Summary
Curcumin er en ideel fluoroforet til mærkning og billeddannelse af amyloid beta protein plaques i hjernevæv på grund af sin præference binding til amyloid beta protein samt dens strukturelle ligheder med andre traditionelle amyloid binding farvestoffer. Det kan bruges til at mærke og billede amyloid beta protein plaques mere effektivt og billigt end traditionelle metoder.
Abstract
Deposition af amyloid beta protein (Aβ) i ekstra-og intracellulære rum er en af kendetegnende patologier af Alzheimers sygdom (AD). Derfor er påvisning af tilstedeværelsen af Aβ i AD hjernevæv et værdifuldt værktøj til udvikling af nye behandlinger for at forhindre progression af AD. Flere klassiske amyloid bindende farvestoffer, fluorchrom, billedbehandlings sonder og Aβ-specifikke antistoffer er blevet anvendt til at påvise Aβ Histokemisk i AD hjernevæv. Brug af disse forbindelser til Aβ detektion er dyrt og tidskrævende. Men på grund af sin intense fluorescerende aktivitet, høj affinitet, og specificitet for Aβ, samt strukturelle ligheder med traditionelle amyloid binding farvestoffer, curcumin (cur) er en lovende kandidat til mærkning og billeddannelse af Aβ plaques i post mortem hjernevæv. Det er en naturlig polyfenol fra urten Gura Longa. I nærværende undersøgelse blev cur anvendt til Histokemisk mærkning af Aβ-plaques fra både en genetisk musemodel med 5x familiær Alzheimers sygdom (5xFAD) og fra humant annonce væv inden for et minut. Den mærknings evne af cur blev sammenlignet med konventionelle amyloid binding farvestoffer, såsom thioflavin-S (thio-S), Congo rød (CR), og fluoro-Jade C (FJC), samt Aβ-specifikke antistoffer (6E10 og A11). Vi bemærkede, at cur er den mest billige og hurtigste måde at mærke og billede Aβ plaques i forhold til disse konventionelle farvestoffer og er sammenlignelig med Aβ-specifikke antistoffer. Desuden binder cur sig til de fleste Aβ arter, såsom oligomerer og fibrils. Derfor kan cur bruges som det mest omkostningseffektive, enkle og hurtige vha-detekterings middel til Aβ-plaques.
Introduction
Alzheimers sygdom (ad) er en af de mest almindeligt, aldersrelaterede, progressive neurologiske lidelser og en af de førende dødsårsager på verdensplan1,2. Indlæring, hukommelse, og kognition svækkelse, sammen med neuropsykiatriske lidelser, er de almindeligt forekommende symptomer i AD3. Selvom etiologien i ANNONCEN ikke er fuldt belyst, viser de tilgængelige genetiske, biokemiske og eksperimentelle beviser, at gradvis deposition af Aβ er en definitiv biomarkør for AD4. Dette misfoldede protein ophobes i intracellulære og ekstracellulære rum og menes at være involveret i synaptisk tab, øget neuroinflammation, og neurodegeneration i de kortikale og hippocampus regioner i hjernen påvirket af AD5. Derfor er Histokemisk påvisning af Aβ i annonce vævet et afgørende første skridt i udviklingen af ikke-giftige, anti-amyloid medicin for at forhindre annonce progression.
I løbet af de sidste par årtier er flere farvestoffer og antistoffer blevet brugt af mange forskningslaboratorier til at mærke og image Aβ plaques i hjernevæv, men nogle af disse metoder er tidskrævende, og de anvendte farvestoffer eller antistoffer er dyre, hvilket kræver flere tilbehør Kemikalier. Derfor ville udviklingen af et billigt middel til påvisning af Aβ plaques i ANNONCEN hjernen være et velkomment nyt værktøj. Mange laboratorier begyndte at bruge CUR, en lovende anti-amyloid naturlige polyphenol, til mærkning og billeddannelse Aβ, samt et terapeutisk middel til ad6,7,8,9. Dens hydrofobicitet og lypophilic natur, strukturelle ligheder med klassiske amyloid bindende farvestoffer, stærk fluorescerende aktivitet, samt stærk affinitet til at binde med Aβ gør det en ideel fluoroforet for mærkning og billeddannelse af Aβ plaques i ad tissue10 . Cur binder med Aβ-plaques og oligomerer, og dets tilstedeværelse detekteres også i intracellulære rum7,11,12,13. Desuden har det vist sig, at minimale mængder (1 − 10 nM) af cur kan mærke Aβ plaques i 5x familiær Alzheimers sygdom (5xFAD) hjernevæv7. Selv om 1 nM koncentrationen ikke giver den optimale fluorescens intensitet for optælling af Aβ-plaques, en 10 nM eller højere koncentration af cur gør. Ran og kolleger14 rapporterede, at doser så lavt som 0,2 nm af difluoroboron-derivatized cur kan detektere in vivo Aβ aflejringer næsten såvel som en infrarød sonde. Hvorvidt denne dosis er tilstrækkelig til at mærke Aβ plaques i væv er stadig ikke klar. De fleste tidligere undersøgelser har brugt 20 − 30 min til farvning Aβ plaques ved hjælp af CUR, men optimal farvning kan kræve meget mindre tid.
Denne undersøgelse var designet til at teste den mindste tid, der kræves af cur til at mærke Aβ plaques i AD hjernevæv og til at sammenligne følsomheden for mærkning og billeddannelse af Aβ plaques i hjernevæv fra 5xFAD mus efter farvning med cur med andre konventionelle Aβ-bindende farvestoffer, såsom Thioflavin-S (thio-S), Congo Red (CR) og fluoro-Jade C (FJC). Den Aβ mærknings evne af disse klassiske amyloid bindende farvestoffer blev sammenlignet med den nuværende farvning i paraffin-indlejret og kryostat koronalsektion hjernen sektioner fra 5xfad mus og fra alderen matchede menneskelige ad og kontrol hjernevæv. Resultaterne tyder på, at nuværende etiketter Aβ plaques på en måde, der svarer til Aβ-specifikke antistoffer (6E10) og moderat bedre end thio-S, CR eller FJC. Desuden, når intraperitoneale injektioner af cur til 5xFAD mus blev administreret for 2 − 5 dage, det krydsede blod-hjerne barrieren og bundet med Aβ plaques7. Interessant, nanomolær koncentrationer af cur er blevet brugt til at mærke og billede Aβ plaques i 5xfad hjernevæv7,14. Desuden kan morfologisk adskilte Aβ-plaques, såsom kerne-, neuritiske, diffuse og udbrændte plaques mærkes af cur mere effektivt end med nogen af de andre konventionelle amyloid binding farvestoffer7. Samlet set kan cur anvendes til mærkning og billede Aβ plaques i postmortem hjernevæv fra AD dyremodeller og/eller humant AD væv på en nem og billig måde, som et pålideligt alternativ til Aβ-specifikke antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for dyrepasning og-anvendelse (ACUC) fra Saginaw Valley State University. Den menneskelige væv blev opnået fra en etableret hjerne bank på banneret Sun Health Institute i Arizona15,16.
1. perfusion af dyrene
- Forbered fiksere og perfusions buffere.
- Forbered 0,1 M natriumphosphatbuffer ved tilsætning af 80 g natriumchlorid (NaCl), 2 g kaliumchlorid (KCl), 21,7 g dinatriumhydrogenphosphat (na2HPO4· 7h2O), 2,59 g kaliumdihydrogenphosphat (KH2po4 ), og dobbeltdestilleret vand til at lave i alt 1 L.
- Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Tilsæt 40 g PARAFORMALDEHYD til 1 L PBS (0,1 M, pH 7,4).
- PFA-opløsningen opvarmes til 60 − 65 °C, og der blandes med en magnetisk omrører.
Bemærk: temperaturen må ikke overstige 65 °C. - Tilsæt få dråber NaOH (1 N) med en pipette for at opløse PFA helt.
- PFA-Opløsningen filtreres med medium til fint filtrerpapir og opbevares ved 4 °C.
Bemærk: løsningen er god i en måned.
- Udføre dyrs anæstesi og perfusion.
Bemærk: tolv-måneders-gamle B6SJL-TG APP SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 × FAD) alders matchede kontrol mus (n = 6 pr. gruppe) blev købt fra leverandører og opdrættet i dyret hus af Saginaw Valley State University. Genotypebestemmelse blev bekræftet af polymerasekædereaktion (PCR) som beskrevet tidligere7. Human AD hjernevæv omfatter postmortem AD hjernevæv og alders matchede kontrol væv.- Bedøve dyret med et passende anæstesimiddel, såsom natriumpentobarbital (390 mg/kg legemsvægt) eller en ketamin/xylazinblanding (op til 80 mg/kg legemsvægt ketamin og 10 mg/kg legemsvægt xylazin) ved intraperitoneal injektion (27 G nål og 1 mL injektionssprøjte). Kontroller niveauet af anæstesi ved at klemme en tå. Hvis dyret ikke reagerer, så er det klar til perfusion kirurgi.
- Placer bedøvet dyr i liggende position på perfusions kirurgi bakken og ved hjælp af små iris saks gøre et snit til den bageste ende af venstre ventrikel.
- Indsæt en 22 G perfusion nål til venstre ventrikel og lav et lille snit på den rigtige øremuslingen at fjerne perfusion væske fra kroppen. Brug et perfusions system med tyngdekraften til at tillade iskold perfusions væsken (0,1 M PBS, pH 7,4) at flyde i 5 − 6 minutter (strømningshastighed 20 − 25 ml/min).
Bemærk: en klar lever er indikatoren for optimal perfusion. - Skift buffer ventilen til en iskold 4% PARAFORMALDEHYD opløsning til fastgørelse, og lad den flyde i 8 − 10 minutter.
Bemærk: tremor efterfulgt af hærdede eller stive lemmer er indikatorer for god fiksering. - Fjern hjernen fra kraniet ved hjælp af en saks. Ved hjælp af en spatel, indsamle hjernen og placere det i et hætteglas med 4% PFA (mindst 10x volumen af hjernen volumen) og opbevares ved 4 °C indtil videre brug.
2. vævs behandling
- Skær kryostat sektioner.
- Hjernen overføres til sorterede saccharoseopløsninger (10%, 20% og 30%) opbevares ved 4 °C i 24 timer i hver, indtil brug.
- Ved hjælp af en kryostat ved-22 °c, skæres 40 μm-tykke sektioner. Saml 10 − 20 sektioner pr. brønd i en 6-brønd plade fyldt med PBS og natriumazid (0,02%).
- Paraffin indlejre afsnittene for mus og humant hjernevæv.
- For paraffin sektioner, dehydrat den perfolerede og 24 h post-Fixed hjernevæv med klassificeret alkoholer (50%, 70%, 90%) for 2 h hver, efterfulgt af 100% alkohol 2x for 1 h hver), og derefter med xylen 2x for 1 h hver) ved stuetemperatur.
- Trænge ind i vævet med xylen-paraffin (1:1) 2x for 1 t ved 56 °C i en glas konisk kolbe dækket med aluminiumsfolie.
- Væv nedsænkes i smeltet paraffin (56 °C) i 4 − 6 timer.
- Skær 5 μm-tykke sektioner ved hjælp af en roterende mikrotom ved stuetemperatur og Placer dem i et serviet vandbad ved 45 °C.
- Histokemisk mærkning af Aβ-plaques i kryostat-sektionerne med cur.
- Skyl sektionerne fra trin 2.1.2 med PBS (pH 7,4) 3x i 5 min. hver.
- Nedsænk sektionerne i 70% ethanol i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Stock cur (1 mM) opløses i methanol og fortyndes med 70% ethanol for at opnå en endelig arbejds koncentration på 10 μM.
- Nedsænk afsnittene med en fungerende cur-opløsning i 1 − 5 minutter ved stuetemperatur på en shaker ved 150 rpm.
- Kassér den nuværende opløsning og vask med 70% ethanol 3x i 2 min. hver.
- Sæt afsnittene på poly-L-lysin coated glas glider og montere med en dækseddel ved hjælp af organiske monterings medier, såsom distyren blødgøringsmiddel xylen (DPX).
- Se under et fluorescens mikroskop ved hjælp af 480/550 nm excitation/emission filtre.
- Histokemisk mærkning af Aβ-plaques i den paraffin indlejrede mus og de humane hjerne sektioner med cur.
- Deparaffinize vævs afsnittene fra trin 2.2.4 med xylen 2x i 5 min hver ved stuetemperatur.
- Rehydreres med graduerede alkohol opløsninger (100%, 80%, 70%, 50% for 1 min. hver) og med destilleret vand 2x for 5 min hver ved stuetemperatur.
- Bejdsektionerne med cur (10 μM) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke, omrystning ved 150 rpm. Vask med 70%, 90% og 100% alkohol i 2 min. hver.
- Klar med xylen 2x i 5 min hver og Cover slip med DPX.
- Visualisere under et fluorescens mikroskop som nævnt i trin 2.3.7.
- Colocalize cur med Aβ-antistoffet i Aβ-plaques og oligomerer.
- Vask kryostat sektioner fra trin 2.1.2 med PBS 3x i en 12 brønd plade.
- Bloker sektionerne med 10% normalt gede serum (NGS) opløst i PBS med 0,5% Triton-X-100 ved stuetemperatur i 1 time.
- Kassér blokerings opløsningen. Der inkubates i afsnittene med Aβ-specifikke antistoffer (6E10 eller A11, fortyndet 1:200) opløst i en frisk blokerende opløsning indeholdende 10% NGS og 0,5% Triton-X100 natten over ved 4 °C i en shaker ved 150 rpm.
- Kassér antistof opløsningen og vask sektionerne med PBS 3x i 10 min. hver.
- Inkuber med det sekundære antistof mærke med rødt fluoroforet (f. eks. Alexa 594) i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Vask med PBS 3x i 10 minutter hver.
- Vask med 70% alkohol 1x.
- Inkubatér sektionerne med cur (10 μM) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask med 70% alkohol 3x i 1 min hver.
- Dehydrat med 90% og 100% alkohol i 1 min hver, klar med xylen 2x for 5 min hver, og monter på slides ved hjælp af DPX.
- Visualiser ved hjælp af et fluorescens mikroskop med passende excitation/emission filtre til de røde og grønne signaler.
- Ved intracellulær Aβ-samlokalisering plette sektionerne ved hjælp af Aβ-antistof (6E10), restain med cur ved stuetemperatur i mørke med omrystning ved 150 rpm og kontra plet med enten Hoechst-33342 (1 mg/ml) og/eller DAPI (1ug/ml) i 10 min ved stuetemperatur i mørket med omrystning ved 150 rpm. Vask med PBS 3x.
- Tag billeder med de røde, grønne og blå filtre med et 100x mål (samlet forstørrelse 1.000 x).
- Etiket Aβ-plaques med thio-S, CR og FJC.
Bemærk: detaljerede protokoller for thio-S og CR mærkning blev tidligere rapporteret7.- Til FJC-farvning vaskes de fritflydende sektioner opnået fra trin 2.1.2 med PBS 3x i 5 min. hver.
- Placer afsnittene i en 12 brønd plade og plet med FJC (0,001%) i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Kassér FJC opløsning og vask med PBS 3x i 5 min. hver.
- Inkuber med ammoniumchlorid (NH4Cl, 50 mm OPLØST i PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér NH4CL-opløsningen og vask med PBS 3x i 5 min. hver.
- Ved at følge trinene i afsnit 2,4 skal du dehydrere med graduerede alkohol opløsninger, rydde, montere og se under et fluorescens mikroskop ved hjælp af 450/520 nm excitation/emissions filtre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curcumin etiketter Aβ plaques inden for et minut. Når vi farvede 5xFAD væv med CUR, vi fandt, at cur label Aβ plaques inden for 1 min. Selv om øget inkubationstid med cur lidt øget fluorescens intensiteten af Aβ-plaques, var antallet af observerede Aβ-plaques ikke signifikant forskelligt mellem 1 min og 5 minutters farvnings tidspunkt (figur 1).
Cur kan mærke Aβ-plaques i cryostat-tilberedt, paraffin-indlejret mus og humant AD væv, der colocalizes med Aβ-specifikke antistoffer i mus AD hjernevæv. Da vi farvede kryosektion, paraffin-indlejrede sektioner (figur 2A) og humant ad væv (figur 2B), vi observerede cur-mærkede Aβ plaques i alle typer af vævs sektioner. For at bekræfte, at cur er bindende for Aβ-plaques, mærkede vi først plakaterne med 6E10, efterfulgt af den nuværende farvning. Vi bemærkede, at cur var fuldstændig Co-lokaliseret med Aβ på de samme plaques, der bundet 6E10 (figur 2C).
I den nuværende benævnt Aβ-oligomerer og intracellulære Aβ-aggregater. For at kontrollere, om cur kunne mærke Aβ-oligomerer, blev 5xFAD-muse sektioner plettet med et Aβ-oligomer specifikt antistof (A11), efterfulgt af en nuværende farvning. Vi bemærkede, at cur colokaliserede med A11 i Aβ plaques (figur 3A). Tilsvarende, cur også colokering med 6E10 antistof i intracellulære rum (figur 3B), hvilket indikerer, at det kan mærke den intracellulære Aβ.
Er mærket Aβ mere fremtrædende end klassiske amyloid bindende farvestoffer. Aβ mærkning af cur blev sammenlignet med kommercielt tilgængelige amyloid bindende farvestoffer thio-S, CR, FJC. Det Aβ-specifikke antistof 6E10 blev anvendt som standardkontrol. Vi bemærkede, at cur mærket Aβ mere fremtrædende end de konventionelle amyloid binding farvestoffer (figur 4).
Cur derivater bis-demethoxycurcumin (BDMC) og demethoxycurcumin (DMC), også til stede i Gurkemeje ekstrakt, Label Aβ plaques relativt til CUR i 5xFAD hjernevæv. To andre store komponenter, såsom BDMC og DMC, er til stede i Gurkemeje ekstrakt. Vi testede, om disse to forbindelser også label Aβ plaques ligner cur. Når 5xfad Mouse Brain sektioner blev plettet med disse derivater, både bdmc og DMC også mærket Aβ plaques, parallel cur (figur 5A). Forskellige monterings medier blev undersøgt for at kontrollere for interferens med Aβ-Imaging efter farvning med cur. Det fluorescerende signal var intakt i både vandige og organiske monterings medier, såsom DPX (figur 5B). Farvning af Aβ-plaques med cur var hensigtsmæssig efter immunfluorescent mærkning og efterfulgt af kontra farvning med Hoechst 33342 opløsning (1 mg/ml) eller 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (dapi, 1μg/ml). De immunfluorescent signaler og kontra farvning intensitet blev opretholdt efter den nuværende farvning (figur 5C).
Figur 1: curcumin etiketter Aβ plaques inden for et minut. (A). hjernen sektioner fra 5xfad mus eller menneskelig kontrol og ad kortikale væv blev farvet med cur (10 μM) for 1 − 5 min og antallet af synlige plaques blev talt. (B). der blev ikke observeret nogen forskel i antallet af Aβ-plaque-tællinger mellem 1 min og 5 minutters farvnings tider. Data er repræsenteret som middelværdien ± standardfejl af middelværdi (SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: samlokalisering af cur med Aβ-antistof i Aβ-plaques. Cur kan mærke Aβ-plaques i cryostat-tilberedte, paraffin-indlejrede sektioner (A) og humane ad tissue (B). Den Aβ mærkning parallelt med mærkning med Aβ-specifikke antistof (6E10, DAB farvning). (C). 5xfad-sektionerne blev først mærket med Aβ-antistof (6E10), efterfulgt af farvning med cur. Rød = 6e10 bundet af et sekundært antistof mærket med Alexa fluoroforet 594. Grøn = cur. Cur helt colokaliseret med Aβ på samme plaques, der bindes til 6E10. Pilene indikerer Aβ plaques. Scale bar indikerer 50 μm (totalforstørrelse = 400x) i alle tre billeder til venstre, og 10 μm (totalforstørrelse = 400x). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: curcumin etiketter Aβ oligomerer og intracellulære Aβ. A) Aβ-oligomer blev påvist immun Histokemisk ved hjælp af et Aβ-specifikt antistof (A11), efterfulgt af farvning med cur. Cur helt colokerer med Aβ, på samme oligomer hvor A11 binder. Scale bar = 250 μm og totalforstørrelse = 100x. B) tilsvarende blev intracellulær Aβ påvist immun Histokemisk ved hjælp af et Aβ-specifikt antistof (6E10), efterfulgt af farvning med cur. Bemærk, at cur helt colokér med Aβ i de samme områder bundet til 6E10. Scale bar = 50 μm og totalforstørrelse = 1.000 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: sammenligning af forskellige amyloid bindende farvestoffer med cur for at mærke Aβ-plaques. Cryostat sektioner (40 μm) fra cortex af 12-måneders-gamle 5xFAD mus blev farvet med CUR, Thioflavin-S, Congo rød, fluoro-Jade C, og med 6E10 antistof. I den nuværende benævnt Aβ-plaques mere fremtrædende end thio-S, CR og FJC. Pilene indikerer Aβ plaques. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: cur-derivater bis-demethoxy curcumin og demethoxy curcumin også etiket Aβ på samme måde som cur. (A) både kryostat og paraffin-indlejret 5xfad sektioner blev plettet med cur-derivater bis-demethoxy curcumin og demethoxy curcumin. Begge disse derivat mærkater Aβ plaques på samme måde som cur. B) både vandige og organiske monterings medier (DPX) blev anvendt til montering af vævs sektioner efter mærkning af Aβ-plaques med cur. C) immunolmærkede sektioner blev anvendt til Aβ-mærkning med cur. De hvide pile indikerer Aβ plaques, den grønne pil indikerer aktiveret astrocyt (GFAP), og den gule pil indikerer nuklear bejdset (DAPI). Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Funktioner | Aβ-antistof | Curcumin | Thio-S | Congo Red | Fluoro-Jade C |
| Varighed af farvning | ~ 24-48 h | ~ 1-5 min | ~ 10 min | ~ 60 min | ~ 30 min |
| Tilbehør kemikalier | Sekundære antistoffer, flere kemikalier til at lave buffer, normal gede serum | Methanol | Ethanol | NaOH og ethanol | NaOH og ethanol, kaliumpermanganat |
| Omkostninger | Dyrt: et Aβ-specifikt antistof-hætteglas kræver ~ $200-300 | Omkostningseffektiv: ~ $5-10/1 g cur og kan anvendes til mange væv | Omkostningseffektiv: ~ $5/1 g, kan anvendes for få væv | Omkostningseffektiv: > $5/1 g Congo rød, og kan anvendes til flere væv | Dyrt: ~ $15.500/1 g FJC pulver |
| Specificitet | Der kræves forskellige antistoffer for Aβ-oligomerer og fibriller | Curcumin binder med Aβ oligomerer og fibriller | Kan kun binde fibrils, ikke monomerer, eller oligomerer | Kan kun binde med Aβ-protofibrils og fibriller16, 17 | Kan kun binde med Aβ-fibrils og degenererede neuroner |
| Stabilitet | Afhængigt af det farvestof, der er knyttet til det sekundære antistof | Meget stabil, selv ved stuetemperatur, når bundet med Aβ | Stabil i methanol | Stabil i ethanol | Ikke stabilt |
| Pleje efter farvning | Har brug for ekstra pleje efter farvning, såsom at blive holdt i mørke og frosset hele tiden | Ikke så let følsom og mere stabil ved stuetemperatur | Lysfølsomme | Ikke let følsom | Lysfølsomme |
| Mikroskop påkrævet | Sammensatte lys eller fluorescerende (afhængigt af brug af sekundært antistof) | Fluorescerende | Fluorescerende | Let mikroskop eller polariseret mikroskop eller polariserer filter | Fluorescerende |
| Baggrunds farvning | Generelt, ingen baggrund | Meget lav baggrund | Høj baggrund på grund af binding med lipid membran eller lipid forbindelser i celle | Lav baggrund | Høj baggrund |
| In vivo Aβ-Imaging | Kan ikke anvendes | Meget gældende | Kan ikke anvendes | Kan ikke anvendes | Kan ikke anvendes |
Tabel 1: sammenligning af Aβ mærkning med forskellige amyloid binding farvestoffer og cur7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores hypotese var, at cur kunne bruges som den hurtigste, nemmeste og billigste måde at mærke og billede Aβ plaques i postmortem AD hjernevæv i forhold til andre klassiske amyloid bindende farvestoffer, samt Aβ-specifikke antistoffer. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme den mindste tid, der kræves for at mærke og image Aβ plaques ved CUR i postmortem-hjernevævet og afgøre, om cur kan anvendes som et alternativ til Aβ-antistof til mærkning af Aβ-plaques. Til dette formål, den Aβ-mærkning kapacitet af cur blev observeret på forskellige tidspunkter. Kunne mærke Aβ inden for et minut. Desuden var mærkning af Aβ ved cur større end andre konventionelle amyloid bindende farvestoffer, såsom thio-S (0,1%), CR (1%) og FJC (0,001%).
Cur betragtes som en unik og ideel fluoroforet for Aβ mærkning, fordi det har de fleste egenskaber besat af de fleste af de konventionelle amyloid binding farvestoffer, herunder strukturelle, fysiske, kemiske og biologiske egenskaber10. Hertil kommer, på grund af overkommelige priser, de fleste forskere er interesseret i at bruge denne naturlig polyphenol. For at vise specificiteten af den nuværende binding til Aβ-plaques og oligomerer brugte vi 6E10 og A11 (Aβ-oligomer-specifikt antistof). Cur viste næsten fuldstændig samlokalisering med alle de forskellige arter af Aβ til stede i vævet, hvilket tyder på, at cur er meget specifik for Aβ7,17,18,19,20. Desuden er der i de nuværende benævnt Aβ-oligomerer (figur3A) og intracellulære Aβ-aggregater (figur3b) og colokaliseret med Aβ-antistoffer (figur 2b), hvilket tyder på, at cur ikke kun kan mærke ekstracellulære Aβ plaques, men også Aβ deponeret i intracellulære rum7.
I løbet af de sidste par årtier er flere fluorophorer og antistoffer blevet udviklet til at mærke og image Aβ plaques Histokemisk. De fleste af dem er utvivlsomt meget specifikke for målrettede Aβ-arter og for påvisning af Aβ-plaques, men disse er meget dyrere, og deres anvendelse er mere tidskrævende end at anvende cur. For eksempel sammenlignede vi den Aβ plaque bindende af CUR, med andre amyloid binding farvestoffer, såsom thio-S, CR, og FJC, hvor Aβ-specifikke antistof (6E10) blev brugt som en referencekontrol. Disse resultater tyder på, at cur etiketter Aβ plaques mere stærkt end nogen af de andre fluorophorer. Vigtigst af alt, i forhold til CUR, nogle af de mere almindeligt anvendte fluorophorer har særskilte ulemper i form af mærkning og billeddannelse Aβ. For eksempel, thio-S kan producere en distraherende, høj baggrund, fordi det binder med lipid membraner eller lipid forbindelser i cellen21. På samme måde producerer CR, der almindeligvis anvendes til mærkning af Aβ, æble grøn birefringence (figur 4) under et polariseret mikroskop. CR ikke mærke til Aβ-plaques så let som gør cur eller thio-S, mærkning betydeligt færre Aβ plaques end dem, der påvises ved cur7,22,23. Gutierrez et al. rapporterede, at FJC, som kan binde med Aβ og med degenererede neuroner, mærker med en lavere hyppighed end enten cur eller thio-S24. Disse resultater tyder på, at disse almindeligt anvendte klassiske markører har mindre affinitet for binding til Aβ plaques end cur.
Desuden kan mærkning af forskellige Aβ-plaque typer (kerne, neuritisk, diffus, udbrændt) optimeres med CUR, snarere end andre amyloid bindende fluorophorer, fordi cur kan bidrage til at visualisere og skelne morfologisk forskellige Aβ plaques, mens andre teknikker undlader at skelne disse morfologiske undertyper7. På samme måde er brugen af Aβ-specifikke antistoffer, som er meget specifikke for forskellige arter af Aβ, meget bekostelig og tidskrævende, idet den tager mindst 24 − 48h via immun histokemi. Desuden kræver påvisning af forskellige arter af Aβ forskellige antistoffer, samt flere tilbehør kemikalier, som væsentligt øger de samlede omkostninger. Det er klart, at cur er billigere, lettere tilgængelig og producerer højere fluorescens intensitet, når den binder sig til Aβ-plaques. Selv om CR også er en relativt omkostningseffektiv teknik til mærkning og billeddannelse af Aβ-plaques, kan cur binde og mærke flere af Aβ-arterne, såsom oligomerer25 (figur 3 og figur 4), hvorimod CR kun binder sig til protofibrier og fibriller23. Derfor kan Aβ-mærkning med cur opnås mere effektivt og omkostningseffektivt end af thio-S, CR eller FJC (tabel 1).
Sammenfattende kan cur detektere Aβ plaques og oligomerer fra AD hjernevæv effektivt, hurtigt og billigt. Desuden er den nuværende binding til Aβ meget specifik, og dens fluorescerende aktivitet er meget stabil. Det kræver minimale mængder (1-10 nM) at mærke Aβ. Desuden er cur også meget specifik for forskellige Aβ arter, såsom fibriler eller plaques, samt oligomerer7. Tilsvarende, cur derivater demethoxycurcumin og bisdemethoxycurcumin også Harbor amyloid bindende egenskaber og c etiket Aβ på samme måde som cur10 (figur 5A). Derfor er cur en ideel fluoroforet til mærkning og billeddannelse af Aβ plaques i postmortem hjernevæv. Det kan bruges som et hurtigt og nemt alternativ til at detektere Aβ plaque belastning efter anti-amyloid terapi i eksperimentelle animalske modeller af AD. Vores resultater bekræfter rapporterne om den høje affinitet af cur til Aβ, hvilket styrker dens potentielle anvendelse til overvågning af Aβ-plaques i postmortem hjernen og i levende væv.
For optimal cur mærkning anbefales det at ikke mærke Aβ med CUR i unperfbrugt væv og for at undgå langsigtet vævs opbevaring, da det kan producere en større mængde af baggrund, selv når perfbrugt. For colabeling anbefales det at fuldføre Immunhistokemi først med det specifikke antistof, der anvendes før farvning med cur og derefter følge dette med modfarvning ved hjælp af DAPI eller Hoechst.
Mulige ændringer til denne metode omfatter at øge inkubationstiden for cur med vævet i op til 30 min, som ikke vil forstyrre signal intensiteten, selv om det kan øge baggrunden, mens billeddannelse. Faldende koncentration af cur til mindre end 10 μM interfererer ikke i Aβ-mærkningen på et signifikant niveau. For at reducere baggrunden for menneskets hjernevæv kan der anvendes en alternativ tilberedningsmetode. For eksempel kan hjerne sektioner i første omgang behandles med 0,3% (w/v) Sudan Black B i 70% ethanol (v/v) i 10 minutter ved stuetemperatur. Så afsnittet kunne farves med CUR i 10 minutter ved stuetemperatur, og vaskes med PBS 3x for 15 min, kontra plettet, og monteret med antifading Media13. Cryostat-snit tykkelser kan også reduceres til 20 − 25 μm.
Potentielle forbehold for denne metode omfatter cur binding med Aβ til stede i blodkarrene, som er forskellig fra de ekstracellulære Aβ plaques. Investigator skal således være opmærksom på morfologien af Aβ-plaques og oligomerer fra Aβ i blodkar. Investigator skal være opmærksom på Auto-fluorescerende signaler. Overskydende grøn baggrund kan ses lejlighedsvis efter den nuværende farvning, men dette kan reduceres ved at reducere farvnings tiden eller ved at reducere koncentrationen af cur. Endelig kan signalet til colabeling med andre markører reduceres på grund af gentagne behandlinger med clearing agenten (f. eks. xylen).
Vigtige begrænsninger omfatter manglende evne til at colabel med nogen markør protein ved hjælp af sekundært antistof mærket med grøn fluorescerende farvestof, såsom fluorescerende isothiocyanat (FITC). Disse kan ikke anvendes på grund af den tilsvarende excitation/emission af cur. Også i de tidlige stadier af AD, kan kun begrænsede mængder af Aβ mærkes af cur. Endelig er der et behov for at gøre arbejdet i mørkt miljø som enhver fluorescerende farvestof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støtten til denne undersøgelse kom fra Field Neuro Sciences Institute ved Ascension of St. Mary's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
