Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60369
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Sciences, Smith College, 2Center for Microscopy and Imaging, Smith College

Summary

Målet med detta protokoll är att bilda ensembler av molekylära motorer på DNA origami nanostrukturer och observera helheten motilitet med hjälp av total inre reflektion fluorescens mikroskopi.

Abstract

Cytoskeletala motorer är ansvariga för en mängd olika funktioner i eukaryotiska celler, inklusive Mitos, Last transport, cellulära motilitet, och andra. Många av dessa funktioner kräver motorer för att fungera i ensembler. Trots en mängd kunskap om mekanismerna för enskilda cytoskeletala motorer, jämförelsevis mindre är känt om mekanismerna och framväxande beteenden av motor ensembler, exempel på som inkluderar förändringar av Ensemble processivitet och hastighet med ändra motornummer, plats och konfiguration. Strukturell DNA nanoteknik, och den specifika tekniken av DNA origami, möjliggör molekylär konstruktion av väldefinierade arkitekturer av motor ensembler. Formen på Last strukturer samt typ, antal och placering av motorer på strukturen kan alla styras. Här ger vi detaljerade protokoll för att producera dessa ensembler och observera dem med hjälp av total inre reflektion fluorescens mikroskopi. Även om dessa tekniker har specifikt tillämpats för cytoskeletala motorer, metoderna är generaliserbara till andra proteiner som samlas i komplex för att utföra sina uppgifter. Sammantaget, DNA origami metoden för att skapa väldefinierade ensembler av motorproteiner ger ett kraftfullt verktyg för dissekera de mekanismer som leder till framväxande motila beteende.

Introduction

Dynein och kinesinet är cytoskeletala motorproteiner som ansvarar för otaliga funktioner i eukaryotiska celler1. Genom att omvandla den kemiska energin av ATP hydrolys till produktivt arbete, dessa motorer translocate på mikrotubuli att dra och distribuera olika intracellulära Cargos. De samordnar också i den massiva intracellulära rearrangemang i samband med Mitos, där de uppvisar orkesyrade krafter som bidrar till positionering och separation av kromosomer. Strukturella, biokemiska och biofysiska analyser, inklusive enstaka molekyl observationer, har avslöjat mekanismerna för dessa motorer på individnivå (väl granskade i tidigare verk2,3,4). Men många av motorns uppgifter kräver att de arbetar i små ensembler av både liknande och blandade motortyper. Jämförelsevis mindre förstås om de mekanismer som samordnar verksamheten och ultimata framväxande motilitet av dessa ensembler5,6. Denna kunskapsklyfta beror delvis på svårigheten att skapa ensembler med kontrollerbara funktioner, såsom motor typ och kopierings nummer. Under det senaste decenniet har de molekylära konstruktions teknikerna för DNA-origami använts för att lösa detta problem. För mikrotubule baserade motorer, några exempel på dessa undersökningar omfattar enstaka molekyl observationer av ensembler av cytoplasmiska dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, olika kinesinmotorer12,13, och blandningar av både dyneiner och kinesins7,14,15. Här ger vi Detaljer om rening och oligonukleotid märkning av motorer från jäst7,16,17,18,19,20, vikning och rening av segmenterad DNA origami med avstämbara överensstämmelse8, och avbildning av jästmotorer driver chassi strukturer7,18.

Konstruera motor ensembler för in vitro enda molekyl observation kräver tre primära ansträngningar. Den första är uttrycket, rening och märkning av motorkonstruktioner som lämpar sig för att fästa till DNA origami. Den andra är produktion och rening av definierade DNA origami strukturer (kallas ofta "chassi"). Och den tredje är konjugering av motorerna till chassi strukturen följt av observation med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Här tillhandahåller vi etablerade protokoll för denna process för rekombinanta Microtubule-baserade motorer renas från jästen Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. DNA origami-baserade motor ensembler har undersökts med hjälp av både rekombinant kinesinet15 och dynein7,8,18 konstruktioner som produceras i denna jäst Expression system16 ,17,18,19. Detta protokoll är giltigt för dessa konstruktioner, med tanke på att de styrs av galaktos inducerad promotor, och smält till samma proteintaggar för rening (ZZ och TEV proteashämmare Linker) och för DNA oligo konjugation (SNAPtag).

Specifika jäststammar producerar specifika motorkonstruktioner. Till exempel, den dynein som används för att studera betydelsen av Last överensstämmelse renades från stam RPY10847,8. I allmänhet kan stammar som innehåller motorkonstruktioner med lämpliga genetiska modifikationer för uttryck och rening begäras från de laboratorier som har publicerat användningen av dessa motorer. Konstruktioner med nya attribut såsom mutationer eller taggar kan göras med hjälp av rekombinanta genetiska tekniker, såsom litiumacetat Transformation21 och kommersiella kit. Detaljerade protokoll för att skapa modifierade motorproteiner i jäst för enstaka Molekylstudier har publicerats19. Förutom att motorerna är smält till SNAPtag, de oligos används för att märka motorerna måste konjugerat till SNAP substrat, benzylguanine (BG); tidigare publicerade protokoll beskriver bildandet och reningen av BG-oligo-konjugaterna18. Den övergripande strategi som beskrivs här har också använts för Actin-baserade motorer (se tidigare verk för exemplen22,23,24) och motorer som renats från andra organismer och uttrycks system (se tidigare fungerar för exempel7,9,10,11,12,13,14).

Polymeriserade mikrotubuli (MTs) används i dessa experiment i två olika procedurer. MT affinitetsrening av funktionella motorer kräver MTs som inte är märkta med andra funktionella grupper, medan motorn-Ensemble motilitet TIRF analysen kräver MTs märkt med biotin och fluoroforer. I samtliga fall, MTs stabiliseras med Taxol att förhindra denaturering. MT affinitetsrenings steget används för att avlägsna alla icke-motila motorer med hög MT-affinitet, eftersom dessa motorer kan förändra ensemblen motilitet om konjugerat till ett chassi. Under denna process, aktiva motorer Unbind MTs och förbli i lösning, medan tight-bindande motorer snurra ner i MT pelleten. Detta bidrar till att säkerställa att alla motorer på chassit är från en aktiv population.

En mängd olika DNA origami strukturer har använts för att studera cytoskelett motor ensembler. Eftersom mekanistisk förståelse av Ensemble transport har ökat, DNA origami strukturer som används i experiment har vuxit i komplexitet. I princip kan varje struktur anpassas för detta ändamål, förutsatt att den ändras så att den omfattar ensträngade DNA-fästplatser för motorer och fluorofoforer. Specifika chassi mönster och attribut kan vara användbart för att sondera särskilda frågor om det framväxande beteendet hos motorer ensembler. Till exempel har stela stavar använts för att utveckla grundläggande kunskaper om hur kopierings nummer påverkar transport av grupper av dyneiner och kinesins7,15,18och 2D-plattformar har använts för att studera myosin Ensemble Navigation av aktin Networks22. Strukturer med variabel eller avstämbar flexibilitet har använts för att förstå rollerna av Elastisk koppling mellan motorer och att söka hur stegning synkronisering påverkar motilitet8,24. På senare tid, sfäriska strukturer används för att få insikt i hur geometriska begränsningar för motor-Track bindning påverka dynamiken i motilitet25.

I detta protokoll erbjuder vi specifika steg för Ensemble experiment på segmenterat chassi med variabel styvhet. Bindningsställen på chassit kallas ibland "handtag", medan kompletterande DNA-sekvenser som binder dessa handtag kallas "antihandles". Antalet motorer på dessa chassi bestäms av vilka segment som innehåller utökade handtag häftklamrar med komplementaritet med antihandle oligo på oligo-märkta motorer. Genom att använda olika handtags sekvenser på olika segment kan man binda olika typer av motorer till specifika platser på chassit. Chassit beskrivs här består av 7 sekventiella stela segment, vardera består av 12 dubbelsträngade DNA alfahelixar arrangerade i 2 koncentriska ringar8. De stela segmenten innehåller motor handtagen och ansluts genom regioner som kan vara antingen flexibla enkelsträngade DNA eller stela dubbelsträngade DNA, beroende på frånvaron eller närvaron av "länkare" häftklamrar. Överensstämmelsen av chassi strukturen bestäms således av närvaron eller frånvaron av dessa "länkare" häftklamrar. Se tidigare rapporter för mer information och specifika DNA-sekvenser8. Dessutom kan flera metoder användas för att rena chassi26. Den kurs-Zonal glycerolgradientcentrifugering metod27 beskrivs här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tillväxt, uttryck och skörd av motorproteiner som styrs av en galaktoinducerad promotor

  1. Med hjälp av en jäst-Peptone-dextros (YPD) kultur plattan och en steril vaccinera pinne, strimma önskade frysta jäst stam och inkubera för 3-4 dagar vid 30 ° c.
  2. Dag 1 av kultur tillväxt: på eftermiddagen, tillsätt 10 mL av YP kultur media med 2% dextros till en 1 "diameter glas kultur röret och Inokulera det med en enda koloni från plattan. Växa i en snabbt roterande rulltrumma vid 30 ° c över natten.
  3. Dag 2: på eftermiddagen överför du 10 mL av kulturen till en 250 mL kolv som innehåller 50 mL YP-kulturmedia med 2% raffinose. Inkubera över natten vid 30 ° c medan du skakar vid 250 rpm i orbitalskak.
  4. Dag 3: på eftermiddagen, överföra 60 mL av kulturen till en 3 L kolv innehållande 1 L av YP kultur media med 2% galaktos. Inkubera över natten vid 30 ° c medan du skakar vid 250 rpm i orbitalskak.
  5. Dag 4: med början i mitten av morgonen, övervaka den optiska densiteten (OD) av kulturen vid 600 Nm varje 2 h. När kulturen är mellan en OD 1,5 och 2, Fortsätt med följande steg för att skörda cellerna. Skörd utanför detta OD-intervall kan minska avkastningen på grund av lågt antal celler före OD 1,5, eller cellulär quiescens och proteinnedbrytning över OD 2.
  6. Dekanera cellkulturen i Centrifugera flaskor och snurra på ~ 6200 x g vid 4 ° c för 8 min. Häll av supernatanten och kassera.
  7. Omsuspendera cellpelleten i flaskan med dubbeldestillerat H2o (DDH2o).
  8. Snurra cellerna på ~ 6200 x g vid 4 ° c för 8 min. Häll av supernatanten och kassera.
  9. Beroende på viskositeten hos cellpelleten, tillsätt upp till 2 mL ddH2O för att skapa en lösningsvätska tillräckligt för pipettering.
  10. Med hjälp av en motoriserad pipett styrenhet försedd med en 10 ml pipett, sakta fördela cell flytgödsel i flytande kväve en droppe i taget. Detta kommer att producera frysta pellets av jästceller.
  11. Förvara de frusna cellerna vid-80 ° c tills de är redo att rena.

2. rening av motorproteiner från jästceller

  1. Cell Lys och lösligt protein utvinning
    1. Bered 1 mL av en färsk lösning på 0,1 M PMSF i ren etanol. Vänta med att lägga till PMSF till vattenhaltiga buffertar eftersom det är instabilt i vatten; också, undvika exponering för vatten tills inom 20 min (den ungefärliga halveringstiden för PMSF i vatten) av användning.
    2. Förbered 50 mL av 4x lysis buffert på is med tillägg från 5x lager av lysis buffert, men inte lägga PMSF förrän strax innan bufferten appliceras på jästpelleten.
    3. Slipa flytande kväve-fryst jäst pellets till ett fint pulver med en blad-typ kaffekvarn som har förkyld med flytande kväve.
      Anmärkning: detta protein utvinning börjar vanligtvis med cellen pellet skördas från 2 L jäst kultur. Utgångsbeloppet för jästkulturen kan justeras upp eller ner med motsvarande justeringar av volymerna av IgG-pärlor och DNA-oligos i steg 2.2.2 och 2.3.1 nedan.
    4. Aliquot 15 mL av 4x lysis buffert med DTT och mg-ATP på is och tillsätt PMSF till bufferten för att uppnå en slutlig koncentration av 2 mM, slutföra beredningen av 4x lysis buffert med kosttillskott.
    5. Samla jästpulvret i en pre-kyld ~ 100 mL glasbägare på is. Tillsätt en liten volym av 4x lysis buffert med tillskott i pulvret så att den slutliga koncentrationen av bufferten inte överstiger 1x. Typiskt, tillsätt ~ 1,5 mL av bufferten för varje 10 mL jästpulver.
    6. Snabbt Tina pulvret till vätskefasen genom att placera bägaren i en 37 ° c vattenbad med ständig omrörning med hjälp av en spatel.
    7. Placera bägaren av lysate tillbaka på isen omedelbart efter upptining, uppskatta lysate volymen med hjälp av en 50 mL koniskt rör, och tillsätt mer 4x lysis buffert med kosttillskott så att den slutliga koncentrationen av bufferten är ~ 1x. Typiskt, 2 L jäst kultur ger totalt 25-35 mL lysat som innehåller 1x lyseringsbuffert.
    8. Fördela lysatet jämnt för att Centrifugera flaskor på is. Noggrant balansera flaskorna till en massa skillnad inte mer än 0,01 g mellan varje par, se till att varje flaska är över den minsta volym som krävs för att förhindra Flask kollaps. Centrifugera vid ~ 290 000 x g i 25 minuter vid 4 ° c.
    9. Samla supernatanten som innehåller lösliga proteiner i ett 50 mL koniskt rör på is, och kassera pelleten som innehåller cellfragment och stora organeller. Undvik att samla några grumliga delar av supernatanten, eftersom de kan täppa till gravitation-flödeskolonnen som används i efterföljande steg. Spara 10 μL av supernatanten för analys av SDS-sidor.
  2. IgG affinitetsrening
    1. Under snurrande ovan, ställa in en gravitation-flödeskromatografi kolumn på is eller i ett kallt rum.
    2. Överför 200 μl 50% IgG affinitetspärla flytgödsel till kolonnen med hjälp av en P-1000 pipettspetsen skuren med ett rakblad för att förstora diametern på sin ingångsport. Vid rening av mer eller mindre än 2 liter cell odlings pellets, justera volymen av pärlslam proportionellt, med en minsta volym på 100 μL.
    3. Aliquot ytterligare 15 mL av 4x lysis buffert med DTT och mg-ATP och tillsätt PMSF till bufferten för att uppnå en slutlig koncentration av 2mM. Späd 4x buffert på is till 1x genom att lägga ddH2O.
    4. Tvätta pärlorna 2x med 5 mL 1x lyseringsbuffert med kosttillskott.
    5. Omsuspendera pärlorna i 200 μL 1x lysis buffert med kosttillskott.
    6. Tillsätt pärlfjädringen till det proteinextrakt som erhålls från centrifugering och inkubera blandningen vid 4 ° c i 1 h med varsam rotation.
    7. Förbered 25 mL av tvättbufferten under inkuberingen (recept som anges i tabell 1) på is och 50 ml 1x TeV-buffert (recept detaljerat i tabell 1) på is.
    8. Efter 1 h inkubering, filtrera lysate-pärla blandningen på is eller i det kalla rummet genom samma kromatografi kolumn som används i steg 2.2.2 ovan. Spara 10 μL genomflöde för analys av SDS-sidor.
    9. Tvätta de återstående motor bundna pärlorna på Ice 2x med 5 mL tvättbuffert. Spara 10 μL av den första tvättningen för analys av SDS-sidor.
    10. Tvätta pärlorna på isen en gång med 5 mL 1x TEV-buffert. Låt bufferten rinna helt från kolonnen.
  3. Märkning med DNA oligonukleotides och TEV klyvning
    1. Ta bort kromatografikolonnen från inställningen och locket botten av kolonnen. Inom samma kolonn, inkubera motor-pärlor med 100 μL av 1x TEV-buffert som innehåller 10-20 μM av den renade BG-oligo i rumstemperatur (RT) för 10-15 min. Vid rening av mer eller mindre än 2 liter cell odlings pellets, justera volymen av 1x TEV-buffert och renad BG-oligos proportionellt. Öka inkubationstiden enligt tillverkarens anvisningar om det behövs för att öka avkastningen och hastigheten på motor märkning, men tänk på att längre inkubationstider kan också öka andelen dysfunktionella motorer på grund av protein denaturering vid RT.
    2. Försiktigt Omsuspendera pärlorna varje minut av inkubationen.
    3. Tvätta den märkta motor-pärlor 4x med 4 mL 1x TEV buffert med samma kromatografi kolumn och inställning som tidigare. Låt den slutliga tvätten rinna helt ur kolonnen.
    4. Locket botten av kolonnen, Omsuspendera motor-pärlor i högst 200 μL av 1x TEV buffert, och överföra till en 2 mL rund-botten microcentrifug röret.
    5. Inkubera suspensionen med ~ 0,3 enheter av TEV-proteas per μL av motor pärlblandningen vid 16 ° c i 1 h med milda rotationer. Röret bör monteras för att minimera den totala ytan av röret som pärlorna kommer i kontakt med.
    6. Centrifugera röret i en mikrocentrifug vid 21 130 x gram för 30 s i ett kallt rum för att koncentrera blandningen i botten av röret.
    7. Fortfarande i det kalla rummet, Använd en cut P-1000 pipettspetsen för att överföra blandningen till en snurrande kolumn och centrifugera vid 21 130 x g för 30 s. samla upp filtratet som innehåller de TeV-klyvbara, renade motorerna. TEV-proteasen kommer att finnas i filtratet och motorerna.
    8. Spara 10 μL av filtratet för analys av SDS-PAGE. Alikvot återstående filtratet i volymer om 2 μL för TIRF-experiment eller 50 μL för rening av mikrotubule tillhörighet. Blixten fryser alikvoter i flytande kväve och förvara vid-80 ° c.
    9. Omsuspendera de pärlor som återstår i filtret i 1x TEV buffert för SDS-PAGE analys. Använd samma volym 1x TEV-buffert som i steg 2.3.4 ovan.

3. mikrotubule (MT) polymerisation

  1. Beredning av tubulin blandningar för tirf analyser
    1. I ett kallt rum, separat upplösa den frystorkade tubulin av varje typ (omärkt bovint tubulin, en tubulin, och fluorescerande tubulin) i rekonstitutionsbuffert (recept som beskrivs i tabell 2) för att göra en slutlig koncentration av 10 mg/ml. Låt sitta på is i 10 min.
      1. Blanda följande komponenter och låt sitta på is i 10 min i det kalla rummet (slutliga koncentrationer indikeras parentetiskt): 18 μL av bovint tubulin (~ 8,2 mg/mL), 2 μL biotinylerad tubulin (~ 0,9 mg/mL), och 2 μL fluorescerande tubulin (~ 0,9 mg/mL).
    2. Bered 3 μL alikvoter av tubulinblandningen och blixt frysningen i flytande kväve. Förvara blandningarna vid-80 ° c.
  2. Beredning av tubulin för MT affinitetsrening av motorer
    1. Lös upp frystorkat bovint tubulin i ett kallt rum i rekonstitutionsbufferten för att göra en slutlig koncentration på 10 mg/mL. Låt sitta på is i 10 min.
    2. Bered 3 μL alikvoter av tubulinblandningen och blixt frysningen i flytande kväve. Förvara blandningarna vid-80 ° c.
  3. Polymerisation av tubulin till MTs
    1. Ta bort en 3 μL alikvot av tubulin från-80 ° c frysen och mycket snabbt och hastigt Tina till vätskefasen genom att hålla i botten av röret. Omedelbart placera på is och inkubera i minst 3 min.
    2. Försiktigt Layer 3 μL av 2x polymerisation mix (recept som beskrivs i tabell 2) ovanpå tubulin lösningen. Blanda genom att försiktigt snärta röret, men blanda inte med pipettering, eftersom skjuvkrafter kan störa MT nukleation och tsträckning.
    3. Inkubera blandningen i ett vattenbad vid 37 ° c i 30 min.
    4. Försiktigt Layer 6 μL av RT 1x BRB80 med kosttillskott (recept som beskrivs i tabell 2) ovanpå och blanda genom att snärta. Blanda inte med pipettering.
    5. Inkubera blandningen vid 37 ° c i minst 10 min.
    6. Fortsätt till MT affinitetsrening, eller om du gör TIRF analyser, inkubera MTs i mörkret vid RT över natten för att bilda längre MTs.
    7. Förvara polymeriserade MTs i veckor i mörker vid RT.

4. mikrotubule (MT) affinitetsrening

  1. Avlägsnande av opolymeriserade tubuliner genom centrifugering
    1. Blanda följande komponenter för att göra en 60% glycerol kudde: 1x BRB80 (utan kosttillskott; recept som beskrivs i tabell 2), 20 ΜM Taxol (upplöst i DMSO), 1 mm DTT och 60% glycerol.
    2. Överför 60 μl av glycerolkudden till ett första-rör. Försiktigt lager 12 μL av omärkta MTs polymeriseras tidigare ovanpå kudden. För att förhindra klippning av MTs, överför dem med en skuren pipettspets.
    3. Centrifugera blandningen vid ~ 97 300 x g vid 22 ° c i 15 min. Efter snurrande, överskottet tubuliner kvar i det översta vätskeskiktet, medan MTs bildar en pellet i botten. Markera den yttre kanten av röret före snurrande för att lokalisera pelleten, eftersom pelleten kanske inte syns med blotta ögat.
    4. Ta försiktigt bort vätskeskiktet (~ 12 μL) ovanför glycerolkudden och spara 10 μL för analys av SDS-PAGE.
    5. Skölj försiktigt av gränssnittet mellan vätskeskiktet och kudde med 20 μL 1x BRB80 med kosttillskott. Ta bort och kassera 20 μL sköljning.
    6. Ta försiktigt bort glycerolkudden (~ 60 μL) och spara 10 μL för analys av SDS-PAGE. Var noga med att inte störa MT pelleten.
    7. Skölj försiktigt av pelleten med 60 μL 1x BRB80 med tillägg (recept specificerat i tabell 2). Var noga med att inte störa MT pelleten. Kassera Sköljlösningen.
    8. Omsuspendera MT-pelleten i 24 μL Taxol-kompletterad lyseringsbuffert (recept specificerat i tabell 3) med en avskuren pipettspets.
  2. Rening av funktionella motorer med MT-baserad affinitetskromatografi
    1. Ta bort 2 50 μL alikvoter av motorer renas från jäst från-80C frysen och snabbt Tina till vätskefasen. Omedelbart plats på isen.
    2. Lägg till följande komponenter i ett nytt första-rör i angiven ordning och inkubera blandningen vid RT under 10 min: (1) 100 μl av motorerna som renas från jäst, (2) 29 μl 5x ATP/Taxol-blandning (recept specificerat i tabell 3), sedan (3) 12 μl renat MTS Tran sferred med en skuren pipettspets.
    3. Centrifugera blandningen vid ~ 97 300 x g och 22 ° c i 15 min. Efter spin, funktionella motorer kvar i supernatanten, och MTs bildar en pellet, tillsammans med de icke-funktionella motorer bundna till dem.
    4. Samla supernatanten, blixt frysa i 2 μL alikvoter, och förvara vid-80 ° c.
    5. Spara 10 μL av supernatanten för analys av SDS-sidor. Omsuspendera pelleten i 141 μL 1x BRB80 för analys av SDS-PAGE. Använd protein standarder, såsom Actin, för att skapa en standardkurva för att kvantifiera koncentrationen av de renade motorerna som tidigare detaljerade17.
    6. Använd denna koncentrations information när du konjugerar motorer till chassit i steg 6.1.3.

5. produktion av segmenterad DNA origami chassi

  1. Bildandet av chassi
    1. Beställ den stapelvara oligonukleotides som listas i tidigare publicerade tabeller8 i 96 väl plattor våta vid 250 ΜM i Tris buffert, eller torka och sedan Omsuspendera dem till 250 ΜM med Tris buffert.
    2. Skapa en pool av kärnan häftklamrar genom att blanda 5 μL av varje kärna stapelvara (se tabell S1 i Driller-Colangelo 20168).
    3. Skapa en pool av länkaren häftklamrar genom att blanda 5 μL av varje länkare stapelvara (se Linker stapelvara tabell i Driller-Colangelo 20168).
    4. Skapa en pool av den fluorophore bindande häftklamrarna genom att blanda 5 μL av varje fluorophore handtag häftklammer (se fluorophore handtag tabell i Driller-Colangelo 20168).
    5. Blanda 50 μL hopfällbara reaktioner med följande komponenter: 1x hopfällbar buffert; 100 nM 8064 byggnadsställning; 600 nM kärna baspool; 600 nM fluorophore Staple pool; 9 μM fluorophore strand (se fluorophore antihandle tabell i Driller-Colangelo 20168); för varje motor bindnings plats, antingen 4,2 μM Extended handtag strängar eller 600 nM trådar utan handtag som önskas (se motor handtag/antihandle häftklamrar tabellen i Driller-Colangelo 20168); 600 nM Linkers enligt önskemål8; ytterligare 6 mM MgCl2; och vatten.
    6. Vik i en termisk apparat med hjälp av följande program: snabb uppvärmning till 80 ° c, kylning i en grad steg till 65 ° c över 75 min, sedan ytterligare kylning i en grad steg till 30 ° c över 17,5 h.
    7. Assay Folding kvalitet på en 2% aguppstod gel i 0,5 x TBE buffert (se tabell 4 för recept) kompletteras med 11 mm mgcl2 och DNA gel fläck (se tabell över material). Kör gel i 0,5 x TBE buffert kompletterad med 11 mM MgCl2 vid 70 V för 60-90 min. kör geler i ett isvatten bad eller i ett kallt rum för att förhindra överdriven uppvärmning och efterföljande denaturering av chassi strukturer.
    8. Avbilda gelen med hjälp av förhållanden som lämpar sig för DNA-gelfläcken som används i steg 5.1.7.
  2. Rening av chassi
    1. I slutet av eftermiddagen dagen före rening, skapa glycerol lutningar genom att försiktigt skiktning 80 μL vardera 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, och 15% glycerol i 1x origami vikbar buffert i en centrifug röret (se tabell 4 för recept). Gränserna mellan lagren bör vara något synliga.
    2. Inkubera lutningar vid 4 ° c över natten.
    3. Nästa morgon, tillsätt 45% glycerol i 1x origami vikbar buffert till vikta chassi lösning till en slutlig koncentration av 10% glycerol. Blanda varsamt och lager på toppen av gradienten i Centrifugera röret.
    4. Snurra lutningen med chassit på 243 000 x g för 130 min vid 4 ° c.
    5. Samla 50 μL fraktioner från röret i en topp till botten riktning.
    6. Cast en 2% aguppstod gel i 0,5 x TBE buffert kompletteras med 11 mM MgCl2 och DNA gel fläck.
    7. Fyll på 5 μL av varje fraktion på gelen och kör gelen i 0,5 x TBE-buffert kompletterad med 11 mM MgCl2 för 90-120 min vid 70 V. kör geler i ett isvatten bad eller i ett kallt rum för att förhindra överdriven uppvärmning och efterföljande denaturering av chassi strukturer.
    8. Avbilda gelen med hjälp av förhållanden som lämpar sig för DNA-gelfläcken som används i steg 5.2.6.
    9. Välj bråk för framtida experiment som uppvisar välvikta monomerstrukturer fria från oinkorporerade häftklamrar.
    10. Kvantifierade koncentrationer av utvalda fraktioner med hjälp av lämpliga spektroskopiska metoder, såsom UV-absorption vid 260 Nm. Använd denna koncentrations information när du konjugerar motorer till chassit i steg 6.1.3.

6. göra bildanalys kammare

  1. Gör en bildanalys kammare genom att sticka två remsor av dubbelhäftande tejp till en glasskiva och placera en täckslip ovanpå. Kammaren är det smala utrymmet inklämt mellan täckglasburk och glas glida, flankerad av de två remsor av tejp. Figur 1 illustrerar analys kammaren.
  2. När du förbereder bilden med lösningar, Använd en pipett för att flöda vätska i kammaren från ena sidan, och Använd en remsa av filtrerpapper för att samla in flödet av vätskan på den andra sidan.

7. motorisk Ensemble motilitet TIRF-analys

  1. Konjugering av motorer till DNA-chassi
    1. På isen, Förbered färsk 1 mL vardera av DTT-kompletterad BRB80, Taxol-kompletterad lyseringsbuffert, och kasein-Taxol-kompletterad lyseringsbuffert (recept som beskrivs i tabell 5). Överför 200 μL av varje buffert till ett RT-rör.
    2. Fortfarande på is, Använd kallt kasein-Taxol-kompletteras lysis buffert för att förbereda 4x energi och 4x Scavenger blandar (recept som beskrivs i tabell 5).
    3. Inkubera 10 μL ~ 300 nM renade motorer med 5 μL ~ 10 nM DNA-chassi på is för 15-30 min. Dessa koncentrationer av motorer har visat sig mätta chassits motor bindnings platser för denna inkubationstid.
      Obs: motorisk beläggning är inte 100%, sannolikt på grund av stokastiskt saknade handtag häftklamrar i enskilda chassi strukturer8,28.
    4. Under inkuberingen, späd ut biotin-och fluorophore-märkta MTs 100x med den RT Taxol-kompletterade lysbufferten, och Förbered ett gel filtrerings harts lämpligt för kolonnkromatografi med storleks uteslutning genom att följa nedanstående procedur.
  2. Avlägsnande av överskott motorer från motor-chassi konjugat av storlek uteslutning kolonnkromatografi
    1. I ett 50 mL koniskt rör, tvätta 5 mL av gel filtrerings kådan 2x med 45 mL ddH2O. För varje tvätt, blanda harts med vatten i det koniska röret, och snurra blandningen på 460 x g för 1 min. Kassera supernatanten och spara kådan.
    2. Tvätta kådan 2x med 45 mL 1x lyseringsbuffert (recept specificerat i tabell 5) med samma metod som beskrivs ovan.
    3. Omsuspendera den tvättade hartset i 1x lysis buffert i en 1:1 förhållande, så att hartset blir en ~ 50% flytgödsel i buffert. Den tvättade kådan kan förvaras vid 4 ° c i minst 1 månad.
    4. Överför 800 μL av hartsfjädringen till en rotations kolumn. Töm den överskjutande bufferten med tyngd krafts flödet i 5 min. ta bort kvarvarande buffert med 2 s spinn på 1 000 x g. Den slutliga hartsvolymen bör vara runt 350-400 μL.
    5. Späd motor chassi blandningen med den kasein-Taxol-kompletterade lysbufferten till en slutlig volym på 50 μL. överför den utspädda blandningen till spinkolonnen packad med harts.
    6. Centrifugera spinkolonnen vid 1 000 x g för 6 s (denna tid är inkluderande av accelerations-och retardation tiden). Samla de rena motor chassi konjugaterna genom att spara filtratet och kassera kolonnen som behåller överskotts motorerna.
  3. Beredning av diabilder för avbildning
    1. Flöde 13 μL av 1 mg/mL biotinylerat bovint serum albumin (biotin-BSA) i en bildanalys kammare. Inkubera i 2 minuter för att tillåta bindning av BSA till glas.
    2. Tvätta kammaren 2x med 20 μL av RT DTT-kompletterade BRB80 genom att rinna i bufferten på ena sidan av kammaren och fuktspridande överflödig vätska bort från den andra sidan med hjälp av en remsa av filtrerpapper.
    3. Flöde i 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin. Inkubera i 2 minuter för att tillåta bindning av konjugerat till biotin på BSA.
    4. Tvätta kammaren 2x med 20 μL av den RT Taxol-kompletterade lyseringsbufferten.
    5. Försiktigt flöde i 20 μL av den utspädda MTs med en skuren pipett spets. Inkubera i 2 minuter för att möjliggöra bindning mellan biotin på MTs och streptavidin.
    6. Tvätta 2x med 20 μL av den RT kasein-Taxol-kompletterade lyseringsbufferten. Inkubera i 2 minuter för att låta kasein tränga igenom hela kammaren.
    7. Späd den renade motor-chassi konjugat 5x till 10X till enda molekyl förhållanden (~ 10-100 pM) med kallt kasein-Taxol-kompletterad lysis buffert. Blanda ihop följande komponenter för att tillverka en slutlig motor chassi blandning: 10 μL av motorns chassi utspädning, 5 μL 4x energimix och 5 μL 4x Scavenger-blandning.
    8. Flöde i 20 μL av den slutliga motor-chassi blandningen till analysen bild kammaren och gå vidare till TIRF mikroskopi.
  4. Avbildning och datainsamling
    1. Bild bilden omedelbart med ett TIRF Mikroskop. Vanligtvis är varje bild användbar för mellan 30 och 60 min.
    2. Hämta en stillbild i MT-kanalen och en film i chassi kanalen. För motorerna i detta protokoll, 10 min filmer med en bildhastighet på 0,5 fps och exponeringstid på 200 MS är lämpliga.
    3. Från chassit filmen, generera en kymograph för varje MT i ImageJ eller en liknande bildbehandling programvara29. Analysera hastigheter och kör längder av motor-chassi ensembler genom att mäta sluttningar och horisontella avstånd av körningar på kymograph30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrika reningar av motorer och chassi strukturer har analyserats av gel elektrofores. SDS-PAGE analys bekräftade den framgångsrika utvinning av dynein från jäst (figur 2), som det slutliga filtratet samlats i steg 2.3.7 visade en tydlig, skarp band på positionen för ~ 350 kDa. Som väntat var detta dynein band frånvarande från att och tvätta som avlägsnas oönskade proteiner, och de pärlor som dynein var klyvs. Observationen antyder att IgG affinitetsrening och TEV proteashämmare klyvning var båda mycket effektiva. Dessutom var TEV proteashämmare också närvarande i det slutliga filtratet och bildade ett tydligt band på ~ 50 kDa.

Den framgångsrika MT affinitetsrening av dynein och kinesinproteiner bekräftades också med SDS-PAGE analys (figur 3). Medan dynein dök upp som ett tydligt enda band på ~ 350 kDa, dök kinesinet upp som något smetar flera band på ~ 120 kDa, möjligen på grund av närvaron av både fosforylerade och defosforylerade former av proteinet14 och variabla avkastningar i oligo-märkning. En jämförelse mellan dynein och kinesinet band före och efter denna MT affinitetsrening avslöjade en minskning av motorns koncentration, vilket indikeras av minskningen i bandet intensitet, vilket var sannolikt på grund av avlägsnande av icke-funktionella motorer. Trots minskningen var koncentrationerna av motorer som behålls tillräckliga för effektiva TIRF-analyser. Förutom TEV protease, en märkbar mängd tubulin (~ 51 kDa) var närvarande i den slutliga supernatanten, troligen på grund av den gradvisa nedbrytningen av MTs under experimentet, eller ofullständig avlägsnande av överskottet tubulin genom centrifugering. Den konsekventa motiliteten hos motor chassi ensembler som visas i TIRF-analyser tyder dock på att tubulin och TEV-proteas inte stör motoriska funktioner (se figur 6).

Vikning av DNA origami strukturer var analyseras av aguppstod gel elektrofores. Figur 4 visar resultatet av en gel som analyserar vikningen av ett flexibelt segmenterat chassi med 2 motor bindnings platser. Förskjutningen i rörligheten mellan den rena ovikt byggnadsställning strand (Lane 1) och fällbara reaktionen (Lane 2) indikerar origami vikning. Dessutom indikerar den fällbara reaktionen i Lane 2 närvaron av vissa multimerization av chassi strukturer. Multimerization uppstår vanligtvis, och kräver efterföljande rening av väl vikta monomer strukturer. De oinkorporerade överskott häftklamrarna var också synlig, visar en hög grad av rörlighet genom gelen.

Vikta origami reaktioner renas för att ta bort överskott icke inkorporerade häftklamrar och multimers av chassi strukturen. Figur 5 visar resultatet av en glycerolgradientrening av ett flexibelt chassi med 7 motor bindnings platser. De tidiga fraktionerna motsvarar den låga glyceroltätheten på toppen av röret. De innehåller överflödiga häftklamrar. De sena fraktionerna motsvarar den höga glyceroldensiteterna på botten av röret och innehåller multimers och aggregat av vikta strukturer. I denna gel anger fraktion 7 en lämplig fraktion som innehåller välvikta monomerchassi. Observera att den välvikta strukturen är isolerad från både överflödiga häftklamrar och multimers. Även om denna gel är representativ, och fraktion 7 ofta innehåller användbara chassi, varje renings experiment ger något olika resultat och fraktioner bör alltid analyseras för att avgöra vilken fraktion som är bäst för motilitet assays.

Motilitet av motor-chassi ensembler är lätt att upptäcka och mätbara på kymographs genereras från TIRF filmer. Till exempel, den kymographs (figur 6) av flexibelt chassi konjugerat till sju dynein proteiner ("7d" ensembler) visar mycket processiva körningar vid relativt konsekventa hastigheter, visar att ensembler var aktiva och rörliga i rekonstituerat system, och att MT affinitetsrening framgångsrikt bort de flesta icke-funktionella, orörligt dyneiner som kan bromsa eller stall ensembler. Samma tirf experiment har framgångsrikt utförts på andra chassityper med olika efterlevnad och motornummer för att avslöja effekterna av dessa faktorer på dynein lagarbete8,9.

Figure 1
Figur 1: schematiskt i bildanalys kammaren. Täckglasbandet sitter ovanpå två remsor av dubbelhäftande tejp. Lösningarna pipetteras i ena sidan och extraheras med filtrerpapper på den andra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: SDS-Page analys av rening av dynein från jäst. Jästceller lyserat och centrifugeras för att samla in lysat (Lane 1) som innehåller totala lösliga proteiner. Affiniteten mellan IgG på kolumn pärlor och ZZ-taggen på den rekombinanta dynein-konstruktionen utnyttjades för denna rening. Genomflödet (Lane 2) samlades in från blandningen av lysat och pärlor efter att den passerat genom en kromatografikolonn. De dynein-bundna pärlorna tvättades med buffertar, och den första tvätten med tvättbufferten (Lane 3) samlades in. Dynein konjugerade sedan till en DNA oligo. Efter TEV proteashämmare klyvning, separerade centrifugering i en rotations kolumn filtratet som innehåller dynein (Lane 4) och resterande pärlor (Lane 5). Alla prover som samlats in från rening var denaturerade med 1x LDS prov buffert och 1x reducerande medel, och lastas på en 4-12% BIS-Tris gel. Gelen kördes i 1x MOPS buffert på 200 V för ~ 1 h, och färgas med SYPRO Red protein gel fläck för avbildning i UV-ljus. I synnerhet den tydliga, skarpa band på ~ 350 kDa i Lane 4 indikerar närvaron av koncentrerad renad dynein i det slutliga filtratet, medan bandet på ~ 50 kDa i samma körfält indikerar Co-förekomst av TEV proteas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: analys av SDS-sidan av Mt affinitetsrening av funktionella dynein-och kinesinproteiner. Kinesin och dynein renas från jäst (körfält 1 och 3) blandades med polymeriserat MTS och ATP, och ultracentrifugering utfördes för att separera de funktionella motorerna i samman supernatanterna (körfält 2 och 4) från de icke-funktionella motorer som co-pellet med MTS. De motoriska proverna före och efter rening denaturerades med 1x LDS prov buffert och 1x reduktionsmedel, och lastas på en 4-12% BIS-Tris gel. Gelen kördes i 1x MOPS buffert på 200 V för ~ 1 h, och färgas med SYPRO Red protein gel fläck för avbildning i UV-ljus. Intensiteten av de motoriska banden (~ 120 kDa för kinesin, och ~ 350 kDa för dynein) verkade minska efter MT affinitetsrening, vilket indikerar en minskning av motorns koncentrationer. Märkbara koncentrationer av tubulin och TEV-proteas fanns i proverna efter renings motorn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Aguppstod gel analys av vikta DNA origami struktur. Vikta DNA origami strukturer bedöms av gel elektrofores. Lane 1 är den rena ovikt byggnadsställning strand medan Lane 2 är produkten av den fällbara reaktionen. Gel kördes på 70 V i ett isvatten bad för 90 min i 0.5 x TBE buffert kompletteras med 11 mM MgCl2. En förskjutning i rörligheten indikerar origami vikning. Oinkorporerade häftklamrar och chassi multimers syntes också i Lane 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Aguppstod gel analys av glycerol gradient rening av DNA origami chassi. Kvaliteten på glycerolgradienten rening kan bestämmas genom gel elektrofores av fraktioner från centrifug gradienten. Låga tal fraktioner är från toppen av röret och motsvarar låg densitet av glycerol. Höga numrerade fraktioner är från botten av röret och motsvarar höga densiteter av glycerol. De överflödiga häftklamrarna, monomerchassit och multimeric-chassit är alla synliga. Fraktion 7 innehåller chassi som lämpar sig för TIRF mikroskopi eftersom de är monomer och överskott häftklamrar är frånvarande. Gel kördes på 70 V i ett isvatten bad för 120 min i 0.5 x TBE buffert kompletteras med 11 mM MgCl2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Kymografer som visar motiliteten hos dynein-chassi ensembler på Single MTS. Dynein proteiner som utvinns ur jäst och renas med MTs var konjugerade till flexibla chassi strukturer. Varje chassi hade sju bindnings platser för dynein och bildade en "7D" Ensemble. Rörelsen av dessa ensembler på MTs spelades in i en 10 min film (200 MS exponering, 0,5 fps) under en TIRF analys. Kymographs från två MTs genererades från denna film i ImageJ genom att spåra längs en enda MT. De vertikala och horisontella röda staplarna i det övre vänstra hörnet på varje bild indikerar 2 min respektive 20 μm. Varje ljus linje registrerar förflyttning av en ensemble, med inversen av lutningen som indikerar hastigheten och horisontell förskjutning som indikerar kör längden. Med tirf analyser och kymography, motilitet av motor-chassi ensembler blir lätt detekterbar och direkt mätbara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Buffertnamn Sammansättning Steg som används Kommentar
5x lysis buffert 150 mM HEPER (pH 7,4) - Filter sterilisera bufferten. Den kan förvaras vid RT i en ordentligt försluten behållare under ett år.
250 mM Kacetat
10 mM Mgacetat
5 mM EGTA (pH 7,5)
50% glycerol
4x lysis buffert med kosttillskott 4x lysis buffert 2.1-2.2 Gör detta 4x buffert från 5x lysis buffert ovan. Förbered en buffert utan PMSF först, och tillsätt föreningen (upplöst i ren etanol) till en liten alikvot av bufferten precis före varje steg som kräver det.
4 mM DTT
0,4 mM mg-ATP
2 mM PMSF
Tvättbuffert 1x lysis buffert med kosttillskott 2,2 För att göra bufferten, tillsätt KCl, Triton X-100, och ddH2O till 4x lysis buffert med DTT och mg-ATP, men inte lägga PMSF tills höger före användning.
250 mM KCl
0,1% Triton X-100
5x TEV buffert 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) - Filter sterilisera bufferten. Den kan förvaras vid RT i en ordentligt försluten behållare under ett år.
150 mM KCl
10% glycerol
1x TEV-buffert 1x TEV-buffert 2.2-2.3 För att göra bufferten, tillsätt DTT, mg-ATP, Triton X-100, och ddH2O till 5x Stock TeV buffert, men inte lägga PMSF tills rätt före användning.
1 mM DTT
0,1 mM mg-ATP
0,1% Triton X-100
0,5 mM PMSF

Tabell 1: buffertar för IgG-affinitetsrening av motorproteiner från jästceller (protokoll avsnitt 2).

Buffertnamn Sammansättning Steg som används Kommentar
5x BRB80 400 mM rör - Filter sterilisera bufferten. Den kan förvaras vid RT i en ordentligt försluten behållare under ett år.
10 mM MgCl2
5 mM EGTA
Justera pH till 6,8 med KOH
1x BRB80 med kosttillskott 1x BRB80 3,3 & 4.1-4.2 Måste vara nytillverkad av 5x BRB80 Stock för varje experiment.
20 μM Taxol (upplöst i DMSO)
1 mM DTT
2x polymerisation mix 2x BRB80 (utan tillägg) 3,3 Flash frysa blandningen i små alikvoter och förvara på-80 oC.
2 mM DTT
2 mM mg-GTP
20% DMSO
Rekonstitutionsbuffert 1x BRB80 (utan tillägg) 3,1 Måste vara nygjorda för varje experiment.
1 mM DTT
1 mM mg-GTP

Tabell 2: buffertar för polymerisation av mikrotubuli (protokoll avsnitt 3).

Buffertnamn Sammansättning Steg som används Kommentar
Taxol-kompletterad lyseringsbuffert 1x lyseringsbuffert 4,1 Måste vara nygjord för varje rening.
20 μM Taxol (upplöst i DMSO)
1 mM DTT
5x ATP/Taxol blanda 1x lyseringsbuffert 4,2 Måste vara nygjord för varje rening.
25 mM mg-ATP
50 μM Taxol (upplöst i DMSO)
5 mM DTT

Tabell 3: buffertar för mikrotubule affinitetsrening av funktionella motorproteiner (protokoll avsnitt 4).

Buffertnamn Sammansättning Steg som används Kommentar
20x origami vikbar buffert 100 mM Tris pH 8,0 - Kan förvaras vid RT i en väl tillsluten behållare i upp till ett år.
20 mM EDTA
200 mM MgCl2
1x origami vikbar buffert 5 mM Tris pH 8,0 5,1-5.2 Gör bufferten fräsch genom att späda 20x beståndet med ddH2O före varje experiment.
1 mM EDTA
10 mM MgCl2
0.5 x TBE 45 mM TrispH 8,0 5,1-5.2 Kan förvaras vid RT i en väl tillsluten behållare i upp till ett år.
45 mM borsyra
1 mM EDTA

Tabell 4: buffertar för produktion av segmenterat DNA origami chassi (protokoll avsnitt 5).

Buffertnamn Sammansättning Steg som används Kommentar
DTT-kompletterat BRB80 1x BRB80 7,3 Måste vara nytillverkade före varje TIRF experiment.
1 mM DTT
Taxol-kompletterad lyseringsbuffert 1x lyseringsbuffert 7,1 & 7,3 Måste vara nytillverkade före varje TIRF experiment.
20 μM Taxol (upplöst i DMSO)
1 mM DTT
Kasein-Taxol-kompletterad lyseringsbuffert 1x lyseringsbuffert 7,1-7,3 Måste vara nytillverkade före varje TIRF experiment.
20 μM Taxol (upplöst i DMSO)
1 mM DTT
~ 2,5 mg/ml kasein (upplöst i Tris-HCl vid pH 8,0)
1x lyseringsbuffert 30 mM HEPER (pH 7,4) 7,2 Gör denna buffert fräsch genom att späda 5x lager (recept som beskrivs i tabell 1) med ddH2O.
50 mM Kacetat
2 mM Mgacetat
1 mM EGTA (pH 7,5)
10% glycerol
4x energi mix 22,5 μL 1x kasein-Taxol-Supplemenfted lyseringsbuffert 7,3 Måste vara nytillverkade före varje TIRF experiment; de angivna volymerna är för en slutlig volym på 25 μL.
1 μL 0,1 M mg-ATP
1 μL 40% glukos
0,5 μL β-merkaptoetanol
4x Scavenger-blandning 24 μL 1x kasein-Taxol-kompletterad lyseringsbuffert 7,3 Måste vara nytillverkade före varje TIRF experiment; de angivna volymerna är för en slutlig volym på 25 μL.
1 μL 1x syrgas rensnings system

Tabell 5: buffertar och mixar för motor ensemblen motilitet TIRF-analys (protokoll avsnitt 7). Detaljer om syre rensnings systemet som används för att göra Scavenger-mixen kan hittas någon annanstans17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den molekylära konstruktions tekniker av DNA origami ger ett unikt sätt att konstruera motor ensembler med definierade arkitekturer, motornummer, och typer, möjliggör studier av hur framväxande beteende uppstår från specifika motoriska konfigurationer31. Eftersom strukturella och cellulära studier fortsätter att belysa exempel på cytoskeletala motorer som arbetar i team, tekniker för att isolera och undersöka de biofysiska och biokemiska mekanismerna hos motorer i ensembler växer i nytta. Cryo-EM har till exempel visat att dynactin kan binda 2 individuella dyneinmotorer och att sådana kopplingar har olika motilitet än de enskilda motorerna10. Dessutom användes DNA-baserad konstruktion för att avgöra om däggdjurs dynein, när det aktiverades av dynactin och bicD2, kunde matcha kraften hos kinesin-1 i en dragkamp för krig14. I en annan blandad motorisk studie, DNA origami användes för att frikoppla effekterna av motsatta polaritet motorer och deras reglerande bindande proteiner genom rumsligt separera dem på en origami struktur15. Som mer strukturella och regulatoriska bestämningsfaktorer för motilitet finns, DNA-origami-baserade tekniker bör visa sig användbara för att bestämma de specifika biokemiska och biofysiska bidragsgivarna till den framväxande motilitet av motor ensembler. De molekylära konstruktions tekniker som möjliggörs av DNA origami är särskilt användbara eftersom de framväxande fenomenologiska resultaten av ensembler är svåra att förutsäga. Detta beror delvis på de otaliga faktorer som bidrar till motiliteten hos de enskilda motorerna inom ensemblen5,6,31.

Exempel på våra tidigare strukturer är monolitiska stavar och segmenterade stavar med varierande styvhet. Aktuella insatser utforskar sfäriska strukturer samt25. Andra har använt morfologier såsom planar strukturer och stavar22,24. På samma sätt kan olika typer av motorer bindas till samma chassi struktur7,14,15,18, genom att använda motor handtag med ortogonala DNA-sekvenser. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier av de motsatta åtgärderna av dyneiner och kinesins, minus-och plus-end riktade kinesins, och minus-och plus-end riktade myosins. Det möjliggör också införandet av en mutant bland annars vildtyp ensembler, vilket gör att de specifika biokemiska bidragsgivarna till den framväxande motilitet att dechiffreras7. På grund av förmågan att binda flera fluorophores till varje enskild struktur, avbildning i TIRF och efterföljande analys av kymography eller partikel spårning är möjligt. Tidigare rapporter visar analys av kymography data och statistisk utvärdering av chassi strukturer med varierande efterlevnad8. Medan cytoskeletala motorer har visat sig vara en spännande tidig applicering av att använda DNA-origami som ett molekylärt breadboard32, andra proteiner och protein system kommer också att gynnas av dessa metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar K. Chau, J. Morgan, och A. Driller-Colangelo för att bidra till de tekniker för segmenterade DNA origami chassit. Vi tackar också tidigare medlemmar i Reck-Peterson och Shih laboratorier för hjälpsamma diskussioner och bidrag till den ursprungliga utvecklingen av dessa tekniker. Vi tackar J. Wopereis och Smith College Center för mikroskopi och Imaging och L. Bierwert och Smith College Center för molekylärbiologi. Vi erkänner tacksamt NSF MRI program för förvärv av en TIRF Mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Round Bottom Tube USA Scientific 1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure Cytoskeleton.com T333P-A
Biotin-BSA Sigma A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm Beckman Coulter 356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm Beckman Coulter 355603
Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL GE Healthcare 17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty Bio-Rad 7326204EDU
P8064 Scaffold Tilibit 2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns Bio-Rad 731-1550
ProTev Protease Promega V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser amazon.com N/A
Sephacryl S-500 HR GE Healthcare 17061310
Streptavidin Thermo Fisher 434302
SYBR Safe DNA stain Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain Cytoskeleton.com T240-B
Tubulin, HiLyte 647 Cytoskeleton.com TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes Beckman Coulter 344090

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
  2. Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
  3. Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
  4. Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
  5. McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
  6. Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
  7. Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
  8. Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
  9. Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
  10. Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
  11. Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
  12. Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
  13. Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
  14. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  15. Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
  16. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  17. Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
  18. Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
  19. Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).
  20. Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
  21. Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).
  22. Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
  23. Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
  24. Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
  25. Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
  26. Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
  27. Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
  28. Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  31. Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).
  32. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).

Tags

Biokemi cytoskeleton dynein kinesin molekylära motorer DNA origami Single molekyl metoder
Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, J., Derr, N. D. Production of… More

Hu, J., Derr, N. D. Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation. J. Vis. Exp. (152), e60369, doi:10.3791/60369 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter