Summary
Куркумин является идеальным фторфором для маркировки и визуализации амилоидных бета-белков ытец в ткани мозга из-за его преференциальной связывания с амилоидным бета-протеином, а также его структурных сходств с другими традиционными амилоидными связывающими красителями. Он может быть использован для обозначения и изображения амилоидных бета-белковых бляшек более эффективно и недорого, чем традиционные методы.
Abstract
Осаждение амилоидного бета-белка (АЗ) во вне- и внутриклеточном пространствах является одной из отличительных патологий болезни Альцгеймера (АД). Таким образом, обнаружение присутствия АЗ в тканях мозга АД является ценным инструментом для разработки новых методов лечения для предотвращения прогрессирования АД. Несколько классических амилоидных связывающих красителей, фторхром, визуальные зонды, и АЗ-специфических антител были использованы для обнаружения АЗ гистохимически в тканях мозга АД. Использование этих соединений для обнаружения АЗ является дорогостоящим и трудоемким. Тем не менее, из-за своей интенсивной флуоресцентной активности, высокой сродство, и специфичность для АЗ, а также структурные сходства с традиционными амилоидных связывающих красителей, куркумин (Cur) является перспективным кандидатом для маркировки и изображения бляшек АЗ в посмертном ткани мозга. Это натуральный полифенол из травы Curcuma longa. В настоящем исследовании, Cur был использован для гистохимически этикетки АЗ бляшки от как генетической мыши модели 5x семейной болезни Альцгеймера (5xFAD) и из человеческой ткани АД в течение минуты. Способность маркировки Cur была сравнена с обычными амилоидных связывающих красителей, таких как тиофлавин-S (Thio-S), Конго красный (CR), и Fluoro-нефрит C (FJC), а также АЗ-специфические антитела (6E10 и A11). Мы заметили, что Cur является самым недорогим и быстрым способом маркировки и изображения бляшек АЗ по сравнению с этими обычными красителей и сравнима с АЗ-специфических антител. Кроме того, Кур связывается с большинством видов АЗ, такими как олигомеры и фибриллы. Таким образом, Cur может быть использован в качестве наиболее экономичный, простой и быстрый флюорохром обнаружения агента для АЗ бляшек.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из наиболее распространенных, возрастных, прогрессирующих неврологических расстройств и одной из ведущих причин смерти во всем мире1,2. Обучение, память, и познания нарушения, наряду с нейропсихиатрическими расстройствами, являются общими симптомами проявляется вaD 3. Хотя этиология АД не была полностью выяснена, имеющиеся генетические, биохимические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что постепенное осаждение АЗ является окончательным биомаркером для АД4. Этот неправильно сложенный белок накапливается во внутриклеточных и внеклеточных пространствах и, как полагают, участвует в синаптической потере, повышенной нейровостригматии и нейродегенерации в корковых и гиппокампальных областях в мозге, пораженномАД 5. Таким образом, гистохимическое обнаружение АЗ в тканях АД является важным первым шагом в разработке нетоксичных, антиамилоидных препаратов для предотвращения прогрессирования АД.
В течение последних нескольких десятилетий, несколько красителей и антител были использованы во многих исследовательских лабораториях для обозначения и изображения АЗ бляшки в тканях мозга, но некоторые из этих методов являются трудоемкими и красители или антитела, используемые являются дорогостоящими, требуя несколько аксессуаров Химических веществ. Таким образом, разработка недорогих средств обнаружения бляшек АЗ в мозге АД было бы новым желанным инструментом. Многие лаборатории начали использовать Cur, перспективный антиамилоидный природный полифенол, для маркировки и визуализации АЗ, а также терапевтический агент дляAD 6,7,8,9. Его гидрофобность и липофильная природа, структурное сходство с классическими амилоидными связывающими красителями, сильная флуоресцентная активность, а также сильное сродство к связыванию с АЗ делает его идеальным флюорофором для маркировки и визуализации бляшек АЗ в ткани АД10 . Кур связывается с АЗ-бляшками и олигомерами, и его присутствие также обнаруживается во внутриклеточных пространствах7,11,12,13. Кроме того, было показано, что минимальное количество (1-10 нм) кур может пометить АЗ в 5x семейной болезни Альцгеймера (5xFAD) ткани мозга7. Несмотря на то, что концентрация 1 нМ не обеспечивает оптимальную интенсивность флуоресценции для подсчета бляшек АЗ, 10 нм или более высокая концентрация Кур делает. Ран и его коллеги14 сообщили, что дозы, как низко как 0,2 нМ дифторорона-дериватизированных Кур может обнаружить в виво АЗ отложений почти так же хорошо, как инфракрасный зонд. Достаточно ли этой дозы для обозначения бляшек АЗ в тканях, до сих пор не ясно. Большинство предыдущих исследований использовали 20-30 минут для окрашивания бляшек АЗ с использованием Cur, но оптимальное окрашивание может потребовать гораздо меньше времени.
Настоящее исследование было разработано, чтобы проверить минимальное время, требуемое Cur для обозначения БЛяшек АЗ в тканях мозга АД и сравнить чувствительность для маркировки и визуализации бляшек АЗ в тканях головного мозга от мышей 5xFAD после окрашивания с Cur с другими обычными Аз-связывающие красители, такие как Тиофлавин-С (Тио-С), Конго красный (CR) и Фтор-нефрит C (FJC). Способность маркировки этих классических амилоидных связывающих красителей была сравнена с куром, встроенными в парафина и криостатными коронарными мозгами от мышей 5xFAD и из выдержанных человеческих АД и контроля мозговой ткани. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Cur этикетки АЗ бляшки таким образом, похожие на АЗ-специфических антител (6E10) и умеренно лучше, чем Тио-S, CR, или FJC. Кроме того, когда интраперитонеальные инъекции мышей Cur к 5xFAD вводили в течение 2-5 дней, он пересек гематоэнцефалический барьер и связан с бляшками7. Интересно, что наномолярные концентрации Cur были использованы для обозначения и изображения бляшек АЗ в 5xFAD ткани мозга7,14. Кроме того, морфологически различные БЛяшки АЗ, такие как основные, неуритемые, диффузные и сгоревшие бляшки могут быть помечены Cur более эффективно, чем с любым из других обычных амилоидных связывающих красителей7. В целом, Cur может быть применен к этикетке и изображению бляшек ВК в посмертных тканях мозга из моделей aD животных и/или человеческой ткани АД простым и недорогим способом, как надежная альтернатива специфическим антителам АЗ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию (ACUC) Государственного университета Сагино-Вэлли. Человеческая ткань была получена из установленного банка мозга в Banner Sun Health Institute в Аризоне15,16.
1. Перфузия животных
- Подготовьте фиксаторные и перфузийные буферы.
- Подготовка 0,1 M фосфатного буфера натрия, добавив 80 г хлорида натрия (NaCl), 2 г хлористого калия (KCl), 21,7 г фосфата водорода динатрия (Na2HPO47H2O), 2,59 г фосфата калия диводорода (KH2PO4 ), и двойной дистиллированной воды, чтобы сделать в общей сложности 1 л.
- Подготовка 4% параформальдегида (PFA).
- Добавьте 40 г параформальдегида в 1 л ПБС (0,1 М, рН 7,4).
- Нагрейте раствор PFA до 60-65 градусов по Цельсию и смешайте с помощью магнитного мешалки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура не должна превышать 65 градусов по Цельсию. - Добавьте несколько капель NaOH (1 N) с капельницаю, чтобы полностью растворить PFA.
- Фильтр унижай раствор PFA со средним и тонкой фильтровальной бумагой и храните при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение хорошее в течение месяца.
- Выполните анестезию животных и перфузию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двенадцатимесячный B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1-M146L-L286V, 1136799Vas/J (5'FAD) возрастные контрольные мыши (n no 6 в группе) были приобретены у поставщиков и выведены в доме животных Сагино-Вэлли государственного университета. Генотипинг был подтвержден полимеразной цепной реакцией (ПЦР), как описано ранее7. Человеческая ткань мозга AD включает в себя посмертную ткань мозга AD и возрастную контрольную ткань.- Анестезия животное с соответствующим анестетический агент, такие как пентобарбитал натрия (390 мг/кг массы тела), или кетамин / ксилазин смесь (до 80 мг/кг тела вес кетамина и 10 мг/кг веса тела xylazine) путем интраперитонеальной инъекции (27 G иглы и 1 мЛ шприц). Проверьте уровень анестезии, щипая ногой. Если животное не реагирует, то оно готово к перфузионной операции.
- Поместите обезопадеченное животное в положение на спине на подносе хирургии перфузии и с помощью небольших ножниц радужной оболочки сделать разрез на задней части левого желудочка.
- Вставьте 22 G иглы перфузии в левый желудочек и сделать небольшой разрез в правом ячеек, чтобы удалить перфузионную жидкость из организма. Используйте гравитационную систему перфузии, чтобы позволить ледяной перфузийной жидкости (0,1 М ПБС, рН 7,4) течь в течение 5-6 мин (скорость потока 20-25 мл/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Четкая печень является показателем оптимальной перфузии. - Переключите буферный клапан на ледяной 4% параформальдегидный раствор для фиксации и дайте ему течь в течение 8–10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тремор следуют затвердевшей или жесткой конечностей являются показателями хорошей фиксации. - Удалить мозг из черепа с помощью ножниц. Используя шпатель, собирать мозг и поместить его в флакон 4% PFA (по крайней мере 10x объем объема мозга) и хранить при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования.
2. Обработка тканей
- Вырезать криостат разделы.
- Передача мозга в градуированные растворы сахарозы (10%, 20% и 30%) и хранить при 4 градусах по 24 ч каждый, пока не использовать.
- Используя криостат при -22 градусах Цельсия, вырежьте 40 мкм толщиной секций. Соберите 10-20 секций на скважину в 6 скважинной пластине, наполненной PBS и азидом натрия (0,02%).
- Парафин встраивает секции для мыши и ткани человеческого мозга.
- Для парафиновых секций обезвоживается пронизанаи и 24 ч постфиксированной мозговой ткани с градуированными спиртами (50%, 70%, 90%) за 2 ч каждый, а затем 100% алкоголя 2x на 1 ч каждый), а затем с ксилена 2x на 1 ч каждый) при комнатной температуре.
- Проникайте в ткань ксиленовым парафином (1:1) 2x на 1 ч при 56 градусах Цельсия в стеклянной конической колбе, покрытой алюминиевой фольгой.
- Погрузите ткань в расплавленный парафин (56 градусов по Цельсию) в течение 4-6 ч.
- Вырезать 5 мкм толщиной разделов с помощью роторного микротома при комнатной температуре и поместить их в ванну воды ткани при температуре 45 градусов по Цельсию.
- Гистохимически наметьте таблички АЗ в секциях криостата с куром.
- Промыть секции со ступени 2.1.2 с PBS (pH 7.4) 3x для 5 мин каждый.
- Погрузите секции в 70% этанола в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Растворите запас Кур (1 мМ) в метаноле и разбавьте 70% этанола, чтобы получить окончательную рабочую концентрацию 10 мкм.
- Погрузите секции рабочим решением Cur в течение 1-5 мин при комнатной температуре на шейкере при 150 об/мин.
- Откажитесь от решения Cur и промойте 70% этанола 3x на 2 мин каждый.
- Положите разделы на поли-L-лизина покрытием стеклянные слайды и монтировать с крышкой с помощью органических монтажных носителей, таких как дистирол пластификатор ксилена (DPX).
- Просматривайте под флуоресцентным микроскопом с помощью фильтров для возбуждения/выбросов 480/550 нм.
- Гистохимически наметьте бляшки АЗ в встроенной в парафин мыши и секции человеческого мозга с помощью Cur.
- Депарафинизировать участки тканей со ступени 2.2.4 с ксиленом 2x на 5 мин каждый при комнатной температуре.
- Регидратировать с градуированными растворами алкоголя (100%, 80%, 70%, 50% на 1 мин каждый) и с дистиллированной водой 2x на 5 мин каждый при комнатной температуре.
- Пятно разделов с Cur (10 мкм) в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте, встряхивая при 150 об/мин. Вымойте 70%, 90% и 100% спирт на 2 мин каждый.
- Очистить с ксиленом 2x в течение 5 минут каждый и крышка скольжения с DPX.
- Визуализируйте под флуоресцентным микроскопом, как упоминалось в шаге 2.3.7.
- Colocalize Cur с антителами АЗ в бляшках и олигомерах АЗ.
- Вымойте криостат разделы от шага 2.1.2 с PBS 3x в 12 хорошо пластины.
- Блок разделы с 10% нормальной сыворотки козы (NGS) растворяется в PBS с 0,5% Triton-X-100 при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Откажитесь от блокирующего решения. Инкубировать секции с антителами АЗ-специфических (6E10 или A11, разбавленные 1:200) растворяются в свежем блокирующем растворе, содержащем 10% NGS и 0,5% Triton-X100 на ночь при 4 градусах Цельсия в шейкере при 150 об/мин.
- Отбросьте раствор антител и промойте секции PBS 3x по 10 минут каждый.
- Инкубировать вторичным тегом антител с красным флюорофором (например, Alexa 594) на 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Вымойте pbS 3x по 10 мин каждый.
- Вымойте 70% спирта 1x.
- Инкубировать секции с Кур (10 мкм) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Вымойте 70% спирта 3x на 1 мин каждый.
- Обезвоживать 90% и 100% алкоголем по 1 мин каждый, очистить ксиленом 2x по 5 мин каждый, и смонтировать на слайдах с помощью DPX.
- Визуализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами возбуждения/выбросов для красных и зеленых сигналов.
- Для внутриклеточной колокализации АЗ, пятно разделов с использованием АЗ-антибод (6E10), отдых с Cur при комнатной температуре в темноте с тряской при 150 об/мин, и противораковые с либо Hoechst-33342 (1 мг/мл) и / или DAPI (1ug/ml) в течение 10 мин при комнатной температуре в темно ежей с тряской при 150 об/мин. Вымойте с PBS 3x.
- Возьмите изображения с красными, зелеными и синими фильтрами с целью 100x (общее увеличение 1000x).
- Наклейка АЗ таблички с Thio-S, CR, и FJC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы для маркировки Thio-S и CR ранее были зарегистрированы7.- Для окрашивания FJC промыть свободно плавающие секции, полученные от шага 2.1.2 с PBS 3x на 5 мин каждый.
- Поместите секции в 12 хорошо пластины и пятно с FJC (0.001%) в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
- Откажитесь от раствора FJC и промойте PBS 3x по 5 мин каждый.
- Инкубировать хлоридом аммония (NH4Cl, 50 мМ растворяется в PBS) в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Откажитесь от решения NH4Cl и промойте PBS 3x в течение 5 минут каждый.
- Следуя шагам в разделе 2.4, обезвоживается с градуированными растворами алкоголя, ясно, монтировать, и вид под флуоресценционным микроскопом с использованием 450/520 нм возбуждания / выбросов фильтров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Куркумин этикетки АЗ таблички в течение минуты. Когда мы запятнали ткань 5xFAD с Cur, мы обнаружили, что Cur этикетки АЗ бляшки в течение 1 мин. Несмотря на то, что увеличение времени инкубации с Cur несколько увеличило интенсивность флуоресценции бляшек АЗ, количество наблюдаемых бляшек АЗ не сильно отличалось между 1 мин и 5 мин времяок окрашивания (Рисунок 1).
Кур может маркировать бляшки АЗ в криостат-подготовленной, парафина-встроенной мыши и человеческой ткани АД, которая colocalizes с АЗ-специфические антитела в ткани мозга мыши AD. Когда мы запятнали криосекцию, парафин-встроенные разделы(Рисунок 2A) и людской ткани AD (Рисунок 2B),мы наблюдали Cur-маркированные бляшки Аз во всех типах разделов ткани. Кроме того, чтобы подтвердить, что Cur является обязательным для АЗ бляшки, мы сначала помечены бляшки с 6E10, а затем Cur окрашивания. Мы заметили, что Cur был полностью совместно локализован с АЗ на тех же табличках, которые связывались с 6E10(Рисунок 2C).
Cur помечены АЗ олигомеры и внутриклеточные агрегаты АЗ. Чтобы проверить, может ли Кур маркировать олигомеры, секции мыши 5xFAD были окрашены антителом, специфичным для азогомера (A11), за которым последовало окрашивание. Мы заметили, что Cur colocalized с A11 в АЗ бляшки(Рисунок 3A). Аналогичным образом, Cur также colocalized с 6E10 антитела во внутриклеточных пространствах(Рисунок 3В), указывая, что он может пометить внутриклеточного АЗ.
Cur помечены АЗ более заметно, чем классические амилоидные связывающие красители. Маркировка аз от Cur была сравнена с коммерчески доступными амилоидными связывающими красителей Thio-S, CR, FJC. В качестве стандартного контроля использовалось специфическое антитело 6E10. Мы заметили, что Cur помечены Аз более заметно, чем обычные амилоидные связывающие красители (Рисунок 4).
Производные cur bis-demethoxycurcumin (BDMC) и demethoxycurcumin (DMC), также присутствуют в экстракте куркумы, этикетке АЗ бляшки сравнительно Cur в 5xFAD ткани мозга. Два других основных компонента, такие как BDMC и DMC, присутствуют в экстракте куркумы. Мы проверили, являются ли эти два соединения также этикетки АЗ бляшки похожи на Кур. Когда 5xFAD мыши мозг разделы были окрашены с этими производными, как BDMC и DMC также помечены АЗ бляшки, параллельно Cur (Рисунок 5A). Различные монтажные носители были исследованы, чтобы проверить на наличие помех с АК-изображение милипосле ночню после окрашивания с Cur. Флуоресцентный сигнал был нетронутым как в вавных, так и в органических монтажных носителях, таких как DPX(рисунок 5B). Окрашивание бляшек АЗ с кур был уместным после иммунофлуоресцентной маркировки и сопровождалось противопосудом с раствором Hoechst 33342 (1 мг/мл) или 4',6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI, 1 мкг/мл). Иммунофлуоресцентные сигналы и контроцингирование интенсивности были сохранены после cur окрашивания(рисунок 5C).
Рисунок 1: Куркумин этикетки АЗ бляшки в течение минуты. (A). Мозг разделы от 5xFAD мышей или человеческого контроля и AD корковой ткани были окрашены cur (10 мкм) в течение 1'5 мин и количество видимых бляшек были подсчитаны. (B). Нет разницы не было отмечено в количестве АЗ-табличка рассчитывает между 1 мин и 5 мин окрашивания раз. Данные представлены как средняя погрешность средней (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Колокализация Кур с антителами Аз в бляшках АЗ. Кур может маркировать бляшки АЗ в криостат-подготовленных, парафин-встроенных разделов (A) и человеческой ткани АД (B). Маркировка АЗ параллели маркировки с АЗ-специфических антител (6E10, DAB окрашивания). (C). Разделы 5xFAD были впервые помечены антителами АЗ (6E10), а затем окрашивание с Cur. Красный no 6E10 связан вторичным антителом, помеченным флюорофором Alexa 594. Зеленый и кур. Cur полностью colocalized с АЗ на тех же бляшках, которые связаны с 6E10. Стрелки указывают на таблички АЗ. Шкала бар указывает 50 мкм (общее увеличение 400x) во всех трех изображений слева, и 10 мкм (общее увеличение 400x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Куркумин этикетки АЗ олигомеры и внутриклеточного АЗ. (A) АЗ-олигомер был обнаружен иммуногистохимически с помощью аз-специфических антител (A11), а затем окрашивание с Cur. Cur полностью colocalized с АЗ, в том же олигомере, где A11 связывает. Шкала бар 250 мкм и общее увеличение 100x. (B) Аналогичным образом, внутриклеточные АЗ был обнаружен иммуногистохимически с использованием АЗ-специфических антител (6E10), а затем окрашивание с Cur. Обратите внимание, что Cur полностью colocalized с АЗ в тех же областях, связанных с 6E10. Шкала бар 50 мкм и общее увеличение 1000x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сравнение различных амилоидных связывающих красителей с Cur для обозначения бляшек АЗ. Криостат разделы (40 мкм) из коры 12-месячного 5xFAD мышей были окрашены Кур, Тиофлавин-S, Конго красный, флюоро-нефрит C, и с 6E10 антитела. Cur помечены АЗ таблички более заметно, чем Тио-S, CR, и FJC. Стрелки указывают на таблички АЗ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Кур-производные бис-деметокси куркумин и деметокси куркумин также этикетке АЗ аналогично Кур. (A) Оба криостата и парафина встроенных 5xFAD разделы были окрашены Cur-производных бис-деметокси куркумин и деметокси куркумин. Оба эти производные этикетки АЗ бляшки в порядке, аналогичном Cur. (B) Оба ваквого и органического монтажа средств (DPX) были использованы для установки тканей разделов после маркировки АЗ бляшки с Cur. (C) Иммуномаркировка разделы были использованы для маркировки АЗ с Cur. Белые стрелки указывают на бляшки АЗ, зеленая стрелка — активированный астроцит (GFAP), а желтая стрелка — на ядерное пятно (DAPI). Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Функции | Аз-антибоди | Куркумин | Тио-С | Конго красный | Фтор-Джейд C |
| Длительность окрашивания | 24-48 ч | 1-5 мин. | 10 мин. | 60 мин. | 30 мин. |
| Вспомогательные химикаты | Вторичные антитела, несколько химических веществ, чтобы сделать буфер, нормальная сыворотка козы | Метанола | Этанол | NaOH и этанол | NaOH и этанол, пермангант калия |
| Стоимость | Дорого: один флакон антител, специфичный для ак-специфических, требует 200-300 евро | Экономично- и эффективная: 5-10/1 г cur и может быть применена для многих тканей | Экономично: 5,5/1 г, можно наносить на несколько тканей | Экономичный: 5/1 г Конго красный, и может быть применен для нескольких тканей | Стоимость: 15,500 евро/1 г порошка FJC |
| Специфика | Для олигомеров и фибриллов АЗ-олигомеры требуются различные антитела | Куркумин связывается с олигомерами и фибрилями | Может связывать только фибриллы, а не мономеры, или олигомеры | Может связываться только с АЗ-протофибрильями и фибрильями16,17 | Может связываться только с АЗ-фибрильями и вырожденными нейронами |
| Стабильности | В зависимости от красителя, прикрепленного к вторичному антителу | Очень стабильный, даже при комнатной температуре, когда связан с АЗ | Стабильный в метаноле | Стабильный в этаноле | Не стабильный |
| Уход после окрашивания | Нуждается в дополнительном уходе после окрашивания, например, в темноте и все время заморожены | Не так светочувствительный и более стабильный при комнатной температуре | Светочувствительный | Не светочувствительный | Светочувствительный |
| Требуется микроскоп | Соединение светового или флуоресцентного (в зависимости от использования вторичных антител) | Флуоресцентный | Флуоресцентный | Легкий микроскоп или поляризованный микроскоп или поляризуенный фильтр | Флуоресцентный |
| Фоновое окрашивание | Как правило, нет фона | Очень низкий фон | Высокий фон из-за связывания с липидной мембраной или липидных соединений в клетке | Низкий фон | Высокий фон |
| In vivo АЗ-изображение | Может быть неприменимо | Высоко применимо | Может быть неприменимо | Может быть неприменимо | Может быть неприменимо |
Таблица 1: Сравнение маркировки АЗ с различными амилоидными связывающими красителей и Cur7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша гипотеза состояла в том, что Cur может быть использован как самый быстрый, простой и наименее дорогой способ маркировки и изображения бляшек АЗ в посмертной ткани мозга АД по сравнению с другими классическими амилоидными связующими красителей, а также антителами АЗ. Целью этого исследования было определить минимальное время, необходимое для обозначения и изображения БЛяшек АЗ Cur в посмертной ткани мозга АД, и определить, можно ли использовать Cur в качестве альтернативы антителу АЗ для обозначения бляшек АЗ. С этой целью в разных временных точках наблюдалась способность Кур маркировки АК. Кур смог обозначить АЗ в течение одной минуты. Кроме того, маркировка АЗ по Cur была больше, чем другие обычные амилоидные связывающие красители, такие как Thio-S (0,1%), CR (1%) и FJC (0,001%).
Cur считается уникальным и идеальным фторфором для маркировки АЗ, потому что он имеет большинство характеристик, которыми обладает большинство обычных амилоидных связывающих красителей, включая структурные, физические, химические и биологические свойства10. Кроме того, из-за доступности, большинство исследователей заинтересованы в использовании этого природного полифенола. Чтобы показать специфику связывания Кур к бляшкам и олигомерам АЗ, мы использовали 6E10 и A11 (антитела, специфичные для АЗ-олигомера). Cur показал почти полную колокализацию со всеми различными видами АЗ, присутствующих в ткани, что свидетельствует о том, что Cur является весьма специфическим для A q7,17,18,19,20. Кроме того, Cur помечены АЗ олигомеры (Рисунок 3A) и внутриклеточной агрегаты АЗ (Рисунок 3В) и colocalized с антителами АЗ (Рисунок 2B), предполагая, что Кур может маркировать не только внеклеточные бляшки, но и АЗ, отложенные во внутриклеточных пространствах7.
В течение последних нескольких десятилетий, несколько флюорофоров и антител были разработаны для этикетки и изображения АЗ бляшки гистохимически. Несомненно, большинство из них очень специфичны для целевых видов АЗ и для обнаружения бляшек АЗ, но они намного дороже, и их использование занимает больше времени, чем использование Cur. Например, мы сравнили связывание акселератора Куром с другими амилоидными связывающими красителей, такими как Thio-S, CR и FJC, где в качестве эталонного контроля использовалось специфическое антитело АЗ (6E10). Эти результаты свидетельствуют о том, что Cur этикетки АЗ бляшки сильнее, чем любой из других фторофоров. Самое главное, по сравнению с Cur, некоторые из наиболее часто используемых флюорофоров имеют явные недостатки с точки зрения маркировки и визуализации АЗ. Например, Thio-S может производить отвлекающий, высокий фон, потому что он связывается с липидными мембранами или липидных соединений в клетке21. Аналогичным образом, CR, который обычно используется для обозначения АЗ, производит яблочный зеленый birefringence (Рисунок 4) под поляризованным микроскопом. CR не маркирует АЗ-таблички так же легко, как cur или Thio-S, маркировка значительно меньше азблики, чем те, обнаруженные Cur7,22,23. Гутьеррес и др. сообщили, что FJC, который может связываться с АЗ и с вырожденными нейронами, этикетки на более низкой частоте, чем либо Cur или Thio-S24. Эти результаты показывают, что эти широко используемые классические маркеры имеют меньше сродства для связывания с БЛяшками АЗ, чем Cur.
Кроме того, маркировка различных типов АЗ-бляшки (основные, неуритемые, диффузные, выгоревшие) могут быть оптимизированы с Cur, а не с другими амилоидными связывающими флюорофорами, потому что Cur может помочь визуализировать и различать морфологически различные бляшки АЗ, в то время как другие методы не различают эти морфологические подтипы7. Аналогичным образом, использование специфических антител АЗ, которые очень специфичны для различных видов АЗ, является очень дорогостоящим и трудоемким, принимая по крайней мере 24-48h с помощью иммуногистохимии. Кроме того, для обнаружения различных видов АЗ требуются различные антитела, а также несколько вспомогательных химических веществ, что значительно увеличивает общую стоимость. Очевидно, что Cur является менее дорогостоящим, более доступным, и производит более высокую интенсивность флуоресценции, когда он связывается с бляшками АЗ. Несмотря на то, что CR также является относительно экономично-эффективным методом для маркировки и визуализации бляшек АЗ, Cur может связывать и маркировать больше видов АЗ, таких как олигомеры25 (Рисунок 3 и Рисунок 4),в то время как CR связывается только с протофибрилами и фибрильс23. Таким образом, маркировка АЗ с Cur может быть достигнута более эффективно и рентафистично, чем Thio-S, CR или FJC(таблица 1).
Таким образом, Cur может обнаружить БЛяшки и олигомеры из ткани мозга АД эффективно, быстро и недорого. Кроме того, связывание Кур к АЗ очень специфично и его флуоресцентная активность очень стабильна. Для обозначения АЗ требуется минимальное количество (1-10 нм). Кроме того, Cur также очень специфичен для различных видов АЗ, таких как фибрильсили и бляшки, а также олигомеры7. Аналогичным образом, Производные cur demethoxycurcumin и bisdemethoxycurcumin также гавани амилоидных связывающих свойств и с этикетки АЗ аналогично Cur10 (Рисунок 5A). Таким образом, Cur является идеальным флюорофором для маркировки и визуализации бляшек АЗ в посмертной ткани мозга. Он может быть использован в качестве быстрой и простой альтернативы для обнаружения нагрузки на бляшки АЗ после антиамилоидной терапии в экспериментальных животных моделях АД. Наши выводы подтверждают сообщения о высокой сродстве Кур к АЗ, усиливая его потенциальное использование для мониторинга АЗ-бляшек в посмертном мозге и в живой ткани.
Для оптимальной маркировки Cur рекомендуется не маркировать АЗ с Cur в непромежаемых тканях и избегать длительного хранения тканей, так как это может производить большее количество фона, даже при промежутке. Для совместной маркировки, рекомендуется для завершения иммуногистохимии сначала с конкретными антитела, используемые перед окрашивание с Cur, а затем следовать этому с контр-окрашивания с помощью DAPI или Hoechst.
Возможные изменения в этот метод включают увеличение времени инкубации Cur с тканью до 30 минут, что не будет мешать интенсивности сигнала, хотя это может увеличить фон во время визуализации. Снижение концентрации Cur до менее чем 10 км/ мкм не препятствует маркировке АЗ до значительного уровня. Для уменьшения фона для тканей мозга человека можно было бы применить альтернативный метод подготовки. Например, участки мозга можно было бы первоначально лечить с 0,3% (w/v) Судан Черный B в 70% этанола (v/v) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем раздел может быть окрашены Cur в течение 10 минут при комнатной температуре, и промывают с PBS 3x в течение 15 минут, counterstained, и установлен с антиувядчий сми13. Толщины секции Cryostat также могут быть уменьшены до 20-25 мкм.
Потенциальные предостережения к этому методу включают связывание cur с атизмом в кровеносных сосудах, который отличается от внеклеточных бляшек АЗ. Таким образом, исследователь должен быть в курсе морфологии бляшек и олигомеров АЗ из АЗ в кровеносных сосудах. Следователь должен быть в курсе автоматических флуоресцентных сигналов. Избыток зеленого фона можно увидеть время от времени после cur окрашивания, но это может быть уменьшено за счет уменьшения времени окрашивания или за счет снижения концентрации Cur. Наконец, сигнал для комаркировки с другими маркерами может быть уменьшен из-за повторного лечения с клиринговым агентом (например, ксилена).
Важные ограничения включают неспособность colabel с любым маркером белка с использованием вторичных антител помечены зеленым флуоресцентным красителем, таких как флуоресцентный изотиоцианат (FITC). Они не могут быть использованы из-за аналогичного возбуждения / выбросов Кур. Кроме того, на ранних стадиях Н.д., только ограниченное количество АЗ может быть помечено Cur. Наконец, есть необходимость делать работу в темной среде, как и любой флуоресцентный краситель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Поддержка этого исследования была получена из Института полевых неврологий вознесения Святой Марии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
