Summary
כורכומין הוא fluorophore האידיאלי עבור תיוג והדמיה של שלטי החלבון ביתא עמילואיד ברקמת המוח בשל הכריכה המועלת שלה לחלבון ביתא עמילואיד, כמו גם הדמיון המבני שלה עם אחרים מאגד עמילואיד מסורתי צבעים. זה יכול לשמש התווית ביתא עמילואיד התמונה לוחיות החלבון ביעילות רבה יותר מאשר שיטות מסורתיות.
Abstract
התצהיר של חלבון בטא עמילואיד (Aβ) בחללים נוספים ו תאיים הוא אחד הפתווגיות בעלי ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD). לכן, זיהוי נוכחות של Aβ ברקמת המוח לספירה הוא כלי רב ערך לפיתוח טיפולים חדשים כדי למנוע את ההתקדמות של AD. מספר כריכת עמילואיד הקלאסי, fluorochrome, הדמיה בדיקה, ו נוגדנים ספציפיים Aβ שימשו כדי לזהות היסטלוכימית Aβ ברקמת המוח לספירה. השימוש תרכובות אלה עבור זיהוי Aβ הוא יקר זמן רב. עם זאת, בגלל פעילות פלורסנט אינטנסיבי שלה, אהדה גבוהה, וספציפיות עבור Aβ, כמו גם קווי דמיון מבניים עם כריכת עמילואיד מסורתיים הצבעים, כורכומין (Cur) הוא מועמד מבטיח תיוג והדמיה של שלטי Aβ בנתיחה שלאחר המוות . רקמת מוח זה פוליפנול טבעי מן העשב Curcuma longa. במחקר הנוכחי, שימש נוכחי תווית היסטAβ לוחיות שלטים ממודל העכבר הגנטי של מחלת אלצהיימר 5x משפחתית (5Xאופנה) ומרקמת האדם האנושי בתוך דקה. יכולת התיוג של נוכחי הושווה לצבעי עמילואיד קונבנציונליים, כגון thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג'ייד C (FJC), כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ (6E10 ו A11). הבחנו כי הנוכחי הוא הדרך הזולה ביותר והמהירה ביותר כדי לתייג ולצלם את הפלאק Aβ בהשוואה לצבעים אלה קונבנציונאלי והוא דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ. בנוסף, הוא נקשר עם רוב המינים Aβ, כגון oligomers ו fibrils. לכן, הנוכחי יכול לשמש כסוכן החסכוני ביותר, פשוט, ומהיר fluorochrome לזיהוי עבור הפלאק Aβ.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת הנפוצות ביותר, הקשורות לגיל, הפרעות נוירולוגיות מתקדמת ואחד הגורמים המובילים של המוות ברחבי העולם1,2. למידה, זיכרון וליקויי קוגניציה, יחד עם הפרעות נפשיות, הן התסמינים השכיחים הנראים לספירה3. למרות האטיולוגיה של AD לא היה מובהר לחלוטין, הראיות הגנטיות, הביוכימי, וניסיוני מציין כי ההצהרה הדרגתית של Aβ הוא ביוארקר מוחלט עבור AD4. חלבון זה מקופל מצטבר בחללים תאיים ומחלוניים והוא נחשב להיות מעורב באובדן סינפטית, מוגברת דלקת נוירו, ו ניוון נוירוטיות באזורי היפוקמאל במוח המושפע על ידי AD5. לכן, גילוי היסטכימיות של Aβ ברקמת AD הוא צעד ראשון מכריע בפיתוח לא רעילים, תרופות נגד עמילואיד כדי למנוע התקדמות AD.
במהלך העשורים האחרונים, מספר צבעים ונוגדנים שימשו על ידי מעבדות מחקר רבות כדי תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח, אבל כמה שיטות אלה הם זמן רב, צבע או נוגדנים בשימוש הם יקרים, הדורשים מספר אביזר כימיקלים. לכן, פיתוח של אמצעי זול לגילוי של שלטי Aβ במוח המודעה יהיה כלי מבורך חדש. מעבדות רבות החלו להשתמש Cur, מבטיח אנטי עמילואיד טבעי polyphenol, עבור תיוג והדמיה Aβ, כמו גם סוכן טיפולי עבור AD6,7,8,9. ההידרופוטוליטי והטבע הלינופילית, קווי דמיון מבניים עם צבעי עמילואיד קלאסיים, פעילות פלורסנט חזקה, כמו גם זיקה חזקה לאגד עם Aβ עושה את זה במיוחד fluorophore לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת לספירה10 . נוכחי נקשר עם Aβ-לוחות oligomers ונוכחותו מזוהה גם בחללים תאיים7,11,12,13. בנוסף, זה הוכח כי כמויות מינימליות (1-10 ננומטר) של נוכחי יכול לסמן Aβ שלטים במחלת אלצהיימר משפחתית 5x (5Xתחביב) רקמת המוח7. למרות הריכוזיות 1 ננומטר אינו מספק את עוצמת הקרינה האופטימלית לספירת שלטים Aβ, 10 ננומטר או ריכוז גבוה יותר של נוכחי עושה. רן ועמיתיו14 דיווחו כי מינונים נמוכים כמו 0.2 ננומטר של difluoroboron-לעבוד על הvivo Aβ פיקדונות כמעט כמו גם בדיקה אינפרא אדום. אם מינון זה מספיק כדי תווית Aβ שלטים ברקמה עדיין לא ברור. רוב המחקרים הקודמים השתמשו 20-30 דקות לצביעת לוחיות Aβ באמצעות Cur, אך כתמים אופטימליים עשוי לדרוש הרבה פחות זמן.
המחקר הנוכחי תוכנן כדי לבדוק את הזמן המינימלי הנדרש על ידי Cur כדי תווית Aβ פלאק ברקמת המוח לספירה וכלה להשוות את הרגישות לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת המוח של העכברים 5xFAD לאחר הצביעת עם נוכחי עם קונבנציונאלי אחרים Aβ-כריכת צבעים, כגון Thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג'ייד C (FJC). היכולת תיוג Aβ של אלה הצבעים הקלאסיים עמילואיד מחייב הושווה עם כתמים נוכחי ב פרפין-מוטבע וקריוסטט מקטעים המוח ילתית מן העכברים 5xfad מן הבוגרת התואמת האדם לספירה ושליטה רקמת המוח. הממצאים מראים כי תוויות Cur שלטים Aβ באופן דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ (6E10) בינוני טוב יותר מאשר Thio-S, CR, או FJC. בנוסף, כאשר זריקות הצפק של Cur לעכברים 5xFAD היו מנוהלים עבור 2-5 ימים, זה חצה את מחסום הדם-מוח מאוגד עם שלטים Aβ7. מעניין, ריכוזי nanomolar של נוכחי שימשו תוויות ותמונה Aβ פלאק ברקמת מוח 5xfad7,14. יתר על כן, שלטים מורפולוגית ברורים Aβ, כגון הליבה, neuritic, לפזר, ונשרף-out שלטים ניתן לתייג על ידי נוכחי ביעילות יותר מאשר עם כל אחד האחרים מאגד עמילואיד בעלי צבע7. בסך הכל, הנוכחי יכול להיות מוחל על תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח לאחר המוות של AD מודלים בעלי חיים ו/או רקמת AD האדם בצורה קלה וזולה, כחלופה אמינה לנוגדנים ספציפיים Aβ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (ACUC) של אוניברסיטת סאטינואו וואלי סטייט. רקמת האדם הושגה מבנק המוח הוקמה במכון הבריאות של השמש באנר באריזונה15,16.
1. פרזיה של בעלי החיים
- הכן את מאגרי התיקונים והפרזיה.
- להכין 0.1 M נתרן פוספט מאגר על ידי הוספת 80 g של נתרן כלוריד (הנאל), 2 גרם של אשלגן כלוריד (kcl), 21.7 g של ניתרן מימן פוספט (Na2hpo4· 7h2O), 2.59 g של אשלגן ניתרן ימן פוספט (KH2PO4 ), מים מזוקקים כפולים כדי לעשות סכום של 1 L.
- הכינו 4% פאראפורמלדהיד.
- הוסף 40 g של פאראפורמלדהיד ל 1 L של PBS (0.1 M, pH 7.4).
- מחממים את התמיסה לחצי הדרך לכביש 60 עד 65 ° צ' ומערבבים בעזרת מערבב מגנטי.
הערה: הטמפרטורה לא תעלה על 65 ° c. - להוסיף מספר טיפות NaOH (1 N) עם טפטפת לפזר את החצי הראשון לחלוטין.
- לסנן את הפתרון בכיוון הבינוני עם נייר סינון בינוני עד דק ולאחסן ב-4 ° c.
הערה: הפתרון טוב לחודש.
- בצע הרדמה לבעלי חיים ופרזיה.
הערה: שנים עשר חודשים-B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 × האופנה) גיל-התאמה עכברים שליטה (n = 6 לכל קבוצה) נרכשו מספקים והתרבו בבית החיות של האוניברסיטה הממלכתית של Saginaw. הגנוהקלדה אושרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כמתואר בעבר7. האדם רקמת המוח האנושית כוללת לאחר המוות רקמת המוח לספירה והגיל התאמה רקמת שליטה.- להפחית את בעל החיים עם סוכן הרדמה מתאים, כגון נתרן פנטוברביטל (390 mg/ק"ג משקל הגוף), או תערובת קטמין/xylazine (עד 80 מ"ג/ק"ג משקל הגוף קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג משקל הגוף xylazine) על ידי הזרקה הצפק (27 G המחט 1 מזרק mL). בדוק את רמת ההרדמה. על ידי צביטה בבוהן אם בעל החיים אינו מגיב, אז הוא מוכן לניתוח פרזיה.
- המקום בעלי חיים מורדם במצב פרקדן על מגש הניתוח זלוף ושימוש במספריים קטנות איריס לעשות חתך לקצה האחורי של החדר השמאלי.
- הכנס מחטים של 22 G זלוף אל החדר השמאלי ולעשות חתך קטן על האוריקל הנכון להסיר נוזל זלוף מהגוף. השתמש מערכת ההזנה הכבידה המזון כדי לאפשר את נוזלי הקרח קר זלוף (0.1 M PBS, pH 7.4) לזרום עבור 5-6 דקות (שיעור הזרימה 20 על 25 מ ל/דקה).
הערה: כבד בהיר הוא האינדיקטור לפרזיה אופטימלית. - העבר את שסתום החוצץ לתמיסת קרח קר 4% פאראפורמלדהיד לתיקון ואפשר לו לזרום במשך 8-10 דקות.
הערה: רעידות ואחריו גפיים מוקשח או נוקשה הם אינדיקטורים של קיבעון טוב. - להסיר את המוח מהגולגולת באמצעות מספריים. באמצעות מרית, לאסוף את המוח ולמקם אותו בבקבוקון של 4% בתחתית (לפחות 10x נפח המוח) ולאחסן ב 4 ° c עד שימוש נוסף.
2. עיבוד רקמה
- . חתכי את חלקי הקריוסטט
- העברת המוח לפתרונות מדורגים (10%, 20% ו -30%) ולאחסן ב-4 ° c עבור 24 שעות כל אחד, עד השימוש.
- באמצעות קריוסטט ב-22 ° c, גזור 40 μm-עבה סעיפים. לאסוף 10-20 סעיפים לכל טוב בצלחת 6 היטב מלא עם PBS ו נתרן אזיד (0.02%).
- פרפין להטביע את מקטעי העכבר ואת רקמת המוח האנושי.
- עבור מקטעי פרפין, הצבת רקמת המוח לאחר והוא 24 h לאחר קבוע עם האלכוהול מדורגים (50%, 70%, 90%) עבור 2 h כל אחד, ואחריו 100% אלכוהול 2x עבור 1 h כל אחד), ולאחר מכן עם קסילן 2x עבור 1 h כל אחד בטמפרטורת החדר.
- לחדור את הרקמה עם קסילן-פרפין (1:1) 2x עבור 1 h ב 56 ° צ' בבקבוקון זכוכית חרוט מכוסה רדיד אלומיניום.
- הישאב את הרקמה בפרפין (56 ° c) עבור 4 עד 6 שעות.
- גזור 5 μm-חלקים עבים באמצעות מיקרוטומה רוטרי בטמפרטורת החדר ומניחים אותם באמבט מים הרקמה ב 45 ° c.
- היסטכימית לסמן את הפלאק Aβ בסעיפים קריוסטט עם Cur.
- לשטוף את הסעיפים משלב 2.1.2 עם PBS (pH 7.4) 3x עבור 5 דקות כל אחד.
- לטבול את הסעיפים ב 70% אתנול עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- התמוססות מניות Cur (1 מ"מ) ב מתנול ו לדלל עם 70% אתנול כדי להשיג ריכוז העבודה הסופי של 10 μM.
- לטבול את המקטעים עם פתרון נוכחי עבודה עבור 1-5 דקות על טמפרטורת החדר על שייקר ב 150 סל ד.
- להיפטר פתרון נוכחי ולשטוף עם 70% אתנול 3x עבור 2 דקות כל אחד.
- הניחו את המקטעים על שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזין והבהר עם שמיכות באמצעות מדיה הרכבה אורגנית, כגון קסילן (DPX).
- מבט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות 480/550 מסנני עירור/פליטה ננומטר.
- היסטכימית תווית הפלאק Aβ ב פרפין-עכבר מוטבע מקטעים המוח האנושי עם Cur.
- מחלקים את חתכי הרקמה משלב 2.2.4 עם קסילן 2x עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- הידרוקסיד מחדש עם פתרונות אלכוהול מדורגים (100%, 80%, 70%, 50% עבור 1 דקות כל אחד) עם מים מזוקקים 2x עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- קטעי כתם עם Cur (10 μM) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, רועד ב 150 סל ד. שטוף עם 70%, 90%, ו 100% אלכוהול עבור 2 דקות כל אחד.
- ברור עם קסילן 2x עבור 5 דקות כל מכסה לכסות עם DPX.
- המחש תחת מיקרוסקופ של זריחה כפי שהוזכר בשלב 2.3.7.
- לוקליזציה עם נוגדן Aβ בפלאק Aβ ו oligomers.
- כביסה מקטעים קריוסטט משלב 2.1.2 עם PBS 3x ב 12 צלחת הבאר.
- לחסום את הסעיפים עם 10% סרום עז רגיל (NGS) הומס PBS עם 0.5% טריטון-X-100 בטמפרטורת החדר עבור 1 h.
- מחק את פתרון החסימה. מודלת את הסעיפים עם נוגדנים ספציפיים Aβ (6E10 או A11, מדולל 1:200) מומס פתרון חסימת טרי המכיל 10% NGS ו 0.5% טריטון-X100 לילה ב 4 ° c ב שייקר ב 150 rpm.
- להיפטר פתרון נוגדן לשטוף את הסעיפים עם PBS 3x עבור 10 דקות כל אחד.
- דגירה עם תג נוגדן משני עם fluorophore אדום (למשל, אלקסה 594) עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
- לשטוף עם PBS 3x עבור 10 דקות כל אחד.
- לשטוף עם 70% אלכוהול 1x.
- מודיית את הסעיפים עם Cur (10 μM) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף עם 70% אלכוהול 3x עבור 1 דקות כל אחד.
- מייבשים עם 90% ו 100% אלכוהול עבור 1 דקות כל אחד, ברור עם xy2x עבור 5 דקות כל אחד, ו הר על שקופיות באמצעות DPX.
- המחש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית עם מסנני עירור/פליטה מתאימים לאותות האדומים והירוקים.
- עבור Aβ colocalization לוקליזציה, כתם את הסעיפים באמצעות Aβ-נוגדן (6e10), restain עם Cur בטמפרטורת החדר בחושך עם טלטול ב 150 סל ד, וכתמים עם או hoechst-33342 (1 מ"ג/ml) ו/או dapi (1ug/ml) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ב הכהה עם טלטול ב 150 סל ד. לשטוף עם PBS 3x.
- לצלם תמונות עם מסננים אדום, ירוק, כחול עם מטרה 100x (הגדלה מלאה 1, 000x).
- תווית Aβ פלאק עם Thio-S, CR, ו-FJC.
הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור התיוג Thio-S ו-CR דווחו בעבר7.- עבור כתמים FJC, לשטוף את הקטעים צף חופשי המתקבלים משלב 2.1.2 עם PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
- מניחים את הסעיפים בצלחת 12 ומכתים עם FJC (0.001%) בטמפרטורה של 10 דקות בחשיכה בטמפרטורת החדר.
- להיפטר הפתרון FJC ולשטוף עם PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
- דגירה עם אמוניום כלוריד (NH4Cl, 50 mM מומס ב-PBS) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- להיפטר NH4Cl פתרון ולשטוף עם PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
- בעקבות השלבים בסעיף 2.4, מייבשים עם פתרונות אלכוהול מדורגים, ברור, הר, ולהציג תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות 450/520 עירור/פליטה ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדבקות כורכומין Aβ שלטים בתוך דקה. כאשר אנו מוכתם רקמות 5xFAD עם Cur, מצאנו כי התווית הנוכחי Aβ לוחיות בתוך 1 דקות. למרות זמן הדגירה המוגבר עם Cur מעט הגדילה את עוצמת הקרינה של הפלאק Aβ, מספר שלטים שנצפו Aβ לא היה שונה באופן משמעותי בין 1 דקות ו 5 דקות מכתים זמן (איור 1).
נוכחי יכול לתייג שלטים Aβ בקריוסטט-מוכן, פרפין מוטבע העכבר ורקמת AD האדם הממבצים עם נוגדנים ספציפיים Aβ בעכבר לספירה רקמת המוח. כאשר אנו מוכתם קריודור, פרפין מוטבע סעיפים (איור 2A) ואת רקמת המודעה האנושית (איור 2B), הבחנו התווית Aβ לפלאק בכל סוגי מקטעי רקמות. בנוסף, כדי לוודא כי נוכחי הוא מחייב את הפלאק Aβ, אנו לראשונה התווית את הפלאק עם 6E10, ואחריו כתמים הנוכחי. הבחנו כי הנוכחי היה לגמרי שיתוף מקומי עם Aβ באותם שלטים שקשרו את 6E10 (איור 2ג).
נוכחי המסומנים Aβ oligomers ו תאיים Aβ אגרגטים. כדי לבדוק אם Cur יכול לתייג את Aβ oligomers, מקטעים העכבר 5xFAD מוכתם עם נוגדן Aβ oligעומר ספציפי (A11), ואחריו כתמים נוכחי. הבחנו כי נוכחי מקומי עם A11 בפלאק Aβ (איור 3א). באופן דומה, Cur גם מקומי עם הנוגדן 6E10 בחללים תאיים (איור 3B), המציין כי זה יכול לתייג את Aβ תאיים.
נוכחי שכותרתו Aβ בולט יותר מאשר צבעים כריכת עמילואיד קלאסי. Aβ תיוג ידי נוכחי הושווה עם כריכת עמילואיד זמין מסחרית צבע Thio-S, CR, FJC. הנוגדן הספציפי Aβ 6E10 שימש כפקד רגיל. הבחנו כי נוכחי התווית Aβ בולט יותר מאשר הצבעים כריכת עמילואיד קונבנציונאלי (איור 4).
הנגזרים האלה bis-demethכורכוכמין (BDMC) ו demethאוקסיכוכמין (DMC), גם נוכח תמצית כורכום, תווית Aβ לוחיות יחסית ל נוכחי ברקמת המוח 5xFAD. שני מרכיבים עיקריים אחרים, כגון BDMC ו-DMC, נמצאים בתמצית כורכום. בדקנו אם שתי תרכובות אלה גם לתייג שלטים Aβ דומה Cur. כאשר מקטעי המוח העכבר 5xFAD היו מוכתמים בנגזרות אלה, הן BDMC ו-DMC גם התווית Aβ הפלאק, מקבילים Cur (איור 5א). מדיה הרכבה שונה נחקרו כדי לבדוק הפרעות עם Aβ-הדמיה לאחר הצביעת עם Cur. אות הפלורסנט היה שלם במדיה הרכבה אורגנית מימית, כגון DPX (איור 5ב). הצביעת של שלטים Aβ עם נוכחי היה מתאים לאחר תיוג אימונוofor, ואחריו כתמים נגד עם Hoechst 33342 פתרון (1 מ"ג/ml) או 4 ′, 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI, 1μg/ml). האותות האימונולואוורקיים ועוצמת הצביעה הנגדית שמרו לאחר הצביעת (איור 5ג).
איור 1: מדבקות כורכומין Aβ שלטים בתוך דקה. (א). מקטעי מוח מעכברים 5xfad או השליטה האנושית ורקמת לספירה הקורטיבד היו מוכתמים עם Cur (10 μm) עבור 1-5 דקות ומספר הפלאק גלוי נספרו. (ב) לא נצפתה כל הבדל במספר הספירות של Aβ-פלאק בין הפעמים 1 דקות ו -5 דקות של כתמים. נתונים מיוצגים כממוצע שגיאה סטנדרטית של ממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לוקליזציה של נוכחי עם נוגדן Aβ בפלאק Aβ. נוכחי יכול לתייג שלטים Aβ בקריוסטט מוכן, פרפין מוטבע סעיפים (א) ורקמת AD האדם (ב). Aβ תיוג וקרב את התיוג עם נוגדן ספציפי Aβ (6E10, כתמים מכתים). (ג). סעיפים 5xfad המסומנים לראשונה עם הנוגדן Aβ (6E10), ואחריו כתמים עם Cur. אדום = 6E10 המאוגד על ידי נוגדן משני מתויג עם אלקסה fluorophore 594. ירוק = נוכחי. הייתה מותאמת לחלוטין עם Aβ באותם שלטים שמאוגדים ל-6E10. חיצים מציינים שלטים Aβ. סרגל קנה מידה מציין 50 יקרומטר (הגדלה כוללת = 400x) בכל שלושת התמונות משמאל, ו-10 יקרומטר (הגדלה כוללת = 400x). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוויות כורכומין Aβ oligomers ו תאיים Aβ. (א) Aβ-oligomer זוהה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדן ספציפי Aβ (A11), ואחריו כתמים עם Cur. מותאם לחלוטין עם Aβ, באותו אוליגומר שבו A11 נקשר. סרגל קנה מידה = 250 יקרומטר והגדלה כוללת = 100x. (ב) באופן דומה, Aβ תאיים זוהה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדן ספציפי Aβ (6E10), ואחריו כתמים עם Cur. שים לב ש-Cur מותאם לחלוטין עם Aβ באותם אזורים המאוגדים ל-6E10. סרגל קנה מידה = 50 יקרומטר ואת ההגדלה הכוללת = 1, 000x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה בין מאגד עמילואיד שונים עם Cur כדי תווית Aβ הפלאק. הקריוסטט סעיפים (40 μm) מקליפת המוח של 12 חודשים העכברים 5xFAD היתה מוכתם עם הנוכחי, Thioflavin-S, קונגו האדום, Fluoro-ג ' ייד C, עם נוגדן 6E10. נוכחי שכותרתו Aβ פלאק בולט יותר מאשר Thio-S, CR, ו-FJC. חיצים מציינים שלטים Aβ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נוכחי-נגזרות של כוראוקסי כורכוכמין ומדאוקסי כורכמין גם מתייג את Aβ בדומה ל-Cur. (א) גם בקריוסטט ובפרפין-מקטעיםשל 5xfad המוכתמים בנגזרים משובצים-מטאוקסי כורכמון ודמוטאוקסי כורכמין. שני הנגזרים האלה מתייג Aβ שלטים באופן דומה ל-Cur. (ב) הן מימית והן מדיה הרכבה אורגני (dpx) שימשו לטעינת מקטעים רקמות לאחר תיוג Aβ לוחיות עם Cur. (ג) מקטעים אימונויניום שימשו לתיוג Aβ עם Cur. החצים הלבנים מצביעים על הפלאק Aβ, החץ הירוק מציין אסטרוציט פעיל (gfap), ואת החץ הצהוב מציין כתם גרעיני (dapi). קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| תכונות | Aβ-נוגדן | כורכומין | . טי-אס | קונגו האדומה | פלואורו-ג'ייד C |
| משך הצביעת | ~ 24-48 h | ~ 1-5 דקות | ~ 10 דקות | ~ 60 דקות | ~ 30 דקות |
| כימיקלים לאבזר | , נוגדנים משניים, כימיקלים שונים. כדי ליצור מאגר, סרום עז רגיל | מתנול | אתנול | נאאה ואתנול | נאאה ואתנול, אשלגן פרמנגנט |
| עלות | יקר: אחד Aβ בקבוקון נוגדן דורש ~ $200-300 | עלות אפקטיבית: ~ $5-10/1 g נוכחי והוא יכול להיות מוחל עבור רקמות רבות | עלות אפקטיבית: ~ $5/1 g, ניתן להחיל עבור מספר רקמות | עלות חסכונית: > $5/1 g קונגו האדום, ניתן להחיל עבור מספר רקמות | יקר: ~ $15.500/1 g FJC אבקה |
| ספציפיות | נוגדנים שונים נדרשים עבור Aβ oligomers ו סיבים | כורכומין נקשר עם Aβ לייגמרים ופיברילס | ניתן לאגד רק משקפיים, לא מונומרים, או מאולימרים | ניתן לאגד רק עם Aβ-פרוטופיבריס ופיברילס16, 17 | ניתן לאגד רק עם Aβ-fibrils ונוירונים מנוונת |
| יציבות | בהתאם לצבע המצורף לנוגדן המשני | יציב מאוד, אפילו בטמפרטורת החדר כאשר כרוך עם Aβ | יציבה במתנול | יציבה באתנול | לא יציב |
| טיפול לאחר הצביעת | זקוק לטיפול נוסף לאחר כתמים, כגון שמור בחושך וקפוא כל הזמן | לא רגיש באור ויציב יותר בטמפרטורת החדר | רגיש לאור | לא רגיש לאור | רגיש לאור |
| מיקרוסקופ נדרש | מתחם אור או פלורסנט (בהתאם לשימוש בנוגדן משני) | פלורסנט | פלורסנט | מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ מקוטב או סינון מקטזי | פלורסנט |
| צביעת רקע | באופן כללי, אין רקע | רקע נמוך מאוד | רקע גבוה בשל קשירה עם ממברנה השומנים או תרכובות השומנים בתא | רקע נמוך | רקע גבוה |
| ב vivo Aβ-הדמיה | ייתכן שאינו ישים | מאוד רלוונטי | ייתכן שאינו ישים | ייתכן שאינו ישים | ייתכן שאינו ישים |
טבלה 1: השוואה של Aβ תיוג עם צבעים שונים של מאגד עמילואיד ו7נוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההשערה שלנו הייתה כי הנוכחי יכול לשמש כדרך המהירה, הקלה ביותר, והזולה ביותר לתווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח הנתיחה לאחר המוות בהשוואה לצבעים אחרים של האיגוד עמילואיד, כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ. מטרות מחקר זה היו כדי לקבוע את הזמן המינימלי הנדרש תווית ותמונה לוחיות Aβ ידי Cur בנתיחה לאחר המוות המוח לספירה ולקבוע אם הנוכחי יכול לשמש כחלופה Aβ נוגדן עבור תיוג Aβ פלאק. למטרה זו, Aβ-יכולת תיוג של נוכחי נצפתה בנקודות זמן שונות. נוכחי הצליח לתייג את Aβ תוך דקה אחת. בנוסף, תיוג של Aβ על ידי Cur היה גדול יותר מאשר אחרים בעלי כריכת עמילואיד, כגון Thio-S (0.1%), CR (1%), ו-FJC (0.001%).
נוכחי נחשב פלואורואופלפור ייחודי ואידיאלי עבור תיוג Aβ, כי יש לו את רוב המאפיינים הנשלטים על ידי רוב הצבעים כריכת עמילואיד קונבנציונאלי, כולל מבנית, פיזית, כימית, ותכונות ביולוגיות10. בנוסף, בשל מחיר סביר, רוב החוקרים מעוניינים בשימוש זה polyphenol טבעי. כדי להראות את הספציפיות של הכריכה הנוכחי לפלאק Aβ ו-oligomers, השתמשנו 6E10 ו-A11 (Aβ-oligיומר-נוגדן ספציפי). נוכחי הראה כמעט מלאה לוקליזציה עם כל המינים השונים של Aβ הנוכחי ברקמה, אשר מציע כי הוא ספציפי מאוד כדי Aβ7,17,18,19,20. בנוסף, נוכחי שכותרתו Aβ oligomers (איור 3A) ואגרגטים Aβ תאיים (איור 3ב) ו מקומי עם Aβ נוגדנים (איור 2b), הרומז כי התווית הנוכחי יכול לא רק מסחטות Aβ לוחיות, אבל גם Aβ הופקד בחללים תאיים7.
במהלך העשורים האחרונים, מספר fluorophores ונוגדנים פותחו התווית והתמונה Aβ לוחיות היסטורכימית. ללא ספק, רובם מאוד ספציפי מAβ מטרה מינים ולזיהוי שלטים Aβ, אבל אלה הם הרבה יותר יקר והשימוש שלהם הוא זמן רב יותר מאשר באמצעות Cur. לדוגמה, השוונו את הפלאק Aβ הכריכה על ידי Cur, עם צבעים אחרים של איגוד עמילואיד, כגון Thio-S, CR, ו-FJC, כאשר Aβ-נוגדן ספציפי (6E10) שימש כבקרת התייחסות. תוצאות אלה מציעות כי תוויות Cur Aβ פלאק חזק יותר מאשר fluorophores אחרים. החשוב ביותר, יחסית לנוכחי, כמה fluorophores נפוץ יותר יש חסרונות ברורים במונחים של תיוג והדמיה Aβ. לדוגמה, Thio-S יכול לייצר מסיח, רקע גבוה כי הוא נקשר עם קרומים שומנים בדם או תרכובות השומנים בתא21. באופן דומה, CR, אשר משמש בדרך כלל לתווית Aβ, מייצרת שבירה ירוקה תפוח (איור 4) תחת מיקרוסקופ מקוטב. CR אינו מתייג Aβ-לוחיות בקלות כמו לעשות Cur או thio-S, תיוג משמעותית פחות Aβ פלאק מאשר אלה שזוהו על ידי הנוכחי7,22,23. Gutierrez ואח ' דיווחו כי FJC, אשר יכול לאגד עם Aβ ועם נוירונים מנוונת, תוויות בתדר נמוך יותר מאשר השני או Thio-S24. תוצאות אלה מצביעים על כך הסמנים הקלאסיים המשמשים בדרך כלל יש פחות אהדה עבור איגוד לפלאק Aβ יותר מאשר Cur.
בנוסף, התיוג של סוגים שונים Aβ פלאק (ליבה, neuritic, לפזר, נשרף-out) עשוי להיות ממוטב עם Cur, במקום אחרים fluorophores מחייב עמילואיד, כי Cur יכול לעזור להמחיש ולהבחין שונים מורפולוגית הפלאק Aβ, בעוד טכניקות אחרות להיכשל להבחין אלה תת מורפולוגיות7. באופן דומה, השימוש בנוגדנים ספציפיים Aβ, אשר ספציפיים מאוד מינים שונים של Aβ הוא יקר מאוד זמן רב, לוקח לפחות 24-48h באמצעות אימונוהיסטוכימיה. יתר על כן, זיהוי מינים שונים של Aβ דורשים נוגדנים שונים, כמו גם כימיקלים אביזר מספר, אשר מוסיף באופן משמעותי את העלות הכוללת. ברור, נוכחי הוא פחות יקר, זמין יותר, ומייצרת עוצמת קרינה גבוהה יותר כאשר הוא נקשר לפלאק Aβ. למרות CR היא גם טכניקה חסכונית יחסית עבור תיוג והדמיה של שלטים Aβ, Cur יכול לאגד ולתייג יותר מינים Aβ, כגון oligomers25 (איור 3 ואיור 4), ואילו cr רק נקשר ל פרוטופיברילס ו . שלום, מדבר23 לכן, תיוג Aβ עם Cur יכול להיות מושגת ביעילות רבה יותר ביעילות מאשר על ידי Thio-S, CR, או FJC (שולחן 1).
לסיכום, נוכחי יכול לזהות שלטים Aβ ו oligomers מרקמת המוח לספירה ביעילות, במהירות, ובזול. בנוסף, איגוד נוכחי לAβ הוא מאוד ספציפי ופעילות הפלורסנט שלו יציבה מאוד. זה דורש כמויות מינימליות (1-10 nM) כדי לתייג Aβ. יתר על כן, נוכחי הוא גם מאוד ספציפי מינים Aβ שונים, כגון סיבים או לוחיות, כמו גם oligomers7. באופן דומה, הנגזרים הללו מתאוקסיקוכוכמין ובידמתיונין גם הנמל מאפיינים כריכת עמילואיד ו-c תווית Aβ באופן דומה Cur10 (איור 5א). לכן, Cur הוא fluorophore אידיאלי עבור תיוג והדמיה של שלטים Aβ ברקמת המוח לאחר המוות. זה יכול לשמש חלופה מהירה וקלה כדי לזהות פלאק Aβ עומס לאחר טיפול נגד עמילואיד במודלים בעלי חיים ניסיוני של AD. הממצאים שלנו לאשר את הדיווחים של הזיקה הגבוהה של Cur כדי Aβ, חיזוק השימוש הפוטנציאלי שלה לניטור Aβ-שלטים במוח לאחר המוות וברקמות החיים.
לתיוג האופטימלי מומלץ לא לתייג את Aβ עם נוכחי ברקמה בלתי מעשית, ולהימנע מאחסון רקמות לטווח ארוך, מכיוון שהוא יכול להפיק כמות גדולה יותר של רקע, גם כאשר הוא מוכן. עבור colabeling, מומלץ להשלים את הטיפול האימונוהיסטוכימיה הראשון עם הנוגדן הספציפי המשמש לפני הצביעת עם Cur ולאחר מכן בצע את זה עם כתמים נגד באמצעות DAPI או Hoechst.
שינויים אפשריים בשיטה זו כוללים הגדלת זמן הדגירה של Cur עם הרקמה עד 30 דקות, אשר לא יפריעו לעוצמת האות, למרות שהוא עשוי להגביר את הרקע בזמן הדמיה. הפחתת ריכוז נוכחי לפחות מ-10 μM אינה מפריעה לתיוג Aβ ברמה משמעותית. כדי להקטין את הרקע לרקמת מוח אנושית, ניתן להחיל שיטת הכנה חלופית. לדוגמה, מקטעי המוח יכול להיות מטופלים בתחילה עם 0.3% (w/v) סודן שחור B ב 70% אתנול (v/v) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסעיף יכול להיות מוכתם עם Cur עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, ונשטף עם PBS 3x עבור 15 דקות, מוכתם נגד, רכוב עם מדיה אנטי נמוגה13. בנוסף, ניתן להפחית את עוביים המקטעים של קריוסטט ל-20 עד 25 μm.
האזהרות הפוטנציאליות לשיטה זו כוללות איגוד נוכחי עם Aβ הנמצאים בכלי הדם, אשר שונה מפלאק Aβ החילוץ. לפיכך, על החוקר להיות מודע למבנה הAβ של הפלאק והאויגמרים מAβ בכלי הדם. החוקר צריך להיות מודע לאותות פלורסנט אוטומטית. רקע ירוק עודף ניתן לראות מדי פעם לאחר כתמים נוכחי, אבל זה יכול להיות מופחת על ידי הפחתת זמן הצביעת או על ידי הפחתת הריכוז של הנוכחי. לבסוף, האות של colabeling עם סמנים אחרים עשוי להיות מופחת עקב טיפולים חוזרים עם החומר ניקוי (למשל, קסילן).
מגבלות חשובות כוללות את חוסר היכולת colabel עם חלבון סמן כל באמצעות נוגדן משני מתויג עם צבע פלורסנט ירוק, כמו פלורסנט isothiocyanate (FITC). אין אפשרות להשתמש באלה בשל העירור/הפליטה הדומים של הנוכחי. כמו כן, בשלבים המוקדמים של AD, רק כמויות מוגבלות של Aβ ניתן לתייג על ידי Cur. לבסוף, יש צורך לעשות עבודה בסביבה כהים כמו כל צבע פלורסנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
התמיכה עבור מחקר זה הגיע מן המכון למדעי השדה בהתעלות של מריה הקדושה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
