gærceller blev lyseres og centrifugeret til at indsamle lysatet (Lane 1), der indeholder totale opløselige proteiner. Affiniteten mellem IgG på kolonne perler og ZZ-tagget på den rekombinante dynein-konstruktion blev udnyttet til denne rensning. Gennemstrømningen (Lane 2) blev indsamlet fra blandingen af lyatet og perler efter det passeret gennem en kromatografikolonne. De dynein-bundne perler blev vasket med buffere, og den første vask med vaskebufferen (Lane 3) blev opsamlet. Dynein blev derefter konjugeret til et DNA-oligo. Efter TEV proteasespaltning udskilte centrifugering i en spin kolonne filtratet indeholdende dynein (Lane 4) og de resterende perler (Lane 5). Alle prøver indsamlet fra rensningen blev denatureret med 1x LDS prøve buffer og 1x reduktionsmiddel, og lastet på en 4-12% bis-Tris gel. Gelen blev kørt i 1x MOPS buffer på 200 V for ~ 1 h, og farvet med SYPRO Red protein gel bejdset til billeddannelse under UV-lys. Især det klare, skarpe bånd på ~ 350 kDa i Lane 4 indikerer tilstedeværelsen af koncentreret renset dynein i det endelige filtrat, mens bandet på ~ 50 kDa i samme Lane indikerer samtilstedeværelsen af TEV protease. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SDS-Sideanalyse af MT affinitet rensning af funktionelle dynein og kinesin proteiner. Kinesin og dynein renset fra gær (Lanes 1 og 3) blev blandet med polymeriseret MTs og ATP, og ultracentrifugering blev udført for at adskille de funktionelle motorer i Supernatanterne (Lanes 2 og 4) fra de ikke-funktionelle motorer, der co-pellet med MTs. Motor prøverne før og efter rensning blev denatureret med 1x LDS Sample buffer og 1x reduktionsmiddel, og lastet på en 4-12% bis-Tris gel. Gelen blev kørt i 1x MOPS buffer på 200 V for ~ 1 h, og farvet med SYPRO Red protein gel bejdset til billeddannelse under UV-lys. Intensiteten af motor båndene (~ 120 kDa for kinesin og ~ 350 kDa for dynein) syntes at falde efter MT affinitet rensning, hvilket indikerer en reduktion i motorens koncentrationer. Der var mærkbare koncentrationer af Tubulin og TEV proteasehæmmere i de efter rensende motor prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Agrose gel analyse af FOLDET DNA origami struktur. Foldede DNA origami strukturer er vurderet af gel elektroforese. Lane 1 er den rene, ufoldede stilladser streng, mens Lane 2 er produktet af folde reaktionen. Gel blev kørt på 70 V i et isvandbad i 90 min i 0,5 x TBE-buffer suppleret med 11 mM MgCl2. Et skift i mobilitet indikerer origami foldning. Unincorporated hæfteklammer og chassis multimere var også synlige i Lane 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Agrose gel analyse af glycerol gradient oprensning af DNA origami chassis. Kvaliteten af glycerol gradient rensning kan bestemmes ved gel elektroforese af fraktioner fra centrifuge gradient. Lave antal fraktioner er fra toppen af røret og svarer til lav densitet af glycerol. Højt nummererede fraktioner er fra bunden af røret og svarer til høje tætheder af glycerol. De overskydende hæfteklammer, monomere chassis og multimerisk chassis er alle synlige. Fraktion 7 indeholder chassis egnet til TIRF mikroskopi, da de er monomeriske og overskydende hæfteklammer er fraværende. Gel blev kørt på 70 V i et isvandbad i 120 min i 0,5 x TBE-buffer suppleret med 11 mM MgCl2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kymografer viser motilitet af dynein-chassis ensembler på enkelt MTs. Dynein proteiner udvundet fra gær og renset med MTs blev konjugeret til fleksible chassis strukturer. Hvert chassis havde syv bindingssteder for dynein og dannede et "7D" Ensemble. Bevægelsen af disse ensembler på MTs blev indspillet i en 10 min film (200 MS eksponering, 0,5 fps) under en TIRF-analyse. Kymografer fra to MTs blev genereret fra denne film i ImageJ ved at spore langs en enkelt MT. De lodrette og vandrette røde bjælker i øverste venstre hjørne af hvert billede angiver henholdsvis 2 min og 20 μm. Hver lyse linje registrerer bevægelsen af en ensemble, med den inverse af hældningen angiver hastigheden og horisontal forskydning indikerer løbelængde. Med TIRF assays og kymografi bliver motilitet af motor-chassis ensembler let detekterbar og direkte målbare. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Buffer navn | Sammensætning | Trin (r), der anvendes | Kommentar |
5x lysis buffer | 150 mM HEPES (pH 7,4) | - | Filter Steriliser bufferen. Det kan opbevares ved RT i en korrekt forseglet beholder i et år. |
250 mM Kacetat | |||
10 mM Mgacetat | |||
5 mM EGTA (pH 7,5) | |||
50% glycerol | |||
4X lysis buffer med kosttilskud | 4X lysis buffer | 2.1-2.2 | Gør denne 4X buffer fra 5x lysis buffer ovenfor. Forbered en buffer uden PMSF først, og tilsæt forbindelsen (opløst i ren ethanol) til en lille alikvot af bufferen lige før hvert trin, der kræver det. |
4 mM DTT | |||
0,4 mM mg-ATP | |||
2 mM PMSF | |||
Vask buffer | 1x lysis buffer med kosttilskud | 2,2 | For at gøre bufferen, tilsæt KCl, Triton X-100, og ddH2O til 4X lysis buffer med DTT og mg-ATP, men Tilføj ikke pmsf indtil lige før brug. |
250 mM KCl | |||
0,1% Triton X-100 | |||
5x TEV buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) | - | Filter Steriliser bufferen. Det kan opbevares ved RT i en korrekt forseglet beholder i et år. |
150 mM KCl | |||
10% glycerol | |||
1x TEV buffer | 1x TEV buffer | 2.2-2.3 | For at gøre bufferen, tilsæt DTT, mg-ATP, Triton X-100, og ddH2O til 5x Stock TEV buffer, men Tilføj ikke pmsf indtil lige før brug. |
1 mM DTT | |||
0,1 mM mg-ATP | |||
0,1% Triton X-100 | |||
0,5 mM PMSF |
Tabel 1: buffere til IgG-affinitet rensning af motor proteiner fra gærceller (protokol afsnit 2).
Buffer navn | Sammensætning | Trin (r), der anvendes | Kommentar |
5x BRB80 | 400 mM rør | - | Filter Steriliser bufferen. Det kan opbevares ved RT i en korrekt forseglet beholder i et år. |
10 mM MgCl2 | |||
5 mM EGTA | |||
Justér pH til 6,8 med KOH | |||
1x BRB80 med kosttilskud | 1x BRB80 | 3,3 & 4.1-4,2 | Skal være frisklavet af 5x BRB80 bestanden for hvert eksperiment. |
20 μM Taxol (opløst i DMSO) | |||
1 mM DTT | |||
2x Polymeriserings blanding | 2x BRB80 (uden tillæg) | 3,3 | Flash fryse blandingen i små aliquoter og opbevares ved-80 oC. |
2 mM DTT | |||
2 mM mg-GTP | |||
20% DMSO | |||
Rekonstitutionsbuffer | 1x BRB80 (uden tillæg) | 3,1 | Skal være frisklavet til hvert eksperiment. |
1 mM DTT | |||
1 mM mg-GTP |
Tabel 2: buffere til polymerisering af mikrotubuler (protokol afsnit 3).
Buffer navn | Sammensætning | Trin (r), der anvendes | Kommentar |
Taxol-suppleret lysisbuffer | 1x lysis buffer | 4,1 | Skal være frisklavet til enhver rensning. |
20 μM Taxol (opløst i DMSO) | |||
1 mM DTT | |||
5x ATP/Taxol mix | 1x lysis buffer | 4,2 | Skal være frisklavet til enhver rensning. |
25 mM mg-ATP | |||
50 μM Taxol (opløst i DMSO) | |||
5 mM DTT |
Tabel 3: buffere til mikrotubulær affinitet rensning af funktionelle motor proteiner (protokol afsnit 4).
Buffer navn | Sammensætning | Trin (r), der anvendes | Kommentar |
20x origami folde buffer | 100 mM Tris pH 8,0 | - | Kan opbevares ved RT i en korrekt forseglet beholder i op til et år. |
20 mM EDTA | |||
200 mM MgCl2 | |||
1x origami folde buffer | 5 mM Tris pH 8,0 | 5.1-5,2 | Gør bufferen frisk ved at fortynde 20x bestanden med ddH2O før hvert eksperiment. |
1 mM EDTA | |||
10 mM MgCl2 | |||
0,5 x TBE | 45 mM TrispH 8,0 | 5.1-5,2 | Kan opbevares ved RT i en korrekt forseglet beholder i op til et år. |
45 mM borsyre | |||
1 mM EDTA |
Tabel 4: buffere til produktion af segmenteret DNA origami-chassis (protokol afsnit 5).
Buffer navn | Sammensætning | Trin (r), der anvendes | Kommentar |
DTT-suppleret BRB80 | 1x BRB80 | 7,3 | Skal være frisklavet før hvert TIRF eksperiment. |
1 mM DTT | |||
Taxol-suppleret lysisbuffer | 1x lysis buffer | 7,1 & 7,3 | Skal være frisklavet før hvert TIRF eksperiment. |
20 μM Taxol (opløst i DMSO) | |||
1 mM DTT | |||
Kasein-Taxol-suppleret lysisbuffer | 1x lysis buffer | 7.1-7.3 | Skal være frisklavet før hvert TIRF eksperiment. |
20 μM Taxol (opløst i DMSO) | |||
1 mM DTT | |||
~ 2,5 mg/ml Casein (opløst i Tris-HCl ved pH 8,0) | |||
1x lysis buffer | 30 mM HEPES (pH 7,4) | 7,2 | Gør denne buffer frisk ved at fortynde 5x bestanden (opskrift beskrevet i tabel 1) med ddH2O. |
50 mM Kacetat | |||
2 mM Mgacetat | |||
1 mM EGTA (pH 7,5) | |||
10% glycerol | |||
4X energimix | 22,5 μL 1x kasein-Taxol-Supplemenfted lyse buffer | 7,3 | Skal være frisklavet før hvert TIRF eksperiment; de angivne mængder er for et endeligt volumen på 25 μL. |
1 μL 0,1 M mg-ATP | |||
1 μL 40% glucose | |||
0,5 μL β-mercaptoethanol | |||
4X Scavenger mix | 24 μL 1x kasein-Taxol-suppleret lysisbuffer | 7,3 | Skal være frisklavet før hvert TIRF eksperiment; de angivne mængder er for et endeligt volumen på 25 μL. |
1 μL 1x oxygen Scavenger system |
Tabel 5: buffere og blandinger til motor ensemble motilitet tirf-assay (protokol afsnit 7). Detaljer om oxygen Scavenger-systemet, der bruges til at lave Scavenger-blandingen, kan findes andetsteds17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De molekylære konstruktionsteknikker for DNA-origami giver en unik måde at konstruere motor ensembler med definerede arkitekturer, motor numre og typer, der muliggør undersøgelser af, hvordan emergent opførsel opstår fra specifikke motorkonfigurationer31. Som strukturelle og cellulære undersøgelser fortsætte med at belyse eksempler på cytoskelet motorer arbejder i teams, teknikker til isolering og undersøge de biofysiske og biokemiske mekanismer af motorer i ensembler vokser i nytte. For eksempel har Cryo-EM vist, at dynactin kan binde 2 individuelle dynein-motorer, og at sådanne parringer har forskellig motilitet end de enkelte motorer10. Desuden blev DNA-baseret konstruktion brugt til at afgøre, om pattedyr dynein, når den aktiveres af dynactin og bicD2, kunne matche kraften i kinesin-1 i et tovtrækkeri scenarie14. I en anden blandet motorisk undersøgelse blev DNA-origami brugt til at afkoble virkningerne af modsatte polaritet motorer og deres regulerende bindende proteiner ved rumligt adskille dem på en origami struktur15. Da der findes flere strukturelle og regulatoriske determinanter for motilitet, bør DNA-origami-baserede teknikker være nyttige til bestemmelse af de specifikke biokemiske og biofysiske bidragydere til den emergente motilitet af motor ensembler. De molekylære konstruktionsteknikker, der er aktiveret af DNA-origami er især nyttige, fordi de emergente fænomenologiske resultater af ensembler er svære at forudsige. Dette skyldes til dels de utallige faktorer, der bidrager til motilitet af de enkelte motorer i ensemblet5,6,31.
Eksempler på vores tidligere strukturer omfatter monolitiske stænger og segmenterede stænger med variabel stivhed. Nuværende indsats udforske sfæriske strukturer samt25. Andre har beskæftiget morfologier såsom planar strukturer og stænger22,24. På samme måde kan forskellige typer motorer bindes til den samme chassis struktur7,14,15,18ved hjælp af motor håndtag med ortogonale DNA-sekvenser. Denne fremgangsmåde gør det muligt at gennemføre undersøgelser af de modstridende handlinger af dyneiner og kinesiner, minus-og plus-end-rettede kinesiner og minus-og plus-end-styrede myosins. Det giver også mulighed for indførelse af en mutant blandt ellers vild-type ensembler, så de specifikke biokemiske bidragydere til den emergent motilitet skal dechiliseret7. På grund af evnen til at binde flere fluorophorer til hver enkelt struktur, Imaging i TIRF og efterfølgende analyse af kymografi eller partikel sporing er mulig. Tidligere rapporter viser analyse af kymografi data og statistisk evaluering af chassis konstruktioner med variabel overholdelse8. Mens cytoskelet motorer har vist sig at være en spændende tidlig anvendelse af DNA-origami som en molekylær eksperimental32, andre proteiner og protein systemer vil også drage fordel af disse metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker K. Chau, J. Morgan og A. driller-Colangelo for at bidrage til teknikkerne i det segmenterede DNA origami-chassis. Vi takker også tidligere medlemmer af reck-Peterson og Shih laboratorier for nyttige diskussioner og bidrag til den oprindelige udvikling af disse teknikker. Vi takker J. Wopereis og Smith College Center for Microscopy and Imaging og L. Bierwert og Smith College Center for Molecular Biology. Vi anerkender taknemmeligt NSF MRI-programmet for erhvervelse af et TIRF mikroskop.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
ProTev Protease | Promega | V6101 | |
Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).