Summary
Curcumin är en idealisk fluorophore för märkning och avbildning av amyloid beta protein plack i hjärnvävnad på grund av dess preferens bindning till amyloid beta protein samt dess strukturella likheter med andra traditionella amyloid bindande färgämnen. Det kan användas för att märka och avbilda amyloid beta protein plack mer effektivt och billigt än traditionella metoder.
Abstract
Avsättning av amyloid beta protein (Aβ) i extra-och intracellulära utrymmen är en av de kännetecken patologier av Alzheimers sjukdom (AD). Därför, detektion av närvaron av Aβ i AD hjärnvävnad är ett värdefullt verktyg för att utveckla nya behandlingar för att förhindra utvecklingen av AD. Flera klassiska amyloid bindande färgämnen, fluorochrome, Imaging sonder, och Aβ-specifika antikroppar har använts för att upptäcka Aβ histochemically i AD hjärnvävnad. Användning av dessa föreningar för Aβ detektion är kostsamt och tidskrävande. Men på grund av dess intensiva fluorescerande aktivitet, hög affinitet, och specificitet för Aβ, samt strukturella likheter med traditionella amyloid bindande färgämnen, Curcumin (cur) är en lovande kandidat för märkning och avbildning av Aβ plack i efter döden Hjärnvävnad. Det är en naturlig polyfenol från ört Curcuma Longa. I den föreliggande studien användes cur till histokemiskt etikett Aβ-plack från både en genetisk musmodell av 5x familjär Alzheimers sjukdom (5xFAD) och från mänsklig annons vävnad inom en minut. Märknings förmågan hos cur jämfördes med konventionella amyloid bindande färgämnen, såsom thioflavin-S (Thio-S), kongorött (CR), och fluoro-Jade C (FJC), samt Aβ-specifika antikroppar (6E10 och A11). Vi observerade att cur är det billigaste och snabbaste sättet att märka och bild Aβ plack jämfört med dessa konventionella färgämnen och är jämförbar med Aβ-specifika antikroppar. Dessutom, cur binder med de flesta Aβ arter, såsom oligomerer och fibriller. Därför kan cur användas som den mest kostnadseffektiva, enkla och snabba detektions agenten för fluorkrom för Aβ-plack.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD) är en av de vanligaste, åldersrelaterade, progressiva neurologiska störningar och en av de främsta dödsorsakerna i världen1,2. Inlärning, minne, och kognition försämring, tillsammans med neuropsykiatriska störningar, är de vanligaste symtomen manifesteras i AD3. Även om ANNONSENS etiologi inte är helt klarlagd, tyder de tillgängliga genetiska, biokemiska och experimentella bevisen på att successiv deposition av Aβ är en definitiv biomarkör för AD4. Detta felvikt protein ackumuleras i intracellulära och extracellulära utrymmen och tros vara inblandade i synaptisk förlust, ökad neuroinflammation, och neurodegeneration i kortikala och Hippocampus regioner i hjärnan påverkas av AD5. Därför, histokemiska detektion av Aβ i annons vävnad är ett viktigt första steg i utvecklingen av giftfria, anti-amyloid läkemedel för att förhindra annons progression.
Under de senaste decennierna, flera färgämnen och antikroppar har använts av många forskningslaboratorier för att märka och bild Aβ plack i hjärnvävnad, men vissa av dessa metoder är tidskrävande och färgämnen eller antikroppar som används är dyra, kräver flera tillbehör Kemikalier. Därför skulle utvecklingen av ett billigt sätt att upptäcka Aβ plack i annonsen hjärnan vara ett välkommet nytt verktyg. Många laboratorier började använda cur, en lovande anti-amyloid naturliga polyfenol, för märkning och avbildning Aβ, samt ett terapeutiskt medel för AD6,7,8,9. Dess vattenavvisande egenskaper och lypophilic natur, strukturella likheter med klassiska amyloid bindande färgämnen, stark fluorescerande aktivitet, samt stark affinitet att binda med Aβ gör det en idealisk fluorofore för märkning och avbildning av Aβ plack i AD vävnad10 . CUR binder med Aβ-plack och oligomerer och dess närvaro upptäcks också i intracellulära utrymmen7,11,12,13. Dessutom har det visats att minimala mängder (1 − 10 nM) av nuvarande kan märka Aβ plack i 5x familjär Alzheimers sjukdom (5xFAD) hjärnvävnad7. Även om 1 nM-koncentrationen inte ger optimal fluorescensintensitet för räkning av Aβ-plack, är en 10 nM eller högre koncentration av cur. Ran och kollegor14 rapporterade att doser så låga som 0,2 nm i difluoroboron-derivatized cur kan upptäcka in vivo Aβ insättningar nästan samt en infraröd sond. Om denna dos är tillräcklig för att märka Aβ plack i vävnad är fortfarande oklart. De flesta tidigare studier har använt 20 − 30 min för färgning av Aβ plack med cur, men optimal färgning kan kräva mycket mindre tid.
Den föreliggande studien utformades för att testa den kortaste tid som krävs för att för att märka Aβ-plack i AD hjärnvävnad och jämföra känsligheten för märkning och avbildning av Aβ-plack i hjärnvävnad från 5xFAD-möss efter färgning med cur med andra konventionella Aβ-bindande färgämnen, såsom Thioflavin-S (Thio-S), kongorött (CR), och fluoro-Jade C (FJC). Den Aβ märknings förmåga av dessa klassiska amyloid bindande färgämnen jämfördes med nuvarande färgning i paraffin-inbäddade och kryostat koronala hjärn sektioner från 5xFAD möss och från åldermatchad mänsklig annons och kontroll hjärnvävnad. Resultaten tyder på att nuvarande etiketter Aβ plack på ett sätt som liknar Aβ-specifika antikroppar (6E10) och måttligt bättre än Thio-S, CR, eller FJC. Dessutom, när intraperitoneala injektioner av cur till 5xFAD möss administrerades för 2 − 5 dagar, det passerade blod-hjärnbarriären och bunden med Aβ plack7. Intressant, nanomolar koncentrationer av cur har använts för att märka och bild Aβ plack i 5xfad hjärnvävnad7,14. Dessutom kan morfologiskt distinkta Aβ plack, såsom kärna, neuritiska, diffusa, och utbrända plack märkas med cur mer effektivt än med någon av de andra konventionella amyloid bindande färgämnen7. Sammantaget kan cur tillämpas på etikett och bild Aβ plack i efter döden hjärnvävnad från annons djurmodeller och/eller mänsklig annons vävnad på ett enkelt och billigt sätt, som ett tillförlitligt alternativ till Aβ-specifika antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av djuromsorg och användning kommittén (ACUC) av Saginaw Valley State University. Den mänskliga vävnaden erhölls från en etablerad hjärn bank vid banner Sun Health Institute i Arizona15,16.
1. perfusion av djuren
- Förbered fixativ och perfusion buffertar.
- Förbered 0,1 M natriumfosfatbuffert genom att tillsätta 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 21,7 g dinatriumvätefosfat (na2HPO4· 7h2O), 2,59 g kaliumdivätefosfat (KH2Po4 ), och dubbelt destillerat vatten för att göra totalt 1 L.
- Bered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Tillsätt 40 g PARAFORMALDEHYD till 1 L PBS (0,1 M, pH 7,4).
- Värm PFA-lösningen till 60 − 65 ° c och blanda med en magnetomrörare.
Obs: temperaturen bör inte överstiga 65 ° c. - Tillsätt några droppar NaOH (1 N) med en pipett för att lösa upp PFA helt.
- Filtrera PFA-lösningen med medium till finfilter papper och förvara vid 4 ° c.
Obs: lösningen är bra för en månad.
- Utföra djur anestesi och perfusion.
Obs: tolv månader gamla B6SJL-TG APP SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 × FAD) åldersmatchade kontroll möss (n = 6 per grupp) köptes från leverantörer och uppfödd i Animal House of Saginaw Valley State University. Genotypning bekräftades av polymeraskedjereaktion (PCR) som beskrivits tidigare7. Mänsklig annons hjärnvävnad inkluderar efter döden annons hjärnvävnad och åldersmatchade kontroll vävnad.- Anesthetize djuret med ett lämpligt bedövningsmedel, såsom natrium pentobarbital (390 mg/kg kroppsvikt), eller en ketamin/xylazin blandning (upp till 80 mg/kg kroppsvikt ketamin och 10 mg/kg kroppsvikt xylazin) genom intraperitoneal injektion (27 G nål och 1 mL spruta). Kontrollera nivån av anestesi genom att nypa en tå. Om djuret inte svarar, då är det redo för perfusion kirurgi.
- Placera sövda djur i ryggläge på perfusion kirurgi bricka och använda små Iris sax göra ett snitt till den bakre änden av vänster kammare.
- Sätt i en 22 G perfusion nål till vänster kammare och gör ett litet snitt vid den högra örat för att ta bort perfusion vätska från kroppen. Använd ett per fusions system med tyngdkraften för att låta den iskalla per fusions vätskan (0,1 M PBS, pH 7,4) flöda i 5 − 6 min (flödeshastighet 20 − 25 ml/min).
Obs: en klar lever är indikatorn på optimal perfusion. - Byt buffertventilen till en iskall 4% paraformaldehydlösning för fixering och låt den flöda i 8 − 10 min.
Anmärkning: tremor följt av härdade eller stela armar och ben är indikatorer på god fixering. - Ta bort hjärnan från skallen med hjälp av sax. Med hjälp av en spatel, samla in hjärnan och placera den i en injektionsflaska med 4% PFA (minst 10X volymen av hjärnans volym) och förvara vid 4 ° c tills vidare användning.
2. vävnads behandling
- Skära kryostat sektioner.
- Överför hjärnan till graderade sackaroslösningar (10%, 20% och 30%) och förvara vid 4 ° c i 24 timmar vardera, fram till användning.
- Med en kryostat vid-22 ° c, skär 40 μm-tjocka sektioner. Samla 10 − 20 sektioner per brunn i en 6-brunn tallrik fylld med PBS och natriumazid (0,02%).
- Paraffin bädda in avsnitten för mus och mänsklig hjärnvävnad.
- För paraffin sektioner, torka den parfymera och 24 h post-fast hjärnvävnad med graderade alkoholer (50%, 70%, 90%) för 2 h vardera, följt av 100% alkohol 2x för 1 h vardera), och sedan med xylen 2x för 1 h vardera) vid rumstemperatur.
- Penetrera vävnaden med xylen-paraffin (1:1) 2x för 1 h vid 56 ° c i ett glas konisk kolv täckt med aluminiumfolie.
- Sänk ned vävnaden i smält paraffin (56 ° c) i 4 − 6 timmar.
- Skär 5 μm-tjocka sektioner med hjälp av en roterande mikrotom i rumstemperatur och placera dem i ett vävnads vattenbad vid 45 ° c.
- Histokemiskt märka Aβ-plack i kryostatsektionerna med cur.
- Skölj sektionerna från steg 2.1.2 med PBS (pH 7,4) 3x för 5 min vardera.
- Sänk ned avsnitten i 70% etanol i 2 min vid rumstemperatur.
- Lös lagercur (1 mM) i metanol och späd med 70% etanol för att få en slutlig arbets koncentration på 10 μM.
- Sänk ned sektionerna med arbetande cur lösning för 1 − 5 min vid rumstemperatur på en shaker vid 150 RPM.
- Kassera cur lösning och tvätta med 70% etanol 3x för 2 min vardera.
- Sätt avsnitten på Poly-L-lysin belagda glas bilder och montera med en täckglas med hjälp av organiska monteringsmedel, såsom distyren mjukgörare xylen (DPX).
- Se under ett fluorescensmikroskop med hjälp av 480/550 Nm excitation/emissions filter.
- Histokemiskt märka Aβ-plack i de paraffin-inbäddade mus-och Human hjärn sektionerna med cur.
- Avdeparaffinisera vävnads sektionerna från steg 2.2.4 med xylen 2x i 5 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Rehydrera med graderade alkohollösningar (100%, 80%, 70%, 50% för 1 min vardera) och med destillerat vatten 2x för 5 min vardera vid rumstemperatur.
- Bets sektioner med cur (10 μM) i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker, skakning vid 150 RPM. Tvätta med 70%, 90%, och 100% alkohol för 2 min vardera.
- Klar med xylen 2x för 5 min vardera och täckslip med DPX.
- Visualisera under ett fluorescensmikroskop som nämns i steg 2.3.7.
- Colocalize cur med Aβ-antikroppen i Aβ plack och oligomerer.
- Tvätta kryostatsektioner från steg 2.1.2 med PBS 3x i en 12-brunn tallrik.
- Blockera avsnitten med 10% normalt get serum (NGS) upplöst i PBS med 0,5% Triton-X-100 vid rumstemperatur under 1 h.
- Kassera den blockerande lösningen. Inkubera avsnitten med Aβ-specifika antikroppar (6E10 eller A11, utspädd 1:200) upplöst i ny blockerande lösning som innehåller 10% NGS och 0,5% Triton-X100 över natten vid 4 ° c i en shaker vid 150 RPM.
- Kassera antikroppslösningen och tvätta sektionerna med PBS 3x i 10 min vardera.
- Inkubera med den sekundära antikropps etiketten med röd fluorophore (t. ex. Alexa 594) i 1 h vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta med PBS 3x för 10 min vardera.
- Tvätta med 70% alkohol 1x.
- Inkubera sektionerna med cur (10 μM) i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta med 70% alkohol 3x för 1 min vardera.
- Dehydrera med 90% och 100% alkohol för 1 min vardera, klar med xylen 2x för 5 min vardera, och montera på diabilder med DPX.
- Visualisera med hjälp av ett fluorescensmikroskop med lämpliga excitation/emissions filter för de röda och gröna signalerna.
- För intracellulär Aβ colocalization, fläcken avsnitten med Aβ-antikropp (6E10), restain med cur vid rumstemperatur i mörker med skakning vid 150 rpm, och motfärgning med antingen Hoechst-33342 (1 mg/ml) och/eller DAPI (1ug/ml) för 10 min vid rumstemperatur i mörkret med skakning vid 150 RPM. Tvätta med PBS 3x.
- Ta bilder med de röda, gröna och blåa filtren med ett 100x-objektiv (total förstoring 1 000 x).
- Etikett Aβ plack med Thio-S, CR, och FJC.
Anm.: detaljerade protokoll för Thio-S och CR-märkning rapporterades tidigare7.- För FJC färgning, tvätta fritt flytande sektioner som erhållits från steg 2.1.2 med PBS 3x för 5 min vardera.
- Placera sektionerna i en 12 väl tallrik och fläcken med FJC (0,001%) för 10 min i mörker vid rumstemperatur.
- Kassera FJC lösning och tvätta med PBS 3x för 5 min vardera.
- Inkubera med ammoniumklorid (NH4Cl, 50 mm upplöst i PBS) i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera NH4cl-lösningen och tvätta med PBS 3x i 5 min vardera.
- Genom att följa stegen i avsnitt 2,4, torka med graderade alkohollösningar, rensa, montera och Visa under ett fluorescensmikroskop med hjälp av 450/520 Nm excitation/emissions filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curcumin etiketter Aβ plack inom en minut. När vi målat 5xFAD vävnad med cur, fann vi att nuvarande etikett Aβ plack inom 1 min. Även om den ökade inkubationstiden med cur något ökade fluorescensintensiteten hos Aβ-plack, var antalet observerade Aβ-plack inte signifikant annorlunda mellan 1 min och 5 min Färgnings tid (figur 1).
CUR kan märka Aβ plack i kryostat beredd, paraffin-inbäddade mus och mänsklig annons vävnad som colocalizes med Aβ-specifika antikroppar i mus annons hjärnvävnad. När vi färgas kryosektion, paraffin-inbäddade avsnitt (figur 2A) och mänsklig annons vävnad (figur 2B), observerade vi aktuella märkta Aβ plack i alla typer av vävnad sektioner. Dessutom, för att bekräfta att cur är bindande för Aβ plack, vi först märkt plack med 6E10, följt av nuvarande färgning. Vi observerade att cur var helt Co-lokaliserad med Aβ på samma plack som bundna 6E10 (figur 2C).
CUR märkta Aβ oligomerer och intracellulära Aβ aggregat. För att kontrollera om cur kunde märka Aβ-oligomerer färgas 5xFAD mus sektioner med en Aβ-oligomerspecifik antikropp (A11), följt av nuvarande färgning. Vi observerade att cur samlokaliserade med A11 i Aβ plack (figur 3A). Likaså, cur också colokaliserade med 6E10 antikropp i intracellulära utrymmen (figur 3B), vilket indikerar att det kan märka den intracellulära Aβ.
CUR märkt Aβ mer framträdande än klassiska amyloid bindande färgämnen. Aβ märkning av cur jämfördes med kommersiellt tillgängliga amyloid bindande färgämnen Thio-S, CR, FJC. Den Aβ-specifika antikroppen 6E10 användes som standard kontroll. Vi observerade att cur märkt Aβ mer framträdande än de konventionella amyloid bindande färgämnen (figur 4).
CUR derivat BIS-demethoxycurcumin (BDMC) och demethoxycurcumin (DMC), även närvarande i gurkmeja extrakt, etikett Aβ plack jämförelsevis att cur i 5xFAD hjärnvävnad. Två andra viktiga komponenter, såsom BDMC och DMC, är närvarande i gurkmeja extrakt. Vi testade om dessa två föreningar också etikett Aβ plack liknar cur. När 5xFAD mus hjärn sektioner färgas med dessa derivat, både BDMC och DMC också märkt Aβ plack, parallelling cur (figur 5A). Olika monterings medier undersöktes för att kontrollera interferens med Aβ-Imaging efter färgning med cur. Den fluorescerande signalen var intakt i både vatten-och organiskt monteringsmaterial, såsom DPX (figur 5B). Infärgning av Aβ plack med cur var lämplig efter Immunofluorescerande märkning och följt av motfärgning med Hoechst 33342 lösning (1 mg/ml) eller 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1μg/ml). Immunofluorescerande signaler och motfärgintensitet upprätthölls efter nuvarande färgning (figur 5C).
Figur 1: Curcumin etiketter Aβ plack inom en minut. (A). hjärn sektioner från 5xFAD möss eller mänsklig kontroll och AD kortikal vävnad färgas med cur (10 μm) för 1 − 5 min och antalet synliga plack räknades. (B). ingen skillnad observerades i antalet Aβ-plack räknas mellan 1 min och 5 min färgning gånger. Data representeras som medelvärde ± standardfel medelvärde (SEM). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: samtidig administrering av Aβ-antikroppar i Aβ-plack. CUR kan märka Aβ plack i kryostat-beredda, paraffin-inbäddade avsnitt (a) och mänsklig AD vävnad (B). Den Aβ märkning parallellt märkningen med Aβ-specifik antikropp (6E10, DAB färgning). (C). 5xFAD avsnitten var först märkta med Aβ antikropp (6E10), följt av färgning med cur. Röd = 6E10 bunden av en sekundär antikropp märkta med Alexa fluorophore 594. Grön = cur. För närvarande helt samlokaliserade med Aβ vid samma plack som binds till 6E10. Pilar indikerar Aβ plack. Skalstapeln anger 50 μm (total förstoring = 400x) i alla tre bilderna till vänster och 10 μm (total förstoring = 400x). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Curcumin etiketter Aβ oligomerer och intracellulära Aβ. A) Aβ-Oligomer upptäcktes immunohistokkemiskt med en Aβ-specifik antikropp (A11), följt av färgning med cur. För närvarande helt samlokaliserade med Aβ, vid samma Oligomer där A11 binder. Scale bar = 250 μm och total förstoring = 100x. (B) på samma sätt upptäcktes intracellulär Aβ immunohistokkemiskt med en Aβ-specifik antikropp (6E10), följt av färgning med cur. Observera att cur är fullständigt samlokaliserad med Aβ i samma områden som binds till 6E10. Skalstapel = 50 μm och total förstoring = 1 000 x. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelse av olika amyloid-bindningsfärger med cur för att märka Aβ-plack. Kryostatsektioner (40 μm) från cortex av 12-månaders-gamla 5xFAD möss färgas med cur, Thioflavin-S, kongorött, fluoro-Jade C, och med 6E10 antikropp. För valtmärkta Aβ-plack mer framträdande än Thio-S, CR och FJC. Pilar indikerar Aβ plack. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: aktuella derivat BIS-demethoxy Curcumin och demethoxy Curcumin också etikett Aβ på samma sätt för cur. (A) både kryostat och paraffin-inbäddade 5xFAD sektioner färgas med aktuella derivat BIS-demethoxy Curcumin och demethoxy Curcumin. Båda dessa derivat etikett Aβ plack på ett sätt som liknar cur. B) både vattenhaltiga och organiska monteringsmedia (DPX) användes för att montera Vävnadsdelar efter märkning av Aβ-plack med cur. C) immunolabeled sektioner användes för Aβ-märkning med cur. De vita pilarna indikerar Aβ plack, den gröna pilen indikerar aktiverad astrocyt (GFAP), och den gula pilen indikerar nukleär fläck (DAPI). Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Funktioner | Aβ-antikropp | Curcumin | Thio-S | Congo Red | Fluoro-Jade C |
| Varaktighet av färgning | ~ 24-48 h | ~ 1-5 min | ~ 10 min | ~ 60 min | ~ 30 min |
| Tillbehör kemikalier | Sekundära antikroppar, flera kemikalier för att göra buffert, normala get serum | Metanol | Etanol | NaOH och etanol | NaOH och etanol, kaliumpermanganat |
| Kostnad | Kostsamt: en Aβ-specifik antikropp injektionsflaska kräver ~ $200-300 | Kostnadseffektiv: ~ $5-10/1 g cur och kan appliceras för många vävnader | Kostnadseffektiv: ~ $5/1 g, kan tillämpas för få vävnader | Kostnadseffektiv: > $5/1 g kongorött, och kan appliceras på flera vävnader | Kostsamt: ~ $15.500/1 g FJC pulver |
| Specificitet | Olika antikroppar krävs för Aβ-oligomerer och fibriller | Curcumin binder med Aβ oligomerer och fibriller | Kan binda endast fibriller, inte monomerer, eller oligomerer | Kan endast binda med Aβ-protofibriller och fibriller16, 17 | Kan endast binda med Aβ-fibriller och degenererade neuroner |
| Stabilitet | Beroende på färgen som fästs vid den sekundära antikroppen | Mycket stabil, även vid rumstemperatur när den binds med Aβ | Stabil i metanol | Stabil i etanol | Inte stabilt |
| Vård efter färgning | Behöver extra vård efter färgning, såsom hålls i mörker och frysta hela tiden | Inte lika ljuskänsligt och stabilare vid rumstemperatur | Ljuskänsliga | Inte ljuskänsligt | Ljuskänsliga |
| Mikroskop krävs | Sammansatt ljus eller fluorescerande (beroende på användning av sekundär antikropp) | Fluorescerande | Fluorescerande | Ljusmikroskop eller polariserat Mikroskop eller polariserande filter | Fluorescerande |
| Bakgrunds färgning | I allmänhet finns ingen bakgrunds | Mycket låg bakgrund | Hög bakgrund på grund av bindning med Lipidmembran eller lipidföreningar i cell | Låg bakgrund | Hög bakgrund |
| In vivo Aβ-Imaging | Kanske inte gäller | Mycket tillämplig | Kanske inte gäller | Kanske inte gäller | Kanske inte gäller |
Tabell 1: jämförelse av Aβ-märkning med olika amyloid-bindningsfärger och cur7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår hypotes var att cur skulle kunna användas som det snabbaste, enklaste och billigaste sättet att märka och bild Aβ plack i efter döden annons hjärnvävnad jämfört med andra klassiska amyloid bindande färgämnen, samt Aβ-specifika antikroppar. Syftet med denna studie var att fastställa den minsta tid som krävs för att märka och bild Aβ plack av cur i efter döden annons hjärnvävnad och avgöra om cur kan användas som ett alternativ till Aβ antikropp för märkning av Aβ plack. För detta ändamål observerades Aβ-märkning kapacitet för cur vid olika tidpunkter. CUR kunde märka Aβ inom en minut. Dessutom, märkning av Aβ av cur var större än andra konventionella amyloid bindande färgämnen, såsom Thio-S (0,1%), CR (1%), och FJC (0,001%).
CUR anses vara en unik och idealisk fluorophore för Aβ märkning, eftersom det har de flesta egenskaper besatt av de flesta av de konventionella amyloid bindande färgämnen, inklusive strukturella, fysikaliska, kemiska och biologiska egenskaper10. Dessutom, på grund av överkomlighet, de flesta forskare är intresserade av att använda denna naturliga polyfenol. För att Visa specificiteten hos nuvarande bindning till Aβ plack och oligomerer använde vi 6E10 och A11 (Aβ-oligomerspecifik antikropp). CUR visade nästan fullständig samlokalisering med alla de olika arter av Aβ som finns i vävnaden, vilket tyder på att cur är mycket specifik för Aβ7,17,18,19,20. Dessutom, aktuella märkta Aβ-oligomerer (figur 3A) och intracellulära Aβ-aggregat (figur 3b) och samlokaliserade med Aβ-antikroppar (figur 2b), vilket tyder på att nuvarande kan märka extracellulära Aβ plack, men också Aβ deponeras i intracellulära utrymmen7.
Under de senaste decennierna har flera fluorofoforer och antikroppar utvecklats för att märka och avbilda Aβ plack histokemiskt. Otvivelaktigt, de flesta av dem är mycket specifika för riktade Aβ arter och för att upptäcka Aβ plack, men dessa är mycket dyrare och deras användning är mer tidskrävande än att använda cur. Till exempel jämförde vi den Aβ plack bindning av cur, med andra amyloid bindande färgämnen, såsom Thio-S, CR, och FJC, där Aβ-specifik antikropp (6E10) användes som Referenskontroll. Dessa resultat tyder på att nuvarande etiketter Aβ plack starkare än någon av de andra fluoroforer. Viktigast, i förhållande till cur, några av de mer vanliga fluoroforer har distinkta nackdelar när det gäller märkning och Imaging Aβ. Till exempel kan Thio-S producera en distraherande, hög bakgrund eftersom det binder med lipid membran eller lipid föreningar i cellen21. På samma sätt, CR, som vanligen används för att märka Aβ, producerar äppelgrön Dubbelbrytning (figur 4) under ett polariserat Mikroskop. CR har inte etikett på Aβ-plack lika lätt som för cur eller Thio-S, och etikettering av betydligt färre Aβ-plack än de som har påvisats i7,22,23. Gutierrez et al. rapporterade att FJC, som kan binda med Aβ och med degenererade neuroner, etiketter på en lägre frekvens än antingen cur eller Thio-S24. Dessa resultat tyder på att dessa vanligen använda klassiska markörer har mindre affinitet för bindning till Aβ plack än cur.
Dessutom kan märkning av olika Aβ-plack typer (kärna, neuritiska, diffusa, utbränd) optimeras med cur, snarare än andra amyloid bindande fluoroforer, eftersom cur kan bidra till att visualisera och särskilja morfologiskt olika Aβ plack, medan andra tekniker misslyckas med att särskilja dessa morfologiska subtyper7. På samma sätt är användningen av Aβ-specifika antikroppar, som är mycket specifika för olika arter av Aβ mycket kostsam och tidskrävande, med minst 24 − 48h via immunohistokemi. Dessutom, upptäcka olika arter av Aβ kräver olika antikroppar, samt flera tillbehör kemikalier, som avsevärt bidrar till den totala kostnaden. Det är klart att cur är mindre kostsamt, mer lättillgängligt och ger högre fluorescensintensitet när det binder till Aβ-plack. Även om CR också är en relativt kostnadseffektiv teknik för märkning och avbildning av Aβ-plack, kan cur binda och märka mer av Aβ-arterna, såsom oligomerer25 (figur 3 och figur 4), medan CR endast binder till protofibriller och fibriller23. Därför kan Aβ-märkning med cur uppnås på ett mer effektivt och kostnadseffektivt sätt än genom Thio-S, CR eller FJC (tabell 1).
Sammanfattnings, cur kan upptäcka Aβ plack och oligomerer från annons hjärnvävnad effektivt, snabbt, och billigt. Dessutom är nuvarande bindning till Aβ mycket specifik och dess fluorescerande aktivitet är mycket stabil. Det kräver minimala mängder (1-10 nM) för att märka Aβ. Dessutom är cur också mycket specifikt för olika Aβ-arter, såsom fibriller eller plack, samt oligomerer7. Likaså, cur derivat demethoxycurcumin och bisdemethoxycurcumin också Harbor amyloid bindande egenskaper och c etikett Aβ på samma sätt som för cur10 (figur 5a). Därför är cur en idealisk fluorophore för märkning och avbildning av Aβ plack i efter döden hjärnvävnad. Det kan användas som ett snabbt och enkelt alternativ för att detektera Aβ plack belastning efter anti-amyloid terapi i experimentella djurmodeller av AD. Våra fynd bekräftar rapporterna om den höga affinitet av cur till Aβ, stärka dess potentiella användning för övervakning av Aβ-plack i efter döden hjärna och i levande vävnad.
För optimal nuvarande märkning rekommenderas att inte märka Aβ med cur i oparfymera vävnad och för att undvika långvarig vävnad lagring, eftersom det kan producera en större mängd bakgrund, även när parfymera. För colabeling, det rekommenderas att slutföra immunohistokemi först med den specifika antikroppen som används före färgning med cur och sedan följa detta med Counter-färgning med DAPI eller Hoechst.
Möjliga modifieringar av denna metod inkluderar öka inkubationstiden för cur med vävnaden i upp till 30 min, vilket inte kommer att störa signalintensiteten, även om det kan öka bakgrunden medan Imaging. Minskande koncentration av cur till mindre än 10 μM stör inte i Aβ märkning till en betydande nivå. För att minska bakgrunden till mänsklig hjärnvävnad kan en alternativ beredningsmetod tillämpas. Till exempel, hjärn sektioner kan initialt behandlas med 0,3% (w/v) Sudan Black B i 70% etanol (v/v) för 10 min vid rumstemperatur. Då avsnittet kan färgas med cur för 10 min vid rumstemperatur, och tvättas med PBS 3x för 15 min, motmålat, och monteras med antifading Media13. Kryostatsektionens tjocklekar kan också reduceras till 20 − 25 μm.
Potentiella varningar till denna metod inkluderar cur bindning med Aβ finns i blodkärlen, som skiljer sig från de extracellulära Aβ plack. Således bör prövaren vara medveten om morfologin av Aβ plack och oligomerer från Aβ i blodkärlen. Prövaren bör vara medveten om Auto-fluorescerande signaler. Överskott av grön bakgrund kan ses ibland efter nuvarande färgning, men detta kan minskas genom att minska infärgnings tiden eller genom att minska koncentrationen av cur. Slutligen kan signalen för colabeling med andra markörer minskas på grund av upprepad behandling med clearingmedlet (t. ex. xylen).
Viktiga begränsningar inkluderar oförmåga att colabel med någon markör protein med hjälp av sekundär antikropp märkta med grön fluorescerande färgämne, såsom fluorescerande isotiocyanat (FITC). Dessa kan inte användas på grund av liknande excitation/emission av cur. Även i de tidiga stadierna av AD, endast begränsade mängder av Aβ kan märkas med cur. Slutligen finns det ett behov av att arbeta i mörk miljö som alla fluorescerande färgämne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Stöd för denna studie kom från fältet Neurosciences Institute vid Ascension av St Mary ' s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
