Summary
Curcumin ist ein ideales Fluorophor für die Kennzeichnung und Bildgebung von Amyloid-Beta-Protein-Plaques im Gehirngewebe aufgrund seiner bevorzugten Bindung an Amyloid-Beta-Protein sowie seiner strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen. Es kann verwendet werden, um Amyloid-Beta-Protein-Plaques effizienter und kostengünstiger als herkömmliche Methoden zu beschriften und abzubilden.
Abstract
Die Ablagerung von Amyloid-Beta-Proteinen (A) in extra- und intrazellulären Räumen ist eine der charakteristischen Pathologien der Alzheimer-Krankheit (AD). Daher ist der Nachweis des Vorhandenseins von Aa im AD-Gehirngewebe ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, um das Fortschreiten von AD zu verhindern. Mehrere klassische Amyloid-Bindungsfarbstoffe, Fluorchrom, bildgebende Sonden und A-spezifische Antikörper wurden verwendet, um Aa histochemisch im AD-Gehirngewebe zu detektieren. Die Verwendung dieser Verbindungen für die A-Erkennung ist kostspielig und zeitaufwändig. Aufgrund seiner intensiven fluoreszierenden Aktivität, der hohen Affinität und der Spezifität von Aa sowie struktureller Ähnlichkeiten mit traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen ist Curcumin (Cur) jedoch ein vielversprechender Kandidat für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe. Es ist ein natürliches Polyphenol aus dem Kraut Curcuma longa. In der vorliegenden Studie wurde Cur verwendet, um A-Plaques sowohl aus einem genetischen Mausmodell der 5x familiären Alzheimer-Krankheit (5xFAD) als auch aus menschlichem AD-Gewebe innerhalb einer Minute histochemisch zu kennzeichnen. Die Etikettierfähigkeit von Cur wurde mit herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC) sowie A-spezifischen Antikörpern (6E10 und A11) verglichen. Wir beobachteten, dass Cur der preiswerteste und schnellste Weg ist, A-Plaques im Vergleich zu diesen herkömmlichen Farbstoffen zu beschriften und abzubilden und mit A-spezifischen Antikörpern vergleichbar ist. Darüber hinaus bindet Cur mit den meisten A-Arten, wie Oligomere und Fibrillen. Daher könnte Cur als kostengünstigstes, einfachstes und schnellstes Fluorchrom-Detektionsmittel für A-Plaques verwendet werden.
Introduction
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der häufigsten, altersbedingten, fortschreitenden neurologischen Erkrankungen und eine der häufigsten Todesursachen weltweit1,2. Lern-, Gedächtnis- und Kognitionsstörungen, zusammen mit neuropsychiatrischen Störungen, sind die häufigsten Symptome, die sich in AD3manifestieren. Obwohl die Ätiologie von AD noch nicht vollständig aufgeklärt wurde, deuten die verfügbaren genetischen, biochemischen und experimentellen Beweise darauf hin, dass die allmähliche Ablagerung von Aa ein endgültiger Biomarker für AD4ist. Dieses falsch gefaltete Protein sammelt sich in intrazellulären und extrazellulären Räumen an und wird angenommen, dass es an synaptischen Verlusten, erhöhter Neuroinflammation und Neurodegeneration in den kortikalen und hippocampalen Regionen im Gehirn beteiligt ist, die von AD5betroffen sind. Daher ist der histochemische Nachweis von Aa im AD-Gewebe ein entscheidender erster Schritt bei der Entwicklung ungiftiger Anti-Amyloid-Medikamente zur Verhinderung der AD-Progression.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Farbstoffe und Antikörper von vielen Forschungslaboratorien verwendet, um A-Plaques im Hirngewebe zu kennzeichnen und abzubilden, aber einige dieser Methoden sind zeitaufwändig und die verwendeten Farbstoffe oder Antikörper sind teuer, was mehrere Zubehörteile erfordert. Chemikalien. Daher wäre die Entwicklung eines kostengünstigen Nachweismittels für A-Plaques im AD-Gehirn ein willkommenes neues Werkzeug. Viele Laboratorien begannen mit Cur, einem vielversprechenden Anti-Amyloid-Naturpolyphenol, für die Kennzeichnung und Bildgebung von A, sowie einem therapeutischen Mittel für AD6,7,8,9. Seine Hydrophobie und lypophile Natur, strukturelle Ähnlichkeiten mit klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen, starke fluoreszierende Aktivität, sowie eine starke Affinität zur Bindung mit Aa macht es zu einem idealen Fluorophor für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques im AD-Gewebe10 . Cur bindet mit A-Plaques und Oligomeren und seine Anwesenheit wird auch in intrazellulären Räumen7,11,12,13nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass minimale Mengen (1x 10 nM) von Cur A-Plaques bei 5x familiärer Alzheimer-Krankheit (5xFAD) Hirngewebe7beschriften können. Obwohl die 1 nM-Konzentration nicht die optimale Fluoreszenzintensität für die Zählung von A-Plaques liefert, ist eine 10 nM oder höhere Konzentration von Cur nicht. Ran und Kollegen14 berichteten, dass Dosen von bis zu 0,2 nM difluoroboron-derivatisierter Kur in vivo A-Ablagerungen fast so gut wie eine Infrarotsonde erkennen können. Ob diese Dosis ausreicht, um A-Plaques im Gewebe zu kennzeichnen, ist noch unklar. Die meisten früheren Studien haben 20-30 min für die Färbung von A-Plaques mit Cur verwendet, aber eine optimale Färbung kann viel weniger Zeit in Sicherstellung enden.
Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die minimale Zeit zu testen, die Cur benötigt, um A-Plaques im AD-Gehirngewebe zu kennzeichnen und die Empfindlichkeit für die Kennzeichnung und Bildgebung von A-Plaques im Hirngewebe von den 5xFAD-Mäusen nach der Färbung mit Cur mit anderen konventionellen Bindende Farbstoffe wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC). Die A-Etikettierungsfähigkeit dieser klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffe wurde mit Der Färbung in paraffin-eingebetteten und kryostatkoronalen Hirnabschnitten von 5xFAD-Mäusen und aus altersgerechten menschlichen AD und der Kontrolle des Hirngewebes verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cur-Plaques in einer Weise, die A-spezifischen Antikörpern (6E10) und mäßig besser als Thio-S, CR oder FJC ähnelt. Darüber hinaus, wenn intraperitoneale Injektionen von Cur an 5xFAD Mäuse für 2-5 Tage verabreicht wurden, überquerte es die Blut - Hirn-Schranke und gebunden mit A- Plaques7. Interessanterweise wurden nanomolare Konzentrationen von Cur verwendet, um A-Plaques in 5xFAD Hirngewebe7,14zu beschriften und abzubilden. Darüber hinaus können morphologisch unterschiedliche A-Plaques, wie Kern-, neuritische, diffuse und ausgebrannte Plaques, durch Cur effizienter gekennzeichnet werden als bei jedem anderen konventionellen Amyloid-Bindungsfarbstoff7. Insgesamt kann Cur auf die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe aus AD-Tiermodellen und/oder menschlichem AD-Gewebe auf einfache und kostengünstige Weise angewendet werden, als zuverlässige Alternative zu A-spezifischen Antikörpern.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Saginaw Valley State University genehmigt. Das menschliche Gewebe wurde von einer etablierten Gehirnbank am Banner Sun Health Institute in Arizona15,16gewonnen.
1. Perfusion der Tiere
- Bereiten Sie die Fixier- und Perfusionspuffer vor.
- 0,1 M Natriumphosphatpuffer vorbereiten, indem 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 21,7 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4,7H2O), 2,59 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) ) und doppelt destilliertes Wasser, um insgesamt 1 L zu bilden.
- 4% Paraformaldehyd (PFA) zubereiten.
- 40 g Paraformaldehyd zu 1 L PBS (0,1 M, pH 7,4) hinzufügen.
- Erhitzen Sie die PFA-Lösung auf 60 bis 65 °C und mischen Sie sie mit einem Magnetrührer.
HINWEIS: Die Temperatur sollte 65 °C nicht überschreiten. - Fügen Sie einige Tropfen NaOH (1 N) mit einem Trasen hinzu, um die PFA vollständig aufzulösen.
- Filtern Sie die PFA-Lösung mit mittlerem bis feinem Filterpapier und lagern Sie sie bei 4 °C.
HINWEIS: Die Lösung ist gut für einen Monat.
- Tieranästhesie und Perfusion durchführen.
HINWEIS: Zwölf Monate alte B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5-FAD) altersgerechte Kontrollmäuse (n = 6 pro Gruppe) wurden von Verkäufern gekauft und im Tierhaus der Saginaw Valley State University gezüchtet. Die Genotypisierung wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie zuvor beschrieben7bestätigt. Menschliches AD-Gehirngewebe umfasst postmortem AD Gehirngewebe und altersgerechtes Kontrollgewebe.- Anästhesisieren Sie das Tier mit einem geeigneten Anästhetikum, wie Natriumpentobarbital (390 mg/kg Körpergewicht), oder einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (bis zu 80 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 G Nadel und 1 ml-Spritze). Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie einen Zehen kneifen. Wenn das Tier nicht reagiert, dann ist es bereit für eine Perfusionsoperation.
- Anästhesisiertes Tier in die Rückenlage auf das Perfusions-Operationstablett legen und mit einer kleinen Irisschere einen Schnitt an das hintere Ende der linken Herzkammer machen.
- Setzen Sie eine 22 G Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, um Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper zu entfernen. Verwenden Sie ein schwerkraftgespeistes Perfusionssystem, um die eiskalte Perfusionsflüssigkeit (0,1 M PBS, pH 7,4) für 5 x 6 min (Durchflussrate 20 x 25 ml/min) fließen zu lassen.
HINWEIS: Eine klare Leber ist der Indikator für eine optimale Perfusion. - Schalten Sie das Pufferventil zur Fixierung auf eine eiskalte 4%-Paraformaldehydlösung um und lassen Sie es für 8 bis 10 min fließen.
HINWEIS: Tremor gefolgt von gehärteten oder steifen Gliedmaßen sind Indikatoren für eine gute Fixierung. - Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel mit einer Schere. Mit einem Spachtel, sammeln Sie das Gehirn und legen Sie es in einer Durchstechflasche von 4% PFA (mindestens 10x das Volumen des Gehirnvolumens) und speichern bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.
2. Gewebeverarbeitung
- Schneiden Sie Kryostatabschnitte.
- Übertragen Sie das Gehirn auf abgestufte Saccharoselösungen (10%, 20% und 30%) 4 °C für jeweils 24 h lagern, bis sie verwendet werden.
- Mit einem Kryostat bei -22 °C 40 m dicke Abschnitte schneiden. Sammeln Sie 10 bis 20 Abschnitte pro Brunnen in einer 6-Well-Platte mit PBS und Natriumazid gefüllt (0,02%).
- Paraffin einbetten die Abschnitte für Maus und menschliches Gehirngewebe.
- Bei Paraffinabschnitten dehydrieren Sie das perfundierte und 24 h postfixierte Hirngewebe mit abgestuften Alkoholen (50%, 70%, 90%) für je 2 h, gefolgt von 100% Alkohol 2x für je 1 h), und dann mit Xylol 2x für je 1 h) bei Raumtemperatur.
- Mit Xylolparaffin (1:1) 2x bei 56 °C in einen mit Aluminiumfolie überzogenen Glaskolben in das Gewebe eindringen.
- Tauchen Sie das Gewebe in geschmolzenes Paraffin (56 °C) für 4 x 6 h ein.
- Schneiden Sie die 5 m dicken Abschnitte mit einem rotierenden Mikrotom bei Raumtemperatur und legen Sie sie bei 45 °C in ein Gewebewasserbad.
- Histochemisch beschriften Sie die A-Plaques in den Kryostatabschnitten mit Cur.
- Spülen Sie die Abschnitte ab Schritt 2.1.2 mit PBS (pH 7.4) 3x für je 5 min.
- Tauchen Sie die Abschnitte in 70% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur ein.
- Den Bestand Cur (1 mM) in Methanol auflösen und mit 70% Ethanol verdünnen, um eine endende Arbeitskonzentration von 10 m zu erhalten.
- Tauchen Sie die Abschnitte mit Arbeits-Cur-Lösung für 1-5 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker bei 150 Rpm.
- Discard Cur Lösung und waschen Sie mit 70% Ethanol 3x für je 2 min.
- Setzen Sie die Abschnitte auf poly-L-Lysin beschichtete Glasschlitten und montieren Sie mit einem Deckelschlupf mit organischen Montagemedien, wie Zölalmischer Xylol (DPX).
- Sehen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 480/550 nm Anregungs-/Emissionsfiltern.
- Histochemisch beschriften Sie die A-Plaques in den paraffineingebetteten Maus- und menschlichen Gehirnabschnitten mit Cur.
- Entparaffinisieren Sie die Gewebeabschnitte ab Schritt 2.2.4 mit Xylol 2x für jeweils 5 min bei Raumtemperatur.
- Rehydratisieren Sie mit abgestuften Alkohollösungen (100%, 80%, 70%, 50% für je 1 min) und mit destilliertem Wasser 2x für je 5 min bei Raumtemperatur.
- Fleckenabschnitte mit Cur (10 m) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln, schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. Waschen Sie mit 70%, 90% und 100% Alkohol für je 2 min.
- Mit Xylol 2x für je 5 min und Deckelschlupf mit DPX abschliessen.
- Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop, wie in Schritt 2.3.7 erwähnt.
- Kolokalisieren Cur mit dem A-Antikörper in A-Plaques und Oligomeren.
- Waschen Sie Kryostatabschnitte ab Schritt 2.1.2 mit PBS 3x in einer 12-Well-Platte.
- Blockieren Sie die Abschnitte mit 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS gelöst mit 0,5% Triton-X-100 bei Raumtemperatur für 1 h.
- Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Abschnitte mit A-spezifischen Antikörpern (6E10 oder A11, verdünnt 1:200), gelöst in frischer Sperrlösung, die 10% NGS und 0,5% Triton-X100 über Nacht bei 4 °C in einem Shaker bei 150 Rpm enthält.
- Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Abschnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min.
- Mit dem sekundären Antikörper-Tag mit rotem Fluorophor (z.B. Alexa 594) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie mit PBS 3x für je 10 min.
- Waschen Sie mit 70% Alkohol 1x.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit Cur (10 m) für 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie mit 70% Alkohol 3x für je 1 min.
- Mit 90% und 100% Alkohol für je 1 min dehydrieren, mit Xylol 2x für je 5 min löschen und mit DPX auf Dias montieren.
- Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern für die roten und grünen Signale.
- Bei intrazellulärer A-Kolokalisierung die Abschnitte mit A-Antikörper (6E10), Restain mit Cur bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Schütteln bei 150 U/min und Gegenfärbung mit entweder Hoechst-33342 (1 mg/ml) und/oder DAPI (1ug/ml) für 10 min bei Raumtemperatur in die Dunkelheit mit Schütteln bei 150 Rpm. Waschen mit PBS 3x.
- Nehmen Sie Bilder mit den roten, grünen und blauen Filtern mit einem 100-fachen Objektiv auf (Gesamtvergrößerung 1.000x).
- Label A-Plaques mit Thio-S, CR und FJC.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Thio-S- und CR-Kennzeichnung wurden zuvor gemeldet7.- Für FJC Färbung die frei schwebenden Abschnitte aus Schritt 2.1.2 mit PBS 3x für je 5 min waschen.
- Legen Sie die Abschnitte in eine 12 Brunnenplatte und Flecken mit FJC (0.001%) für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- FJC-Lösung entsorgen und mit PBS 3x für jeweils 5 min waschen.
- Mit Ammoniumchlorid (NH4Cl, 50 mM in PBS gelöst) für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entsorgen Sie die NH4Cl Lösung und waschen Sie sie mit PBS 3x für jeweils 5 min.
- Nach den Schritten in Abschnitt 2.4 dehydrieren Sie mit abgestuften Alkohollösungen, klar, montieren und betrachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 450/520 nm Anregungs-/Emissionsfiltern.
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Representative Results
Curcumin beschriftet A-Plaques innerhalb einer Minute. Als wir 5xFAD Gewebe mit Cur färbten, fanden wir, dass Cur-Label A-Plaques innerhalb von 1 min. Obwohl die erhöhte Inkubationszeit mit Cur die Fluoreszenzintensität von A-Plaques leicht erhöhte, war die Anzahl der beobachteten A-Plaques zwischen 1 min und 5 min Färbungszeit nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 1).
Cur kann A-Plaques in kryostat-vorbereiteter, paraffin-eingebetteter Maus und menschlichem AD-Gewebe beschriften, das mit A-spezifischen Antikörpern im Maus-AD-Gehirngewebe kolokalisiert wird. Wenn wir Kryosektion, Paraffin-eingebettete Abschnitte (Abbildung 2A) und menschliches AD-Gewebe (Abbildung 2B) färbten, beobachteten wir cur-markierte A-Plaques in allen Arten von Gewebeabschnitten. Zusätzlich, um zu bestätigen, dass Cur an A-Plaques bindet, haben wir zuerst die Plaques mit 6E10 beschriftet, gefolgt von der Härtung. Wir beobachteten, dass der Cur vollständig mit Aa an den gleichen Plaques lokalisiert wurde, die den 6E10 (Abbildung 2C) verbanden.
Cur beschriftet A- Oligomere und intrazelluläre A-Aggregate. Um zu überprüfen, ob Cur A-Oligomere kennzeichnen konnte, wurden 5xFAD-Mausabschnitte mit einem A-Oligomer-spezifischen Antikörper (A11) gefärbt, gefolgt von Der Härtung. Wir beobachteten, dass Cur mit A11 in A-Plaques kolokalisiert wurde (Abbildung 3A). In ähnlicher Weise kolokalisierte Cur auch mit dem 6E10-Antikörper in intrazellulären Räumen (Abbildung 3B), was darauf hindeutet, dass er das intrazelluläre A- kennzeichnen kann.
Cur beschriftet Aa prominenter als klassische Amyloid-Bindungsfarbstoffe. Die A-Etikettierung durch Cur wurde mit den handelsüblichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen Thio-S, CR, FJC verglichen. Als Standardkontrolle wurde der A-spezifische Antikörper 6E10 verwendet. Wir beobachteten, dass Cur Aa stärker als die herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffe kennzeichnen donierte (Abbildung 4).
Cur Derivate Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) und Demethoxycurcumin (DMC), auch in Kurkuma-Extrakt vorhanden, Label A-Plaques vergleichsweise Cur in 5xFAD Gehirngewebe. Zwei andere wichtige Komponenten, wie BDMC und DMC, sind in Kurkuma-Extrakt vorhanden. Wir haben getestet, ob diese beiden Verbindungen auch A-Plaques ähnlich wie Cur kennzeichnen. Wenn 5xFAD Maus Gehirnabschnitte mit diesen Derivaten gefärbt wurden, sowohl BDMC und DMC auch beschriftet A-Plaques, parallelling Cur (Abbildung 5A). Verschiedene Montagemedien wurden untersucht, um nach der Färbung mit Cur auf Interferenzen mit der A-Imaging zu überprüfen. Das fluoreszierende Signal war sowohl in wässrigen als auch in organischen Montagemedien wie DPX(Abbildung 5B) intakt. Die Färbung von A-Plaques mit Cur war nach der immunfluoreszenzenten Etikettierung angemessen und folgte durch Gegenfärbung mit Hoechst 33342-Lösung (1 mg/ml) oder 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1 g/ml). Die immunfluoreszierenden Signale und die Gegenfärbungsintensität wurden nach der Härtung beibehalten (Abbildung 5C).
Abbildung 1: Curcumin-Etiketten a-Plaques innerhalb einer Minute. (A). Hirnabschnitte von 5xFAD-Mäusen oder menschliche Kontrolle und AD-Kortikalgewebe wurden mit Cur (10 m) für 1 x 5 min gefärbt und die Anzahl der sichtbaren Plaques wurden gezählt. (B). Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der A-Plaque-Zahlen zwischen den 1 min und 5 min Färbezeiten beobachtet. Die Daten werden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kolokalisierung von Cur mit A-Antikörper in A-Plaques. Cur kann A-Plaques in kryostat-vorbereiteten, paraffin-eingebetteten Abschnitten (A) und menschlichem AD-Gewebe (B) beschriften. Die A-Kennzeichnung parallel zur Etikettierung mit dem A-spezifischen Antikörper (6E10, DAB-Färbung). (C). Die 5xFAD-Abschnitte wurden zuerst mit A-Antikörper (6E10) beschriftet, gefolgt von der Färbung mit Cur. Rot = 6E10 gebunden durch einen sekundären Antikörper, der mit Alexa Fluorophor 594 markiert ist. Grün = Cur. Cur vollständig kolokalisiert mit Aa an den gleichen Plaques, die an 6E10 gebunden. Pfeile weisen auf A-Plaques hin. Die Maßstabsleiste zeigt in allen drei Bildern auf der linken Seite 50 m (Gesamtvergrößerung = 400x) und 10 m (Gesamtvergrößerung = 400x) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Curcumin-Etiketten A-Oligomere und intrazelluläre A-Etiketten. (A) A-Oligomer wurde immunhistochemisch mit einem A-spezifischen Antikörper (A11) nachgewiesen, gefolgt von einer Färbung mit Cur. Cur vollständig kolokalisiert mit A, am gleichen Oligomer, wo A11 bindet. Skala bar = 250 'm und Gesamtvergrößerung = 100x. (B) Ebenso wurde die intrazelluläre A-A immunhistochemisch mit einem A-spezifischen Antikörper (6E10) nachgewiesen, gefolgt von einer Färbung mit Cur. Beachten Sie, dass Cur vollständig mit Aa in den gleichen Bereichen, die an 6E10 gebunden sind, kolokalisiert ist. Skalenbalken = 50 m und Gesamtvergrößerung = 1.000x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich verschiedener Amyloid-Bindungsfarbstoffe mit Cur zur Kennzeichnung von A-Plaques. Kryostatabschnitte (40 m) aus dem Kortex von 12 Monate alten 5xFAD-Mäusen wurden mit Cur, Thioflavin-S, Congo red, Fluoro-jade C und mit 6E10 Antikörpern gefärbt. Die beschrifteten A-Plaques sind prominenter als Thio-S, CR und FJC. Pfeile weisen auf A-Plaques hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Cur-Derivate bis-Demethoxy Curcumin und Demethoxy Curcumin kennzeichnen auch Aa ähnlich wie Cur. (A) Sowohl Kryostat- als auch Paraffin-eingebettete 5xFAD-Abschnitte wurden mit Cur-Derivaten bis-Demethoxy-Curcumin und Demethoxy-Curcumin gefärbt. Beide Derivate kennzeichnen A-Plaques in ähnlicher Weise wie Cur. (B) Sowohl wässrige als auch organische Montagemedien (DPX) wurden verwendet, um Gewebeabschnitte nach der Kennzeichnung von A-Plaques mit Cur zu montieren. (C) Immunmarkierte Abschnitte wurden für die A-Kennzeichnung mit Cur verwendet. Die weißen Pfeile zeigen A-Plaques, der grüne Pfeil zeigt aktivierte Astrozyten (GFAP) und der gelbe Pfeil zeigt nuklearen Fleck (DAPI) an. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Funktionen | A-Antikörper | Curcumin | Thio-S | Kongo rot | Fluor-Jade C |
| Dauer der Färbung | Nr. 24-48 h | 1-5 min | 10 min | 60 min | 30 min |
| Zubehörchemikalien | Sekundäre Antikörper, mehrere Chemikalien, um Puffer zu bilden, normales Ziegenserum | Methanol | Ethanol | NaOH und Ethanol | NaOH und Ethanol, Kaliumpermanganat |
| kosten | Teuer: Eine A-spezifische Antikörper-Durchstechflasche benötigt 200-300 US-Dollar | Kostengünstig: 5-10€/1 g Cur und kann für viele Gewebe angewendet werden | Kostengünstig: 5$/1 g, kann für wenige Gewebe angewendet werden | Kostengünstig: > 5 €/1 g Kongo rot, und kann für mehrere Gewebe angewendet werden | Teuer: 15.500 USD/1 g FJC-Pulver |
| Spezifität | Für A-Oligomere und Fibrillen werden unterschiedliche Antikörper benötigt | Curcumin bindet mit A-Oligomeren und Fibrillen | Kann nur Fibrillen binden, nicht Monomere oder Oligomere | Kann nur mit A-Protofibrillen und Fibrillen binden16,17 | Kann nur mit A-Fibrillen und degenerierten Neuronen binden |
| stabilität | Je nach Farbstoff, der am Sekundärantikörper befestigt ist | Sehr stabil, auch bei Raumtemperatur, wenn mit A' gebunden | Stabil in Methanol | Stabil in Ethanol | Nicht stabil |
| Pflege nach der Färbung | Benötigt zusätzliche Pflege nach der Färbung, wie im Dunkeln gehalten und die ganze Zeit eingefroren | Nicht so lichtempfindlich und stabil bei Raumtemperatur | Lichtempfindlich | Nicht lichtempfindlich | Lichtempfindlich |
| Mikroskop erforderlich | Verbundlicht oder fluoreszierend (je nach Verwendung von Sekundärantikörpern) | fluoreszierned | fluoreszierned | Lichtmikroskop oder Polarisationsmikroskop oder Polarisationsfilter | fluoreszierned |
| Hintergrundfärbung | Im Allgemeinen ist kein Hintergrund | Sehr geringer Hintergrund | Hoher Hintergrund durch Bindung mit Lipidmembran oder Lipidverbindungen in der Zelle | Niedriger Hintergrund | Hoher Hintergrund |
| In-vivo-A-Imaging | Kann nicht anwendbar sein | Hochanwendbar | Kann nicht anwendbar sein | Kann nicht anwendbar sein | Kann nicht anwendbar sein |
Tabelle 1: Vergleich der A-Etikettierung mit verschiedenen Amyloid-Bindungsfarbstoffen und Cur7.
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Discussion
Unsere Hypothese war, dass Cur als schnellste, einfachste und kostengünstigste Methode verwendet werden könnte, um A-Plaques im postmortalen AD-Gehirngewebe im Vergleich zu anderen klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen sowie A-spezifischen Antikörpern zu beschriften und abzubilden. Ziel dieser Studie war es, die Mindestzeit für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques durch Cur im postmortalen AD-Gehirngewebe zu bestimmen und zu bestimmen, ob Cur als Alternative zum A-Antikörper zur Kennzeichnung von A-Plaques verwendet werden kann. Zu diesem Zweck wurde die A-Etikettierungsfähigkeit von Cur zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet. Cur konnte innerhalb einer Minute a a- beschriften. Darüber hinaus war die Etikettierung von Aa durch Cur größer als bei anderen herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen wie Thio-S (0,1%), CR (1%) und FJC (0,001%).
Cur gilt als ein einzigartiges und ideales Fluorophor für die A-Etikettierung, da es die meisten Eigenschaften hat, die von den meisten konventionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen besessen sind, einschließlich struktureller, physikalischer, chemischer und biologischer Eigenschaften10. Darüber hinaus sind die meisten Forscher aufgrund der Erschwinglichkeit an der Verwendung dieses natürlichen Polyphenols interessiert. Um die Spezifität der Cur-Bindung an A-Plaques und Oligomere zu zeigen, haben wir 6E10 und A11 (A-Oligomer-spezifischer Antikörper) verwendet. Cur zeigte fast vollständige Kolokalisierung mit allen verschiedenen Arten von A, die im Gewebe vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass Cur sehr spezifisch für A7,17,18,19,20ist. Darüber hinaus wurden die mit A-Oligomeren (Abbildung 3A) und den intrazellulären A-Aggregaten (Abbildung 3B) gekennzeichneten und mit A-Antikörpern kolokalisierten (Abbildung 2B) und deuteten darauf hin, dass Cur nicht nur extrazelluläre A-Plaques, aber auch Aa in intrazellulären Räumenabgelagert 7.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Fluorophore und Antikörper entwickelt, um A-Plaques histochemisch zu kennzeichnen und abzubilden. Zweifellos sind die meisten von ihnen sehr spezifisch für gezielte A-Arten und für den Nachweis von A-Plaques, aber diese sind viel teurer und ihre Verwendung ist zeitaufwändiger als die Verwendung von Cur. Zum Beispiel verglichen wir die A-Plaque-Bindung durch Cur mit anderen Amyloid-Bindungsfarbstoffen, wie Thio-S, CR und FJC, wobei der A-spezifische Antikörper (6E10) als Referenzkontrolle verwendet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cur-Etiketten A-Plaques stärker als alle anderen Fluorophore. Am wichtigsten ist, dass einige der am häufigsten verwendeten Fluorophore im Vergleich zu Cur deutliche Nachteile in Bezug auf die Etikettierung und die Bildgebung von Aa haben. Zum Beispiel kann Thio-S einen ablenkenden, hohen Hintergrund erzeugen, weil es mit Lipidmembranen oder Lipidverbindungen in der Zelle21bindet. In ähnlicher Weise erzeugt CR, das häufig verwendet wird, um Aa zu beschriften, unter einem polarisierten Mikroskop eine apfelgrüne Birefreringe (Abbildung 4). CR kenntiert die A-Plaques nicht so leicht wie Cur oder Thio-S und beschriftet deutlich weniger A-Plaques als die von Cur7,22,23. Gutierrez et al. berichteten, dass FJC, das mit Aa und mit degenerierten Neuronen binden kann, mit einer niedrigeren Frequenz als Cur oder Thio-S24etikettiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese häufig verwendeten klassischen Marker weniger Affinität für die Bindung an A-Plaques als Cur haben.
Darüber hinaus kann die Kennzeichnung verschiedener A-Plaque-Typen (Kern, neuritische, diffuse, burned-out) mit Cur optimiert werden, anstatt mit anderen Amyloid-Bindungsfluorophoren, da Cur dazu beitragen kann, morphologisch unterschiedliche A-Plaques zu visualisieren und zu unterscheiden, während andere Techniken unterscheiden diese morphologischen Subtypennicht 7. In ähnlicher Weise ist die Verwendung von A-spezifischen Antikörpern, die sehr spezifisch für verschiedene Arten von Aa sind, sehr kostspielig und zeitaufwändig, wobei mindestens 24-48h über die Immunhistochemie verwendet werden. Darüber hinaus erfordert der Nachweis verschiedener Arten von Aa verschiedene Antikörper sowie mehrere Zubehörchemikalien, was die Gesamtkosten erheblich erhöht. Offensichtlich ist Cur kostengünstiger, leichter verfügbar und erzeugt eine höhere Fluoreszenzintensität, wenn es an A-Plaques bindet. Obwohl CR auch eine relativ kostengünstige Technik zur Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques ist, kann Cur mehr der A-Arten binden und beschriften, wie oligomere25 (Abbildung 3 und Abbildung 4), während CR nur an Protofibrillen und fibrils23. Daher kann die A-Kennzeichnung mit Cur effizienter und kostengünstiger erreicht werden als durch Thio-S, CR oder FJC (Tabelle 1).
Zusammenfassend kann Cur A-Plaques und Oligomere aus AD-Gehirngewebe effektiv, schnell und kostengünstig erkennen. Darüber hinaus ist Cur-Bindung an Aa sehr spezifisch und seine fluoreszierende Aktivität ist sehr stabil. Es erfordert minimale Mengen (1-10 nM), um A zu beschriften. Darüber hinaus ist Cur auch sehr spezifisch für verschiedene A-Arten, wie Fibrillen oder Plaques, sowie Oligomere7. In ähnlicher Weise besitzen Cur-Derivate Demethoxycurcumin und Bisdemethoxycurcumin ebenfalls Amyloidbindungseigenschaften und c-Label Aa ähnlich wie Cur10 (Abbildung 5A). Daher ist Cur ein ideales Fluorophor für die Kennzeichnung und Bildgebung von A-Plaques im postmortalen Hirngewebe. Es kann als schnelle und einfache Alternative verwendet werden, um die Belastung der A-Plaque nach der Anti-Amyloid-Therapie in experimentellen Tiermodellen von AD zu erkennen. Unsere Ergebnisse bestätigen die Berichte über die hohe Affinität von Cur zu A, was seine mögliche Verwendung zur Überwachung von A-Plaques im postmortalen Gehirn und im lebenden Gewebe verstärkt.
Für eine optimale Cur-Etikettierung wird empfohlen, Aa nicht mit Cur in undurchlässigem Gewebe zu kennzeichnen und eine langfristige Gewebelagerung zu vermeiden, da sie eine größere Menge an Hintergrund, auch wenn durchgeflossen, erzeugen kann. Für die Co-Etikettierung wird empfohlen, die Immunhistochemie zunächst mit dem spezifischen Antikörper abzuschließen, der vor der Färbung mit Cur verwendet wird, und dann mit Gegenfärbung mit DAPI oder Hoechst zu folgen.
Mögliche Änderungen an dieser Methode sind die Erhöhung der Inkubationszeit von Cur mit dem Gewebe für bis zu 30 min, die nicht mit der Signalintensität stören, obwohl es Hintergrund während der Bildgebung erhöhen kann. Die Verringerung der Cur-Konzentration auf weniger als 10 m stört die A-Kennzeichnung nicht auf ein signifikantes Niveau. Um den Hintergrund für menschliches Hirngewebe zu reduzieren, könnte eine alternative Präparationsmethode angewendet werden. Beispielsweise könnten Hirnabschnitte zunächst mit 0,3% (w/v) Sudan Black B in 70% Ethanol (v/v) für 10 min bei Raumtemperatur behandelt werden. Dann könnte der Abschnitt mit Cur für 10 min bei Raumtemperatur gebeizt werden, und mit PBS 3x für 15 min gewaschen, gegenfärbung, und montiert mit Antifading-Medien13. Auch die Dicken der Kryostat-Sektion konnten auf 20 bis 25 m reduziert werden.
Mögliche Vorbehalte gegen diese Methode sind Cur-Bindung mit Aa in den Blutgefäßen vorhanden, die sich von den extrazellulären A-Plaques unterscheidet. Daher sollte der Prüfer sich der Morphologie von A-Plaques und Oligomeren aus Aa in den Blutgefäßen bewusst sein. Der Prüfer sollte sich der autofluoreszierenden Signale bewusst sein. Überschüssigegrüne Hintergrund kann gelegentlich nach Cur Färbung gesehen werden, aber dies kann durch Verringerung der Färbung Zeit oder durch Verringerung der Konzentration von Cur reduziert werden. Schließlich kann das Signal für die Koetikettierung mit anderen Markern durch wiederholte Behandlungen mit dem Clearingmittel (z. B. Xylol) reduziert werden.
Wichtige Einschränkungen sind die Unfähigkeit, mit einem Markerprotein mit sekundären Antikörpern, die mit grünem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, wie fluoreszierendes Isothiocyanat (FITC), mit zu kennzeichnen. Diese können aufgrund der ähnlichen Anregung/Emission von Cur nicht verwendet werden. Auch in den frühen Stadien von AD, nur begrenzte Mengen von Aa kann durch Cur gekennzeichnet werden. Schließlich ist es notwendig, in dunkler Umgebung wie jeder Fluoreszenzfarbstoff zu arbeiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Unterstützung für diese Studie kam vom Field Neurosciences Institute at Ascension of St. Mary es.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
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