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Neuroscience

मस्तिष्क ऊतक में एमिलॉयड प्लेक की लेबलिंग और इमेजिंग प्राकृतिक पॉलीफेनोल करक्यूमिन का उपयोग करते हुए

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60377
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1, 2,3, 5, 1,2,3,4
1Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, 2Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, 3Program in Neuroscience, Central Michigan University, 4Department of Psychology, Central Michigan University, 5Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

Summary

Curcumin लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में एमिलॉयड बीटा प्रोटीन प्लेक के इमेजिंग के लिए एक आदर्श fluorophore है क्योंकि एमिलॉयड बीटा प्रोटीन के लिए अपनी अधिमानी बाध्यकारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य पारंपरिक एमिलॉयड बाध्यकारी रंगों के साथ अपनी संरचनात्मक समानताएं. यह लेबल और छवि amyloid बीटा प्रोटीन प्लेक और अधिक कुशलता से और सस्ते में पारंपरिक तरीकों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

एमिलॉयड बीटा प्रोटीन (एजेड) का अतिरिक्त और इंट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान में जमाव अल्जाइमर रोग (एडी) की पहचान रोगों में से एक है। इसलिए, ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए नए उपचार के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ई. की प्रगति को रोकने के लिए. कई शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंजक, फ्लोरोक्रोम, इमेजिंग जांच, और एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड हिस्टोकेमिकलली का पता लगाने के लिए किया गया है। एजेड का पता लगाने के लिए इन यौगिकों का उपयोग महंगा है और समय लगता है. हालांकि, इसकी तीव्र फ्लोरोसेंट गतिविधि, उच्च-एफ़िनिटी, और एजेड के लिए विशिष्टता के कारण, साथ ही पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों के साथ संरचनात्मक समानताएं, करक्यूमिन (क्यूर) पोस्टमार्टम में लेबलिंग और इमेजिंग के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार है मस्तिष्क ऊतक. यह जड़ी बूटी करक्यूमा लांगासे एक प्राकृतिक पॉलीफेनॉल है . वर्तमान अध्ययन में, क्यूर का उपयोग 5x पारिवारिक अल्जाइमर रोग (5xFAD) के आनुवंशिक माउस मॉडल (5xFAD) और एक मिनट के भीतर मानव विज्ञापन ऊतक से दोनों से हिस्टोकेमिकल लेबल एजेड प्लेक के लिए किया गया था। करर की लेबलिंग क्षमता पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की तुलना में की गई थी, जैसे कि थिओफ्लेविन-एस (थियो-एस), कांगो लाल (सीआर), और फ्लोरो-जेड सी (एफजेसी), साथ ही एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10 और A11)। हमने देखा कि इन पारंपरिक रंगों की तुलना में जब क्यूर लेबल और छवि एजेड प्लेक का सबसे सस्ता और तेज तरीका है और एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी के बराबर है। इसके अलावा, क्यूर सबसे एजेड प्रजातियों के साथ बांधता है, जैसे कि ओलिगोमर और फाइब्रिल्स। इसलिए, क्यूर का उपयोग एजेड प्लेक के लिए सबसे अधिक लागत प्रभावी, सरल, और त्वरित फ्लोरोक्रोम डिटेक्शन एजेंट के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

अल्जाइमर रोग (एडी) सबसे आम, उम्र से संबंधित, प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है और दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक1,2. सीखना, स्मृति, और अनुभूति हानि, neuropsychiatric विकारों के साथ, आम लक्षण ई3में प्रकट कर रहे हैं. यद्यपि ई. के ईटियोलॉजी को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, उपलब्ध आनुवंशिक, जैव रासायनिक, और प्रयोगात्मक साक्ष्य इंगित करता है कि एजेड का क्रमिक जमाव ई.4के लिए एक निश्चित बायोमार्कर है। यह गलत गुना प्रोटीन इंट्रासेल्यूलर और एक्स्ट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान में जमा होता है और माना जाता है कि यह synaptic हानि में शामिल किया गया है, तंत्रिका सूजन में वृद्धि हुई है, औरमस्तिष्कमें cortical और हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों में neurodegeneration ई 5 से प्रभावित . इसलिए, ई. ऊतक में एजेड का हिस्टोकेमिकल पता लगाना ई- प्रगति को रोकने के लिए गैर-विषाक्त, एंटी-अमाइलॉयड दवाओं के विकास में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है।

पिछले कुछ दशकों के दौरान, कई रंगों और एंटीबॉडी कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में छवि एजेड प्लेक, लेकिन इन तरीकों में से कुछ समय लगता है और रंगों या एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं महंगा है, कई गौण की आवश्यकता होती है रसायन. इसलिए, ई. मस्तिष्क में एजेड प्लेक का पता लगाने के एक सस्ती साधन का विकास एक स्वागत योग्य नया उपकरण होगा। कई प्रयोगशालाओं Cur, एक होनहार विरोधी amyloid प्राकृतिक polyphenol का उपयोग शुरू कर दिया, लेबलिंग और इमेजिंग एजेड के लिए, साथ ही साथ ई.केलिए एक चिकित्सीय एजेंट 6,7,8,9. इसकी हाइड्रोफोबिकता और लिपोफिलिक प्रकृति, शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों के साथ संरचनात्मक समानताएं, मजबूत फ्लोरोसेंट गतिविधि, साथ ही एजेड के साथ बांधने के लिए मजबूत संबंध यह लेबल और ई. ऊतक में एजेड प्लेक की इमेजिंग के लिए एक आदर्श फ्लोरोफोर बनाता है10 . कुर एजेड-प्लाक और ओलिगोमर के साथ बांधता है और इसकी उपस्थिति इंट्राकोशिकीय रिक्त स्थान7,11,12,13में भी पाई जाती है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कम से कम मात्रा (1 "10 nM) Cur के 5x पारिवारिक अल्जाइमर रोग (5xFAD) मस्तिष्क ऊतक7में एजेड प्लेक लेबल कर सकते हैं. हालांकि 1 एन एम एकाग्रता एजेड प्लेक की गिनती के लिए इष्टतम फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रदान नहीं करता है, एक 10 एनएम या Cur की उच्च एकाग्रता करता है। Ran और उनके सहयोगियों14 ने बताया कि खुराक के रूप में कम के रूप में 0.2 nM difluoroboron-derivatized करी में पता लगा सकते हैं vivo एजेड जमा लगभग के रूप में अच्छी तरह से एक अवरक्त जांच के रूप में. क्या यह खुराक ऊतक में एजेड प्लेक को लेबल करने के लिए पर्याप्त है, अभी भी स्पष्ट नहीं है। सबसे पिछले अध्ययनों में 20 -30 मिनट का उपयोग कर के लिए एजेड प्लेक धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन इष्टतम धुंधला बहुत कम समय की आवश्यकता हो सकती है.

वर्तमान अध्ययन के लिए कम से कम समय के लिए क्यूर द्वारा आवश्यक का परीक्षण करने के लिए ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड प्लेक लेबल और लेबल और मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड प्लेक के इमेजिंग के लिए संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था 5xFAD चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में अन्य पारंपरिक के साथ धुंधला के बाद एजेड-बाइंडिंग रंग, जैसे थिओफ्लेविन-एस (थियो-एस), कांगो लाल (सीआर), और फ्लोरो-जेड सी (एफजेसी)। इन शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की एजेड लेबलिंग क्षमता की तुलना पैराफिन-एम्बेडेड और क्रायोस्टैट कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में 5xFAD चूहों से और वृद्ध-मिलान मानव विज्ञापन और मस्तिष्क के ऊतकों को नियंत्रित करने से की गई थी। निष्कर्षों से पता चलता है कि क्यूर एजेड प्लेक को एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10) के समान तरीके से लेबल करता है और थियो-एस, सीआर, या एफजेसी की तुलना में मामूली रूप से बेहतर है। इसके अलावा, जब 5xFAD चूहों के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन 2 डिग्री 5 दिनों के लिए प्रशासित किए गए थे, तो यह रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार कर गया और एजेड प्लेक7के साथ बाध्य हुआ। दिलचस्प बात यह है कि क्यूर के नैनोमोलर सांद्रता का उपयोग 5xFAD मस्तिष्क ऊतक7,14में एजेड प्लेक को लेबल करने और छवि बनाने के लिए किया गया है। इसके अलावा, आकृतिकी रूप से अलग एजेड प्लेक, जैसे कोर, न्यूरिटिक, विसरा, और जले हुए प्लेक को अन्य पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंगरंगोंमें से किसी की तुलना में अधिक कुशलता से करके लेबल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, क्यूर को एक आसान और सस्ती तरीके से पशु मॉडल और/या मानव ई. ऊतक से पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों में लेबल और छवि एजेड प्लेक के लिए लागू किया जा सकता है, एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए एक विश्वसनीय विकल्प के रूप में।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों Saginaw घाटी राज्य विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है. मानव ऊतक एरिजोना15,16में बैनर सूर्य स्वास्थ्य संस्थान में एक स्थापित मस्तिष्क बैंक से प्राप्त किया गया था .

1. पशुओं का भ्रम

  1. स्थिर और भ्रम बफ़र्स तैयार करें।
    1. 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर को 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड (नाक्कल), 2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 21.7 ग्राम डाइसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट (ना2एचपीओ4$7एच2ओ), 2.59 ग्राम पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2PO 4) को जोड़कर तैयार करें। ), और डबल आसुत पानी 1 एल की कुल बनाने के लिए।
    2. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) तैयार करें।
      1. पीबीएस (0ण्1 म, पीएच 7.4) के 1 ल् में 40 ग्राम पैराफार्मेल्डिहाइड जोड़ें।
      2. पीएफए समाधान को 60 डिग्री 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करके मिश्रण करें।
        नोट: तापमान 65 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए।
      3. पीएफए को पूरी तरह से भंग करने के लिए एक ड्रॉपर के साथ NaOH (1 N) की कुछ बूँदें जोड़ें।
      4. ठीक फिल्टर कागज के लिए मध्यम के साथ पीएफए समाधान फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
        नोट: समाधान एक महीने के लिए अच्छा है.
  2. पशु संज्ञाहरण और भ्रम प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: बारह महीने पुराने B6SJL-Tg एपीपी SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 ]FAD) आयु मिलान नियंत्रण चूहों (एन $ 6 प्रति समूह) विक्रेताओं से खरीदा गया था और Saginaw घाटी राज्य विश्वविद्यालय के पशु घर में नस्ल. जेनोटाइपिंग की पुष्टि बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा की गई थी जैसा कि पहले7में वर्णित किया गया था। मानव ई. मस्तिष्क ऊतक पोस्टमार्टम ई. मस्तिष्क ऊतक और उम्र मिलान नियंत्रण ऊतक भी शामिल है.
    1. एक उपयुक्त संवेदनाहारी एजेंट के साथ जानवर एनेस्थेटाइज करें, जैसे सोडियम पेंटोबार्बिटल (390 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन), या एक केटामाइन/xylazine मिश्रण (अप करने के लिए 80 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर वजन ketamine और 10 मिलीग्राम / किलो शरीर वजन xylazine) द्वारा इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन (27 जी सुई और 1 एमएल सिरिंज).। एक अंगुली pinching द्वारा संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करें. यदि जानवर अप्रतिसादी है, तो यह भ्रम सर्जरी के लिए तैयार है।
    2. भ्रम सर्जरी ट्रे पर सुपाच्य स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड जानवर रखें और छोटे आईरिस कैंची का उपयोग कर बाएं वेंट्रिकल के पीछे के अंत में एक चीरा बनाते हैं।
    3. बाएं वेंट्रिकल में 22 जी पर्फ्यूजन सुई डालें और शरीर से भ्रम तरल पदार्थ को हटाने के लिए दाएं auricle पर एक छोटा सा चीरा बनाएं। बर्फ-ठंडा परफ्यूजन तरल पदार्थ (0.1 एम पीबीएस, पीएच 7.4) 5 डिग्री 6 मिनट (प्रवाह दर 20 डिग्री 25 मिलीलीटर/मिनट) के लिए प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए एक गुरुत्वाकर्षण-पोषित परफ्यूजन प्रणाली का उपयोग करें।
      नोट: एक स्पष्ट जिगर इष्टतम भ्रम का सूचक है.
    4. फिक्सिंग के लिए एक बर्फ ठंडा 4% paraformaldehyde समाधान करने के लिए बफर वाल्व स्विच और यह 8 के लिए प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं 10 मिनट.
      नोट: कठोर या कठोर अंगों के बाद कंपन अच्छा निर्धारण के संकेतक हैं।
    5. कैंची का उपयोग कर खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें. एक spatula का उपयोग करना, मस्तिष्क इकट्ठा करने और 4% पीएफए की एक शीशी में जगह (कम से कम 10x मस्तिष्क की मात्रा की मात्रा) और आगे का उपयोग जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

2. ऊतक प्रसंस्करण

  1. क्रायोस्टैट सेक्शन कट करें।
    1. मस्तिष्क को वर्गीकृत सुक्रोज समाधानों में स्थानांतरित करें (10%, 20%, और 30%) और उपयोग करने तक, 24 एच प्रत्येक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. -22 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टैट का उपयोग करके 40 डिग्री मीटर-थिक खंडों को काट दें। पीबीएस और सोडियम अज़ीदे (0.02%) से भरी 6 अच्छी प्लेट में 10 डिग्री 20 वर्गों को अच्छी तरह से लीजिए।
  2. पैराफिन माउस और मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए वर्गों एम्बेड.
    1. पैराफिन वर्गों के लिए, perfused और 24 एच के बाद वर्गीकृत alcohols के साथ तय मस्तिष्क ऊतक निर्जलित (50%, 70%, 90%) 2 एच प्रत्येक के लिए, 1 एच प्रत्येक के लिए 100% शराब 2x द्वारा पीछा किया, और फिर कमरे के तापमान पर 1 एच प्रत्येक के लिए xylene 2x के साथ.
    2. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक गिलास शंकु फ्लास्क में 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए xylene-पैराफिन (1:1) 2x के साथ ऊतक में प्रवेश।
    3. 4 डिग्री 6 ज के लिए पिघल पैराफिन (56 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक विसर्जित कर दिया।
    4. कमरे के तापमान पर एक रोटरी microtome का उपयोग कर 5 मीटर मोटी वर्गों में कटौती और उन्हें 45 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक पानी स्नान में जगह है।
  3. हिस्टोकेमिकल रूप से क्रायोस्टैट खंडों में एजेड प्लेक को क्यूर के साथ लेबल करता है।
    1. चरण 2.1.2 से वर्गों कुल्ला पीबीएस के साथ (पीएच 7.4) 3x 5 मिनट प्रत्येक के लिए.
    2. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में वर्गों विसर्जित कर दिया।
    3. मेथनॉल में स्टॉक क्यूर (1 एमएम) को भंग करें और 70% एथेनॉल के साथ पतला करें ताकि अंतिम कार्य सांद्रता 10 डिग्री सेल्सियस प्राप्त की जा सके।
    4. 150 आरपीएम पर एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 "5 मिनट के लिए काम कर Cur समाधान के साथ वर्गों विसर्जित कर दिया।
    5. कर समाधान छोड़ें और 2 मिनट प्रत्येक के लिए 70% इथेनॉल 3x के साथ धो लें।
    6. पाली-एल-lysine लेपित ग्लास स्लाइड पर वर्गों रखो और इस तरह के distyrene plasticizer xylene (DPX) के रूप में कार्बनिक बढ़ते मीडिया का उपयोग कर एक coverslip के साथ माउंट।
    7. 480/550 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देखें।
  4. हिस्टोकेमिकल रूप से पैराफिन-एम्बेडेड माउस और मानव मस्तिष्क वर्गों में एजेड प्लेक को कुर के साथ लेबल करें।
    1. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए xylene 2x के साथ कदम 2.2.4 से ऊतक वर्गों Deparaffinize.
    2. वर्गीकृत शराब समाधान के साथ Rehydrate (100%, 80%, 70%, 50% 1 मिनट प्रत्येक के लिए) और आसुत पानी के साथ 2x के लिए 5 मिनट प्रत्येक कमरे के तापमान पर.
    3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए Cur (10 डिग्री सेल्सियस) के साथ दाग वर्गों, 150 आरपीएम पर मिलाते हुए। 70%, 90%, और 2 मिनट प्रत्येक के लिए 100% शराब के साथ धो लें.
    4. 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene 2x के साथ स्पष्ट है और DPX के साथ कवर पर्ची.
    5. चरण 2.3.7 में उल्लिखित एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के अंतर्गत विरूपित की जा सकता है।
  5. एजेड प्लेक और ओलिगोमर में एजेड एंटीबॉडी के साथ सहस्थानी क्यूर।
    1. एक 12 अच्छी तरह से थाली में पीबीएस 3x के साथ चरण 2.1.2 से cryostat वर्गों धो लो.
    2. 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) के साथ वर्गों ब्लॉक 0.5% Triton-X-100 के साथ पीबीएस में भंग 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर.
    3. ब्लॉकिंग समाधान छोड़ें। एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10 या A11, पतला 1:200) के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें जिसमें 10% एनजीएस और 0.5% ट्राइटन-X100 रात भर 150 आरपीएम पर एक शेकर में 4 डिग्री सेल्सियस युक्त ताजा अवरुद्ध समाधान में भंग हो गया।
    4. एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस 3x के साथ वर्गों धो लें।
    5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए लाल फ्लोरोफोर (उदाहरण के लिए, एलेक्सा 594) के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी टैग के साथ इनक्यूबेट।
    6. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस 3x के साथ धो लें.
    7. 70% शराब 1x के साथ धो लें.
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कुर (10 डिग्री सेल्सियस) के साथ वर्गों इनक्यूबेट करें।
    9. 1 मिनट प्रत्येक के लिए 70% शराब 3x के साथ धो लें.
    10. 90% और 100% शराब के साथ 1 मिनट प्रत्येक के लिए निर्जलीकरण, 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene 2x के साथ स्पष्ट है, और DPX का उपयोग कर स्लाइड पर माउंट.
    11. लाल और हरे संकेतों के लिए उचित उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करकल्पना करें।
    12. इंट्रासेल्यूलर एजेड कोस्थानीयन के लिए, एजेड-एंटीबॉडी (6E10) का उपयोग करके वर्गों को दाग, 150 आरपीएम पर मिलाते हुए अंधेरे में कमरे के तापमान पर कुर के साथ आराम, और या तो Hoechst-33342 (1 मिलीग्राम/एमएल) और / 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ अंधेरे. पीबीएस 3x के साथ धो लें।
    13. 100x उद्देश्य (कुल आवर्धन 1,000x) के साथ लाल, हरे और नीले फ़िल्टर के साथ चित्र लें.
  6. थियो-एस, सीआर, और एफजेसी के साथ लेबल एजेड प्लेक।
    नोट: Thio-S और CR लेबलिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले7रिपोर्ट किए गए थे.
    1. FJC धुंधला के लिए, मुक्त चल वर्गों कदम से प्राप्त धोने 2.1.2 PBS के साथ 3x के लिए 5 मिनट प्रत्येक.
    2. एक में वर्गों प्लेस 12 अच्छी तरह से थाली और FJC के साथ दाग (0.001%) कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए.
    3. FJC समाधान छोड़ें और PBS 3x के साथ धोने के लिए 5 मिनट प्रत्येक.
    4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अमोनियम क्लोराइड (एनएच4सीएल, 50 एमएम पीबीएस में भंग) के साथ इनक्यूबेट।
    5. एनएच4सीएल समाधान छोड़ ें और पीबीएस 3x के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए धो लें।
    6. अनुभाग 2.4 में चरणों का पालन, वर्गीकृत शराब समाधान के साथ निर्जलित, स्पष्ट, माउंट, और 450/520 एनएम उत्तेजना का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देखें /

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Representative Results

करक्यूमिन एक मिनट के भीतर एजेड प्लेक को लेबल करता है। जब हम Cur के साथ 5xFAD ऊतक दाग, हमने पाया कि Cur लेबल एजेड प्लेक 1 मिनट के भीतर. यद्यपि क्यूर के साथ ऊष्मायन समय में एजेड प्लेक की फ्लोरोसेंट तीव्रता में थोड़ा वृद्धि हुई है, फिर भी 1 मिनट और 5 मिनट धुंधला समय के बीच पाए गए एजेड प्लेक की संख्या काफी भिन्न नहीं थी (चित्र 1)।

क्यूर क्रायओस्टैट-तैयार, पैराफिन-एम्बेडेड माउस और मानव ई. ऊतक में एजेड प्लेक को लेबल कर सकता है जो माउस ई. मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ colocalizes। जब हम क्रायोसेक्शन को दागते हैं, तो पैराफिन-एम्बेडेड खंड (चित्र 2ए) और मानव ई. ऊतक (चित्र 2ठ) हमने सभी प्रकार के ऊतक खंडों में कुर-लेबल एजेड प्लेक देखे। इसके अतिरिक्त, यह पुष्टि करने के लिए कि Cur एजेड प्लेक के लिए बाध्यकारी है, हमने पहले 6E10 के साथ प्लेक को लेबल किया था, जिसके बाद करी धुंधला हो गया था। हमने देखा कि क्यूर को उसी प्लेक में एजेड के साथ पूरी तरह से स्थानीयकृत किया गया था जो 6E10 को बाध्य करता है(चित्र 2C)।

कुर लेबल एजेड ओलिगोमर्स और इंट्रासेल्यूलर एजेड समुच्चय। यह जांचने के लिए कि क्या कर एजेड ओलिगोमर को लेबल कर सकता है, 5xFAD माउस अनुभागों को एजेड ओलिगोमर-विशिष्ट एंटीबॉडी (A11) के साथ दागदिया गया था, जिसके बाद करी धुंधला हो गया था। हमने देखा कि एजेड प्लेक में ए 11 के साथ करा का स्थानलियां (चित्र 3क) । इसी प्रकार, क्यूर भी इंट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान में 6E10 एंटीबॉडी के साथ colocalized (चित्र 3ठ),यह इंगित करता है कि यह intracellular एजेड लेबल कर सकते हैं.

शास्त्रीय एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की तुलना में कुर लेबल एजेड अधिक प्रमुखता से। करर द्वारा एजेड लेबलिंग की तुलना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमिलॉयड बाइंडिंग रंजक ों थियो-एस, सीआर, एफजेसी से की गई थी। एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी 6E10 मानक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हमने देखा कि वक्रका् त ए ए पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंजों की तुलना में अधिक प्रमुखता से(चित्र 4) है।

Cur डेरिवेटिव बिस-demethoxycurcumin (बीडीएमसी) और demethoxycurcumin (डीएमसी), हल्दी निकालने में भी मौजूद है, लेबल एजेड प्लेक तुलनात्मक रूप से 5xFAD मस्तिष्क के ऊतकों में करी करने के लिए। दो अन्य प्रमुख घटक, जैसे बीडीएमसी और डीएमसी, हल्दी निकालने में मौजूद हैं। हमने परीक्षण किया कि क्या ये दो यौगिक भी कर के समान एजेड प्लेक को लेबल करते हैं। जब 5xFAD माउस मस्तिष्क वर्गों इन डेरिवेटिव के साथ दाग थे, दोनों BDMC और डीएमसी भी एजेड प्लेक लेबल, समानांतर कर (चित्र 5एक). विभिन्न बढ़ते मीडिया Cur के साथ धुंधला करने के बाद एजेड-इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप के लिए जाँच करने के लिए जांच की गई. फ्लोरोसेंट संकेत दोनों जलीय और कार्बनिक बढ़ते मीडिया में बरकरार था, जैसे DPX (चित्र 5बी) के रूप में. क्यूर के साथ एजेड प्लेक का दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंट लेबलिंग के बाद उपयुक्त था और इसके बाद होचस्ट 33342 समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) या 4",6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई, 1 डिग्री जी/ कुरकुरे के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंट सिग्नलऔर प्रतिस्थान तीव्रता बनाए रखी गई थी (चित्र 5ग)

Figure 1
चित्र 1: करक्यूमिन एक मिनट के भीतर एजेड प्लेक को लेबल करता है। (ए) 5xFAD चूहों या मानव नियंत्रण और विज्ञापन cortical ऊतक से मस्तिष्क वर्गों 1 $5 मिनट के लिए कर (10 डिग्री सेल्सियस) के साथ दाग रहे थे और दृश्य प्लेक की संख्या गिना गया. (ख) 1 मिनट और 5 मिनट धुंधला समय के बीच एजेड-प्लाक गिनती की संख्या में कोई अंतर नहीं देखा गया। डेटा मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं - मतलब (SEM) के मानक त्रुटि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एजेड प्लेक में एजेड एंटीबॉडी के साथ क्यूर का सहस्थानीकरण। क्यूर क्रायओस्टैट-तैयार, पैराफिन-एम्बेडेड सेक्शन (ए) और मानव ई. ऊतक (बी) में एजेड प्लेक को लेबल कर सकता है। एजेड लेबलिंग ने एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10, DAB धुंधला) के साथ लेबलिंग को समानांतर किया। (सी) 5xFAD वर्गों पहले एजेड एंटीबॉडी (6E10) के साथ लेबल किया गया था, Cur के साथ धुंधला द्वारा पीछा किया. लाल ] 6E10 एक माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोरोफोर 594 के साथ टैग द्वारा बाध्य. ग्रीन जेड कर्यू. Cur पूरी तरह से एक ही प्लेक है कि 6E10 के लिए बाध्य पर एजेड के साथ colocalized. तीर एजेड प्लेक को इंगित करते हैं। स्केल बार बाईं ओर की सभी तीन छवियों में 50 डिग्री (कुल आवर्धन $ 400x) और 10 डिग्री उउ (कुल आवर्धन 400x) को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: करक्यूमिन लेबल एजेड ओलिगोमर्स और इंट्रासेल्यूलर एजेड। (ए) एजेड-ओलिगोमर को एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (ए11) का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से पाया गया था, जिसके बाद कुर के साथ दाग लगाया गया था। Cur पूरी तरह से एजेड के साथ colocalized, एक ही oligomer पर जहां A11 बांधता है. स्केल बार - 250 डिग्री उ और कुल आवर्धन - 100x. (बी) इसी प्रकार, इंट्रासेल्यूलर एजेड को एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10) का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से पाया गया, जिसके बाद कुर े के साथ दाग लगाया गया। ध्यान दें कि Cur पूरी तरह से 6E10 करने के लिए बाध्य एक ही क्षेत्रों में एजेड के साथ colocalized. स्केल बार - 50 डिग्री उ और कुल आवर्धन $ 1,000x। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एजेड प्लेक लेबल करने के लिए कुर के साथ विभिन्न एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की तुलना। Cryostat वर्गों (40 डिग्री मीटर) 12 महीने पुराने 5xFAD चूहों के प्रांतस्था से करी, Thioflavin-एस, कांगो लाल, Fluoro-जेड सी के साथ दाग रहे थे, और 6E10 एंटीबॉडी के साथ. Cur लेबल एजेड प्लेक से अधिक प्रमुखता से Thio-एस, सीआर, और FJC. तीर एजेड प्लेक को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: क्यूर-व्युत्पन्न बिस-डेमेथॉक्सी करक्यूमिन और डेमेथॉक्सी करक्यूमिन भी इसी तरह करूर के लिए एजेड लेबल करते हैं। (ए) क्रायोस्टैट और पैराफिन-एम्बेडेड 5xFAD वर्गों को क्यू-डेवेटिव्स बिस्-डेमेथॉक्सी करक्यूमिन और डेमेथॉक्सी करक्यूमिन के साथ दागा गया था। ये दोनों डेरिवेटिव एजेड प्लेक को कुर के समान तरीके से लेबल करते हैं। (बी) जलीय और जैविक बढ़ते मीडिया (DPX) दोनों का उपयोग करके एजेड प्लेक को कुर के साथ लेबल करने के बाद ऊतक खंडों को माउंट करने के लिए किया गया था। (ग) इम्यूनोलेबल सेक्शन का उपयोग कर्यूरा के साथ एजेड लेबलिंग के लिए किया गया था। सफेद तीर एजेड प्लेक को इंगित करते हैं, हरे तीर सक्रिय एस्ट्रोसाइट (जीएफएपी) को इंगित करते हैं, और पीला तीर परमाणु दाग (डीएपीआई) को इंगित करता है। स्केल बार्स ] 100 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सुविधाऐं एजेड-एंटीबॉडी Curcumin थायो-एस कांगो लाल फ्लोरो-जेड सी
दाग की अवधि $24-48 ज $1-5 मिनट $ 10 मिनट $ 60 मिनट $ 30 मिनट
सहायक रसायन माध्यमिक एंटीबॉडी, कई रसायनों बफर बनाने के लिए, सामान्य बकरी सीरम मेथनॉल इथेनॉल NaOH और इथेनॉल NaOH और इथेनॉल, पोटेशियम परमैंगनेट
लागत महंगा: एक एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी शीशी की आवश्यकता है $200-300 लागत प्रभावी: $ 5-10/1 ग्राम कर्यू और कई ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है लागत प्रभावी: $ 5/1 ग्राम, कुछ ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है लागत प्रभावी: gt; $ 5/1 ग्राम कांगो लाल, और कई ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता महंगा: $ 15.500/1 ग्राम FJC पाउडर
विशिष्टता विभिन्न एंटीबॉडी एजेड ओलिगोमर और फाइब्रिल के लिए आवश्यक हैं Curcumin एजेड ओलिगोमर्स और फाइब्रिल्स के साथ बांधता है केवल फाइब्रिल्स बाँध कर सकते हैं, नहीं monomers, या oligomers केवल एजेड-प्रोटोब्रिल्स और फाइब्रिल्स16,17 के साथ बाँध कर सकते हैं केवल एजेड-फाइब्रिल्स और अपभ्रष्ट न्यूरॉन्स के साथ बाँध कर सकते हैं
स्थिरता माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़ी डाई पर निर्भर करता है बहुत स्थिर, यहां तक कि कमरे के तापमान पर जब एजेड के साथ बाध्य मेथनॉल में स्थिर इथेनॉल में स्थिर स्थिर नहीं
धुंधला करने के बाद देखभाल धुंधला करने के बाद अतिरिक्त देखभाल की जरूरत है, जैसे अंधेरे में रखा जा रहा है और हर समय जमे हुए नहीं प्रकाश संवेदनशील और कमरे के तापमान पर अधिक स्थिर के रूप में प्रकाश संवेदनशील प्रकाश संवेदनशील नहीं प्रकाश संवेदनशील
माइक्रोस्कोप की आवश्यकता यौगिक प्रकाश या फ्लोरोसेंट (माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है) फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोप या ध्रुवित सूक्ष्मदर्शी या ध्रुवित फिल्टर फ्लोरोसेंट
पृष्ठभूमि धुंधला आम तौर पर, कोई पृष्ठभूमि बहुत कम पृष्ठभूमि कोशिका में लिपिड झिल्ली या लिपिड यौगिकों के साथ बंधन के कारण उच्च पृष्ठभूमि कम पृष्ठभूमि उच्च पृष्ठभूमि
विवो एजेड-इमेजिंग में लागू नहीं हो सकता है अत्यधिक लागू लागू नहीं हो सकता है लागू नहीं हो सकता है लागू नहीं हो सकता है

तालिका 1: विभिन्न एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों और कुर7के साथ एजेड लेबलिंग कीतुलना।

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Discussion

हमारी परिकल्पना थी कि Cur तेज, आसान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और कम से कम महंगा तरीका लेबल और छवि एजेड प्लाक पोस्टमार्टम ई मस्तिष्क के ऊतकों में जब अन्य शास्त्रीय amyloid बाध्यकारी रंगों की तुलना में, साथ ही साथ एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी. इस अध्ययन का उद्देश्य पोस्टमार्टम ई. मस्तिष्क के ऊतकों में क्यूर द्वारा लेबल और छवि एजेड प्लेक के लिए आवश्यक न्यूनतम समय निर्धारित करना था और यह निर्धारित करना था कि क्या एजेड प्लेक को लेबल करने के लिए एजेड एंटीबॉडी के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है या नहीं। इस उद्देश्य के लिए, Cur की एजेड-लेबलिंग क्षमता अलग-अलग समय बिंदुओं पर देखी गई थी। Cur एक मिनट के भीतर एजेड लेबल करने में सक्षम था। इसके अतिरिक्त, क्यूर द्वारा एजेड की लेबलिंग अन्य पारंपरिक एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों की तुलना में अधिक थी, जैसे कि थियो-एस (0.1%), सीआर (1%), और एफजेसी (0.001%)।

Cur एजेड लेबलिंग के लिए एक अद्वितीय और आदर्श फ्लोरोफोर माना जाता है, क्योंकि यह सबसे विशेषताओं संरचनात्मक, भौतिक, रासायनिक, और जैविक गुणों सहित पारंपरिक एमिलॉयड बाध्यकारी रंगों के अधिकांश के पास है,10. इसके अलावा, सामर्थ्य के कारण, अधिकांश शोधकर्ताओं को इस प्राकृतिक polyphenol का उपयोग करने में रुचि रखते हैं. एजेड प्लेक और ओलिगोमर के लिए कुरेज़ की विशिष्टता को दिखाने के लिए, हमने 6E10 और A11 (एजेड-ओलिगोमर-विशिष्ट एंटीबॉडी) का उपयोग किया। कुर ने ऊतक में उपस्थित एजेड की सभी विभिन्न प्रजातियों के साथ लगभग पूर्ण सहस्थानीकरण दिखाया , जिससे पता चलता है कि क्यूरएजेड 7,17, 18,19,20के लिए अत्यधिक विशिष्ट है . इसके अतिरिक्त, वक्र लेबलए एजेड ओलिगोमर (चित्र 3ए) और इंट्रासेल्यूलर एजेड (चित्र 3ठ) और एजेड एंटीबॉडी (चित्र 2ठ) के साथ सहस्थानीकृत , यह सुझाव देता है कि करन न केवल लेबल कर सकता है बाह्य कोशिकीय एजेड प्लेक, लेकिन यह भी इंट्रासेल्यूलर रिक्त स्थान7में जमा एजेड।

पिछले कुछ दशकों के दौरान, कई फ्लोरोफोर और एंटीबॉडी को लेबल और इमेज एजेड प्लेक हिस्टोकेमिकल के लिए विकसित किया गया है। निस्संदेह, उनमें से अधिकांश एजेड प्रजातियों को लक्षित करने के लिए और एजेड प्लेक का पता लगाने के लिए बहुत विशिष्ट हैं, लेकिन ये बहुत अधिक महंगे हैं और उनके उपयोग से क्यूर का उपयोग करने से अधिक समय लगता है। उदाहरण के लिए, हमने अन्य एमिलॉयड बाइंडिंग रंगों, जैसे थियो-एस, सीआर, और एफजेसी के साथ, Cur द्वारा एजेड प्लेक बाइंडिंग की तुलना की, जहाँ एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी (6E10) का उपयोग संदर्भ नियंत्रण के रूप में किया गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि क्यूर लेबल एजेड प्लेक किसी भी अन्य फ्लोरोफोर की तुलना में अधिक दृढ़ता से होते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, Cur के सापेक्ष, अधिक सामान्यतः इस्तेमाल किया fluorores के कुछ लेबलिंग और इमेजिंग एजेड के मामले में अलग नुकसान है. उदाहरण के लिए, थियोयो-एस एक ध्यान भंग, उच्च पृष्ठभूमि का उत्पादन कर सकते हैं क्योंकि यह कोशिका21में लिपिड झिल्ली या लिपिड यौगिकों के साथ बांधता है। इसी प्रकार, सीआर, जिसका प्रयोग आमतौर पर एजेड को लेबल करने के लिए किया जाता है, एक ध्रुवित सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत सेब के हरे-भरे द्वि-प्रवर्तन (चित्र 4) का उत्पादन करता है। सीआर एजेड-प्लाकको को उतनी आसानी से लेबल नहीं करता जितना कि कर या थियो-एस, कुर7,22,23द्वारा पाए गए एजेड प्लेक की तुलना में काफी कम एजेड प्लेक की लेबलिंग करता है। Gutierrez एट अल. ने बताया कि FJC, जो एजेड के साथ और विकृत न्यूरॉन्स के साथ बाँध कर सकते हैं, या तो Cur या Thio-S24की तुलना में एक कम आवृत्ति पर लेबल . इन परिणामों का सुझाव है कि इन आमतौर पर इस्तेमाल किया शास्त्रीय मार्करों Cur से एजेड प्लेक के लिए बाध्यकारी के लिए कम संबंध है.

इसके अलावा, विभिन्न एजेड-प्लाक प्रकारों की लेबलिंग (कोर, न्यूरिटिक, विसरा, बर्न-आउट) को अन्य एमिलॉयड बाइंडिंग फ्लोरोफोर्स के बजाय कुर के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि कर्यू कल्पना करने और आकृतिकेरूप रूप में अलग-अलग एजेड प्लेक को अलग करने में मदद कर सकता है, जबकि अन्य तकनीकें इन रूपात्मकउपप्रकारों कोअलग करने में विफल हो जाती हैं 7 . इसी तरह, एजेड-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग, जो एजेड की विभिन्न प्रजातियों के लिए बहुत विशिष्ट हैं, बहुत महंगा है और समय लगता है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से कम से कम 24-48h ले रहा है। इसके अलावा, एजेड की विभिन्न प्रजातियों का पता लगाने के लिए विभिन्न एंटीबॉडी, साथ ही कई सहायक रसायनों की आवश्यकता होती है, जो कुल लागत में काफी वृद्धि करते हैं। जाहिर है, क्यूर कम महंगा है, और अधिक आसानी से उपलब्ध है, और उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता पैदा करता है जब यह एजेड प्लेक को बांधता है। यद्यपि सीआर एजेड प्लेक की लेबलिंग और इमेजिंग के लिए अपेक्षाकृत लागत प्रभावी तकनीक भी है, करी एजेड प्रजातियों के अधिक को बाँध और लेबल कर सकता है, जैसे कि ओलिगोमर्स25 (चित्र 3 और चित्र ााा 4),जबकि सीआर केवल प्रोटोफाइब्रिल्स को बांधता है और तंतु23| अतः, क्यूर के साथ एजेड लेबलिंग को थियो-एस, सीआर, या एफजेसी(तालिका 1)की तुलना में अधिक कुशलता से और लागत-प्रभावी रूप से प्राप्त किया जा सकता है।

संक्षेप में, Cur ई. मस्तिष्क के ऊतकों से प्रभावी ढंग से एजेड प्लेक और ओलिगोमर का पता लगा सकते हैं, तेजी से, और सस्ते में। इसके अतिरिक्त, एजेड के लिए क्यूर बाइंडिंग बहुत विशिष्ट है और इसकी फ्लोरोसेंट गतिविधि बहुत स्थिर है। एजेड को लेबल करने के लिए इसे न्यूनतम मात्रा (1-10 एनएम) की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, क्यूर विभिन्न एजेड प्रजातियों के लिए भी बहुत विशिष्ट है, जैसे फाइब्रिल या प्लेक, साथ ही ओलिगोमर्स7। इसी प्रकार, कर्वेटिव्स डेमेथॉक्सीकुरकुमिन और बिसेमेथॉक्सीक्यूरकुमिन भी एमिलॉयड बाइंडिंग गुण और सी लेबल एजेड को भी इसी प्रकारकर10 (चित्र 5ए) को आश्रय देते हैं। इसलिए, पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों में एजेड प्लेक की लेबलिंग और इमेजिंग के लिए क्यूरोफोर एक आदर्श फ्लोरोफोर है। यह ई. के प्रयोगात्मक पशु मॉडल में विरोधी amyloid चिकित्सा के बाद एजेड पट्टिका लोड का पता लगाने के लिए एक त्वरित और आसान विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे निष्कर्ष पोस्टमार्टम मस्तिष्क में और जीवित ऊतक में एजेड-प्लाक की निगरानी के लिए इसके संभावित उपयोग को मजबूत करते हुए, क्यूर के उच्च आत्मीयता की रिपोर्ट की पुष्टि करते हैं।

इष्टतम Cur लेबलिंग के लिए यह unperfused ऊतक में Cur के साथ एजेड लेबल नहीं करने के लिए और लंबी अवधि के ऊतक भंडारण से बचने के लिए सिफारिश की है, के रूप में यह पृष्ठभूमि की एक बड़ी राशि का उत्पादन कर सकते हैं, यहां तक कि जब perfused. colabeling के लिए, यह विशिष्ट एंटीबॉडी Cur के साथ धुंधला करने से पहले इस्तेमाल किया जा रहा है और फिर DAPI या Hoechst का उपयोग कर काउंटर दाग के साथ इस का पालन के साथ पहले इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को पूरा करने के लिए सिफारिश की है।

इस विधि में संभावित संशोधनों में 30 मिनट तक ऊतक के साथ Cur के ऊष्मायन समय को बढ़ाना शामिल है, जो सिग्नल तीव्रता के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा, हालांकि यह इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकता है। Cur की सांद्रता कम करने से कम 10 डिग्री सेल्सियस एक महत्वपूर्ण स्तर पर एजेड लेबलिंग में हस्तक्षेप नहीं करता है। मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, एक वैकल्पिक तैयारी विधि लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मस्तिष्क वर्गों शुरू में 0.3% के साथ इलाज किया जा सकता है (w/v) सूडान ब्लैक बी में 70% इथेनॉल (v/v) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए. फिर अनुभाग कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए Cur के साथ दाग जा सकता है, और 15 मिनट के लिए पीबीएस 3x के साथ धोया, counterstained, और antifading मीडिया13के साथ घुड़सवार . क्रायोस्टैट अनुभाग मोटाई को भी 20 डिग्री 25 डिग्री सेल्सियस तक कम किया जा सकता है।

इस विधि के संभावित चेतावनी में रक्त वाहिकाओं में मौजूद एजेड के साथ क्यूर बाइंडिंग शामिल है, जो एक्स्ट्राकोल्यूलर एजेड प्लेक से अलग है। इस प्रकार, अन्वेषक को रक्त वाहिकाओं में एजेड से एजेड प्लेक और ओलिगोमर की आकृति विज्ञान के बारे में पता होना चाहिए। अन्वेषक को ऑटो-फ्लोरोसेंट संकेतों के बारे में पता होना चाहिए। अतिरिक्त हरी पृष्ठभूमि कभी कभी Cur धुंधला के बाद देखा जा सकता है, लेकिन यह धुंधला समय को कम करने या Cur की एकाग्रता को कम करके कम किया जा सकता है. अंत में, अन्य मार्करों के साथ colabeling के लिए संकेत समाशोधन एजेंट (जैसे, xylene) के साथ दोहराया उपचार के कारण कम किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण सीमाओं में हरे फ्लोरोसेंट डाई के साथ टैग किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके किसी मार्कर प्रोटीन के साथ colabel करने में असमर्थता शामिल है, जैसे फ्लोरोसेंट आइसोथियोसाइनेट (FITC). इनका उपयोग कर के समान उत्तेजना/उत्सर्जन के कारण नहीं किया जा सकता है। साथ ही, ई. के प्रारंभिक चरणों में, केवल सीमित मात्रा में एजेड को करर द्वारा लेबल किया जा सकता है। अंत में, किसी भी फ्लोरोसेंट डाई की तरह अंधेरे वातावरण में काम करने की जरूरत है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए समर्थन सेंट मेरी के आरोहण में फील्ड न्यूरोसाइंसेज संस्थान से आया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol VWR,Radnor, PA
Alexa 594 Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10 Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11 Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus BX51
Congo red Sigma, St. Louis, MO
Cryostat GMI, Ramsey, MN LeicaCM1800
Curcumin Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene BDH, Dawsonville, GA
Filter papers Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342 Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope Leica, Buffalo Grove, IL Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus 1x70
Normal goat serum Sigma, St. Louis, MO
Paraffin Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100 Sigma, St. Louis, MO
Xylene VWR,Radnor, PA

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Maiti, P., Plemmons, A., Bowers, Z., Weaver, C., Dunbar, G. Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin. J. Vis. Exp. (153), e60377, doi:10.3791/60377 (2019).

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