High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Summary

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

Abstract

Totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) wordt vaak gebruikt in single-molecuul lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie als het geeft verbeterde contrast als gevolg van optische snijden. De conventionele benadering is het gebruik van hoge numerieke diafragma Microscoop TIRF-doelstellingen voor zowel excitatie als inzameling, waardoor het gezichtsveld en de doorvoer sterk worden beperkt. We presenteren een nieuwe aanpak voor het genereren van TIRF-excitatie voorbeeld vorming met optische golfgeleiders, genaamd chip-based nanoscopie. Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe chip-based Imaging wordt uitgevoerd in een reeds gebouwde installatie. Het belangrijkste voordeel van op chip gebaseerde nano scopie is dat de excitatie-en verzamel trajecten worden ontkoppeld. Beeldvorming kan dan worden gedaan met een lage vergrotings lens, resulterend in een groot gezichtsveld TIRF-beelden, tegen de prijs van een kleine reductie in resolutie. Lever sinusoïdale endotheliale cellen (LSECs) werden afgebeeld met behulp van directe stochastische optische reconstructie microscopie (dStorm), met een resolutie vergelijkbaar met traditionele super-resolution microscopen. Daarnaast demonstreren we de mogelijkheden voor hoge doorvoer door beeldvorming van een 500 μm x 500 μm-gebied met een lage vergrotings lens, wat een resolutie van 76 nm oplevert. Door zijn compacte karakter kan chip-based Imaging achteraf worden ingebouwd in de meest voorkomende microscopen en kan het worden gecombineerd met andere optische technieken op chip, zoals on-chip sensing, spectroscopie, optische overlapping, enz. De techniek is dus uitermate geschikt voor hoge doorvoer van 2D Super-Resolution Imaging, maar biedt ook grote mogelijkheden voor multimodale analyse.

Introduction

Sinds de eerste demonstratie van enkelvoudige molecuul lokalisatie microscopie, zijn veel variaties ontwikkeld om verschillende uitdagingen op te lossen^1,2,3. Een uitdaging die echter is gebleven, is een groot veld van zicht op beeld. Veel dStorm-opstellingen gebruiken dezelfde objectief lens om zowel het monster te prikkelen als om het te laten afbeellen. Om het gezichtsveld te vergroten, is een lens met een lage vergroting nodig. Lage vergroting en lage numerieke diafragma (NB) objectieve lenzen hebben meestal een grote scherptediepte, wat resulteert in een verhoogd buitenvlak signaal dat de lokalisatie precisie zal verminderen. TIRF-doelstellingen worden vaak gebruikt om het beeldcontrast te verhogen door het verminderen van de fluorescentie buiten het vliegtuig. Door middel van TIRF is de excitatie beperkt tot een optische dikte van ongeveer 150 nm van het oppervlak door middel van een evanescentie veld⁴. TIRF objectieve lenzen vereisen een grote NA wat resulteert in een kleine gezichtsveld (FOV) (bijvoorbeeld 50 x 50 μm²), wat de doorvoer aanzienlijk beperkt. Er zijn echter alternatieve manieren om een evanescentie veld te genereren.

Een optische golfgeleider is een structuur die het licht zal beperken en begeleiden als het in de structuur is gekoppeld. Meestal worden geleiders gebruikt in op vezels gebaseerde telecommunicatie. Er is grote inspanning geleverd om 2D geïntegreerde golfgeleiders te ontwikkelen als een hoofdbestanddeel van de Photonic integrated circuits. De technologie heeft gevorderd tot een punt waar het vervaardigen van laag-verlies nano-gestructureerde optische waveguides routinematig kan worden gedaan⁵. Tegenwoordig kunnen verschillende gieterijen over de hele wereld worden gebruikt om fotonische geïntegreerde circuits te ontwikkelen. Waveguides begeleiden licht door totale inwendige reflectie ook exposeren een evanescentie veld aan de oppervlakte. Door het zorgvuldige ontwerp van de Waveguide-structuur kan een hoge intensiteit worden bereikt in het evanescerende veld. Een voorbeeld dat direct bovenop het Waveguide-oppervlak wordt geplaatst, kan dus ook worden verlicht door het veld voor beeldvormings toepassingen. Het evanescerende veld wordt gegenereerd over de gehele lengte en breedte van de Waveguide, en kan dus willekeurig groot worden gemaakt⁶.

We presenteren een nieuwe benadering van TIRF dstorm die een willekeurig groot gezichtsveld biedt. In plaats van een TIRF-objectief te gebruiken voor zowel excitatie als verzameling, wekken we het gebruik van het evanescerende veld uit optische golfgeleiders. Dit ontkoppelt de excitatie-en collectie lichtweg, waardoor totale vrijheid langs het lichtpad van de collectie mogelijk is zonder afbreuk te doen aan de optische snede voor een bepaalde golflengte die wordt geboden door de Waveguide-chip verlichting. Lage vergrotings lenzen kunnen dus worden gebruikt om zeer grote gebieden in de TIRF-modus te beelden, hoewel een kleiner NA de laterale resolutie zal verminderen. Bovendien is Multicolor beeldvorming ook sterk vereenvoudigd met behulp van waveguides⁷, omdat verschillende golflengten kunnen worden begeleid en gedetecteerd zonder het systeem opnieuw te afstellen. Dit is voordelig voor dStorm, omdat lage golflengten kunnen worden gebruikt voor het verbeteren van de knipperen en voor meerkleurige beeldvorming. Het is vermeldenswaard dat de penetratie diepte van het evanescerende veld zal veranderen als een functie van golflengte, hoewel het geen invloed heeft op hoe de beeldvormings procedure wordt uitgevoerd. De chip is compatibel met Live Cell Imaging⁸ en is ideaal voor toepassingen zoals de integratie van microfluïdica. Elke chip kan tientallen waveguides bevatten, die de gebruiker in staat stellen om onder verschillende omstandigheden beeld te geven of optische overvulling⁹ en Raman-spectroscopie¹⁰toe te passen.

Het op chip gebaseerde systeem werkt net zo goed voor zowel diffractie-beperkte als superresolutie-beeldvorming. Een soortgelijke aanpak werd geïntroduceerd in 2005 met behulp van een prisma voor het genereren van evanescentie veld excitatie⁴. De Photonic chip prikkelt ook door de evanescerende veld, maar met moderne Waveguide fabricagetechnieken, kan men exotische lichtpatronen genereren met waveguides. De huidige op chip gebaseerde nano scopie-implementatie is beperkt tot 2D-beeldvorming, omdat het excitatie veld in het Waveguide-oppervlak is vergrendeld. Toekomstige ontwikkeling zal gericht zijn op 3D-toepassingen. Daarnaast worden andere super-resolution technieken zoals gestructureerde verlichtings microscopie ontwikkeld met dezelfde chip-gebaseerde Microscoop¹¹.

Protocol

1. bereiding van de laag Polydimethylsiloxaan (PDMS)

1. Maak een 10:1 mix van Sylgard 184 monomeer en Uithardings middel.
2. Plaats het mengsel in een vacuümkamer totdat er luchtbellen zijn verdwenen.
3. Giet 1,7 g PDMS mengsel in het midden van een 3,5 inch (diameter) Petri schaaltje.
4. Plaats de Petri schaal op de vacuüm boorkop van een spin coater.
5. Spin Coat de Petri schaal voor 20 sec. bij 900 rpm, met een acceleratie van 75 rpm/s.
6. Genees het gerecht op een kookplaat bij 50 °C gedurende ten minste 2 uur.

2. monstervoorbereiding

1. Waveguide schoonmaken
   1. Bereid 100 mL van een 1% verdunning van het reinigingsmiddel concentraat (tabel van de materialen) in gedeïoniseerd (di) water.
   2. Plaats de chip in een glazen Petri schaaltje met een wafer pincet en dek deze volledig af met de reinigingsoplossing.
   3. Plaats de Petri schaal gedurende 10 minuten op een hete plaat bij 70 °C.
   4. Wrijf het oppervlak nog op de hete plaat met een doekje van een cleanroom-doekje.
   5. Verwijder de chip uit de Petri schaal. Spoel met ten minste 100 mL DI water.
   6. Spoel af met ten minste 100 mL isopropanol, zorg dat het oplosmiddel niet op het oppervlak droogt om verdamping te voorkomen.
   7. Spoel met ten minste 100 mL DI water. Blaas de chip droog met een stikstof pistool.
2. Voorbereiding van de kamer
   1. Bereid een laag van 150 μm Polydimethylsiloxaan (PDMS) in een Petri schaaltje (sectie 1).
   2. Gebruik een scalpel om een frame van 1,5 cm x 1,5 cm te knippen van de PDMS-laag.
   3. Til het frame van de Petri schaal met een pincet. Stort het plat op een schone en gepolijste chip. Het monster is nu klaar voor het zaaien van cellen.
3. Fluorescerende labeling
   1. Bereid de volgende chemicaliën voor: fosfaat-gebufferde zoutoplossing, kleurstofoplossing (en), dStorm Imaging buffer.
   2. Na het zaaien van de cel verwijdert u de chip uit de media.
   3. Gebruik een pipet om overtollige vloeistof van buiten de PDMS-kamer te verwijderen.
   4. Verwijder de huidige vloeistof uit de PDMS-kamer met een pipet, terwijl u tegelijkertijd ongeveer 60 μL schone PBS toevoegt.
      Opmerking: het bedrag dat aan de kamer wordt toegevoegd, moet worden aangepast aan de grootte van de kamer. Zorg ervoor dat u niet alle media uit het celoppervlak verwijdert.
   5. Vervang de PBS met 60 μL schone PBS en laat deze gedurende 1 minuut inbroed.
   6. Herhaal de vorige stap en laat deze gedurende 5 minuten inbroed.
   7. Verwijder de PBS en vervang deze door 60 μL van de kleurstofoplossing. Laat het monster ongeveer 15 minuten inbroed, zodat het van licht wordt afschermen.
      Opmerking: deze stap moet mogelijk aanzienlijk veranderen, afhankelijk van de gebruikte fluorescerende kleurstof. We gebruiken CellMask Deep Red om het celmembraan voor dit experiment te labelen
   8. Was het monster met PBS zoals in de stappen 2.3.3-2.3.5.
   9. Verwijder de PBS en vervang deze tegelijkertijd door 40 μL van de beeldvormings buffer.
      Opmerking: er zijn verschillende beeldvormings buffers voor verschillende fluorescerende kleurstoffen.
   10. Plaats een dekslip bovenop en voorkom dat luchtbellen eronder ontstaan. Druk voorzichtig op de Afdeklijst tegen de Imaging kamer om overtollige media te verwijderen.
   11. Gebruik een pipet om overtollige media buiten de dekslip te verwijderen. Reinig het gebied buiten de dekslip met een water vochtig doekje om te voorkomen dat er kristallen ontstaan door gedroogde Onderdompelings resten.

3. beeldvormings procedure

1. Onderdelen instellen
   Opmerking: deze versie van de Setup bestaat uit drie hoofdcomponenten: de Microscoop, de koppelings fase en de sample stage. Zie de tabel met materialen.
   1. Gebruik een microscoop met een filterhouder, witte lichtbron, camera en objectiefrevolver.
   2. Gebruik een 3-assige piëzo-koppelings fase met een Fiber-gekoppelde laser en een koppelings lens.
   3. Gebruik een eenassige handmatige sample stage met Tip en Tilt en een vacuüm houder.
   4. Monteer zowel de koppeling als de monster fase op een gemotoriseerde 2-assige fase voor de monster vertaling.
2. Waveguide koppeling
   1. Plaats de chip op de vacuüm boorkop met het koppelings facet naar de koppelings doelstelling. Zorg ervoor dat de chip ongeveer één brandpuntsafstand van de koppelings doelstelling is.
   2. Zet de vacuümpomp aan.
   3. Zet de laser aan op 1 mW. Stel de spaan hoogte ruwweg zo in dat de straal de rand raakt. Schakel de laser uit.
   4. Schakel de witte lichtbron in. Kies een objectief objectief met lage vergroting (bijv. 10x). Richt de Microscoop op een Waveguide.
   5. Vertaal de Microscoop langs de Waveguide om te zien of deze goed is uitgelijnd met het optische pad. Beweeg de Microscoop naar de koppelings rand.
   6. Zet de laser aan met 1 mW of minder. Vertaal de Microscoop langs de koppelings rand om het laserlicht te vinden. Richt de straal op de spaan rand.
   7. Pas de koppelings fase aan langs het optische pad in de richting waardoor de spotgrootte van de laserstraal wordt verkleind totdat deze verdwijnt. De straal is nu boven of onder het spaan oppervlak.
   8. Pas de hoogte van de koppelings fase aan totdat de straal vlek weer verschijnt en is gemaximaliseerd.
   9. Herhaal de twee voorgaande stappen totdat de laser een gerichte plek vormt.
   10. Verplaats de gerichte plek naar de Waveguide van belang.
   11. Vertaal de Microscoop op korte afstand van de rand zodat de gerichte straal vlek niet meer zichtbaar is. Schakel het witte lampje uit.
   12. Pas het contrast aan. Als de Waveguide leidend is, moet het verstrooide licht langs de golfgeleider duidelijk zichtbaar zijn.
   13. Pas de assen van de koppelings fase aan om de verstrooide lichtintensiteit te maximaliseren. Schakel de laser uit.
   14. Schakel het witte lampje in. Pas het contrast zo nodig aan.
   15. Navigeer naar de Imaging regio.
3. Diffractie beperkte beeldvorming
   1. Focus met de gewenste Imaging doelstelling. Schakel het witte lampje uit.
   2. Plaats het fluorescentie filter en draai het Laser vermogen op 1 mW.
   3. Stel de belichtingstijd van de camera in op ongeveer 100 MS. pas het contrast zo nodig aan. Zorg ervoor dat de koppeling nog steeds is geoptimaliseerd.
   4. Zoek een regio van belang voor Imaging. Schakel de piëzo stage looping naar de gemiddelde out modes.
      Opmerking: een scanbereik van 20 μm met een stapgrootte van 50 nm is geschikt voor de meeste Waveguide-constructies.
   5. Leg ten minste 300 afbeeldingen vast.
   6. Laad de vastgelegde afbeeldings stack naar Fiji met behulp van een virtuele stack. Kies stapels en z-projectin het menu afbeelding in Fiji.
   7. Bereken de TIRF-afbeelding door de gemiddelde intensiteit vanhet projectietype te kiezen.
4. d STORM Imaging
   1. Zet de laser aan op 1 mW en stel de belichtingstijd van de camera in op 30 MS.
   2. Pas het contrast en de scherpstelling aan.
   3. Verhoog het Laser vermogen tot het knipperen wordt waargenomen.
      Opmerking: dit kan even duren, afhankelijk van de veld intensiteit.
   4. Zoom in op een klein gebied van het voorbeeld.
   5. Pas het contrast aan.
   6. Leg een paar afbeeldingen vast om te zien of de knippert goed zijn gescheiden.
   7. Pas de belichtingstijd van de camera aan voor optimaal knipperen.
      Opmerking: het optimaliseren van knipperen is een complexe taak, maar er is een heleboel geschikte literatuur beschikbaar¹².
   8. Zet de piëzo stage looping aan.
   9. Noteer een afbeeldingsstapel van ten minste 30.000 frames, afhankelijk van de knipperende dichtheid.
5. d Reconstructie van STORM image
   1. Open Fiji en laad de dStorm-stack als virtuele afbeeldingen.
   2. Pas het contrast zo nodig aan.
   3. Gebruik het gereedschap rechthoek om het gebied te selecteren dat u wilt reconstrueren.
   4. Open Run analyse in de onweersbui¹³ plugin in Fiji.
   5. Stel de basis camera-instellingen in onweer die overeenkomt met het apparaat. De overige standaardparameters zijn meestal bevredigend.
   6. Start de wederopbouw.
      Opmerking: voor het volledige gezichtsveld moeten de gegevens mogelijk worden onderverdeeld in substacks, vanwege de grote bestandsgrootte.
   7. Filter de lokalisatie lijst van de reconstructie software om niet-specifieke lokalisaties te verwijderen. Apple een extra drift correctie indien nodig.

Representative Results

TIRF microscopie is een populaire techniek als het verwijdert buiten het vlak fluorescentie, verhoogt contrast en dus verbetert de beeldkwaliteit, en is minder fototoxisch in vergelijking met andere fluorescentie gebaseerde microscopie technieken. Vergeleken met de traditionele objectieve benadering biedt chip-based microscopie TIRF excitatie zonder de beperkte doorvoer die meestal gepaard gaat met een TIRF-objectief. Een overzicht van de gepresenteerde instellingen is te vinden in Figuur 1A. We presenteren diffractie-beperkt en dStorm beelden van lever sinusoïdale endotheliale cellen (LSEC) geëxtraheerd uit muizen. Een groot gezichtsveld beeld van LSECs met gelabelde microtubulin wordt ook gepresenteerd, demonstreren de mogelijkheden van hoge doorvoer Imaging. Een conventionele dStorm Setup met behulp van een olie onderdompeling tirf lens (60x of 100x vergroting) meestal beelden een oppervlakte van 50 μm x 50 μm, dat is 100 keer kleiner dan de chip-gebaseerde afbeelding in Figuur 2, afbeelding gemaakt met een 25x, 0,8 na doelstelling.

In deze methode gebruiken we multi-moded si₃N₄ waveguides voor excitatie. De gebruikte chips bestaan uit een strook-geëtste geleidelaag van 150 Nm si₃N₄ afgezet over een 2 μm geoxideerde laag van een silicium chip. Een schematische voorstelling van de chip kan worden gevonden in Figuur 1B. De golfgeleiderbreedten kunnen variëren tussen 200 en 1000 μm. fabricagegegevens kunnen elders worden gevonden⁸. Door interferentie tussen de vermeerderings modi zal het excitatie lampje geen homogene intensiteits verdeling hebben, maar veeleer een ruimtelijk wisselend patroon. Figuur 2A presenteert een afbeelding met duidelijk zichtbare modus patronen. Dit interferentiepatroon zal veranderen met de positie van de laserstraal aan de rand van de Waveguide. Om homogene excitatie in de uiteindelijke beelden te bereiken, gebruiken we een piëzo-fase om langs het gekoppelde facet te oscilleren. In de loop van de beeldvormings procedure bestaat er voldoende variatie van de interferentie patronen, zodat ze gemiddeld kunnen worden, waarbij intensiteits schommelingen in de afbeelding worden verwijderd. De afbeeldingsstapel zal bestaan uit verschillende afbeeldingen, zoals in Figuur 2A, hoewel met verschillende patronen, maar bij gemiddelde, zal de stapel een afbeelding met homogene excitatie opleveren, zoals Figuur 2B. Een alternatieve benadering is het gebruik van adiabatische taps toelopende om brede, enkele moded waveguides^8,14te bereiken, waardoor de noodzaak van de gemiddelde modus wordt verwijderd. Echter, enkele millimeter van taps toelopende lengte nodig zijn om de single-mode voorwaarde te bereiken een 100 μm Waveguide breedte. Multi-moded waveguides omzeilen deze taps toelopende noodzaak en laat geen beperkingen op de breedte van de structuur. Buiten het verlichtings patroon, de zeer effectieve brekingsindex van de modi zorgen voor ongekende mogelijkheden naar gestructureerde verlichting microscopie¹¹ en fluctuatie microscopie methoden⁷.

De eerste stap in Imaging is het verzamelen van een diffractie beperkt beeld. Het experiment resulteert in een stapel van ongeveer 300 beelden en de uiteindelijke afbeelding wordt gemaakt door het nemen van het gemiddelde van de stapel. In Figuur 2presenteren we Diffractie Limited en dStorm Imaging van Lsecs gelabeld met cellmask Deep Red met behulp van een 60X, 1,2 na water onderdompeling doel. Figuur 2A vertoont een inhomogene verlichting, veroorzaakt door onvoldoende modus gemiddelde. Het gemiddelde van de modus wordt weergegeven in afbeelding 2B. Figuur 2C is een dStorm beeld van dezelfde regio, met het gemarkeerde gebied weergegeven in Figuur 2d. Lever sinusoïdale endotheliale cellen hebben nano-sized poriën in het plasma membraan¹⁵, die hier kan worden gezien. Een Fourier ring correlatieanalyse voorzag in een resolutie van 46 nm.

Figuur 3 presenteert een dStorm-beeld van een 500 μm x 500 μm-gebied, dat de hoge doorvoercapaciteit van de techniek aantoont. Een ingezoomd beeld van Figuur 3A, overeenkomend met een typisch d-Storm-gezichtsveld, wordt samen met het beperkte diffractie-beeld in Figuur 3Bgepresenteerd. Een Fourier ring correlatie om de resolutie te schatten werd uitgevoerd, wat een waarde van 76 nm oplevert.

Figuur 1: Imaging systeem en Waveguide. A) foto van het beeldvormings systeem. Het monster wordt op een vacuüm boorkop op de monster fase geplaatst, met het koppelings facet van de golfgeleider naar de koppelings doelstelling. Een vezel gekoppelde laser en een koppelings doelstelling wordt bovenop een 3D piëzo-podium geplaatst. Een lens torentje met Imaging lenzen vangt het beeld van bovenaf en stuurt het naar een camera. (B) Schematische voorstelling van de Waveguide met koppelings-en beeldvormings lenzen. De koppelings lens paren licht in de Waveguide. De monsters (Oranje kralen) worden in een verzegelde PDMS-kamer bewaard. Het evanescerende veld langs de Waveguide zal het monster prikkelen en de beeldvormings doelstelling zal de uitgestoten fluorescentie opvangen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Afbeelding 2: diffractie-beperkt en dStorm beelden. A) beeldvan lever sinusoïdale endotheliale cellen met onvoldoende modus gemiddelde, resulterend in een duidelijk zichtbaar excitatie patroon. B) hetzelfde gebied als ondera), maar met voldoende gemiddelde middelen, resulterend in homogene excitatie. C) beperkt beeld van de inzet in (B); D) dStorm beeld van dezelfde regio. E) inset van (D), waarbij de fenestraties in het plasma membraan van de cel duidelijk worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: dStorm beeld van Rat lsecs. (A) groot veld van View dSTORM beeld van Alexa 647 gekleurd tubuline in rat lsecs. Schaalbalk = 50 μm. (B) groter gemarkeerde gebied van (a) vergelijking diffractie-beperkt (linksonder) en dStorm-afbeelding (rechtsboven). C) kleiner gemarkeerde gebied (a). Schaalbalk = 1 μm. De afbeelding heeft een resolutie van 76 nm. Aangepast met toestemming van Helle et al. 2019⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Chip-based Imaging is vergelijkbaar met conventionele dStorm Imaging. Beeldkwaliteit kan dus worden gemeten met dezelfde benaderingen als voor traditionele dStorm-beeldvorming. Het belangrijkste verschil voor de gebruiker is dat de doorzichtige glazen schuif wordt uitgewisseld met een ondoorzichtige si-wafer. Hoewel ze erg verschillend lijken, is de behandeling van het monster nagenoeg analoog aan een glazen glijbaan. De chips zijn behoorlijk stevig en kunnen gemakkelijk worden behandeld met wafer pincet. De Imaging procedure en de reconstructie van de afbeelding is hetzelfde als in een reguliere dStorm-experiment. Het opzetten van een functionele chip-gebaseerde Microscoop vereist geen speciale componenten, behalve de Photonic chips. Verdere details van de set-up is te vinden in vorige werk^6,7. De chips gebruikt in dit werk zijn vervaardigd met behulp van standaard foto lithografie⁸.

De monstervoorbereiding omvat de bereiding van de monsterkamer. Bij het bevestigen van de PDMS frame aan de chip, is het cruciaal om te voorkomen dat eventuele kleine plooien of rips waar lucht kan binnenkomen. Als de PDMS plooien bij het bevestigen, verwijder deze dan voorzichtig met een pincet en bevestig hem opnieuw. Wanneer het monster in de PDMS-kamer klaar is, moet het dekglas tegen het worden geperst en de regio verzegelen. Het is belangrijk om eventuele luchtbellen te vermijden die zich kunnen vormen bij het bevestigen van het dekglaasje. Als er een luchtbel wordt gevormd, verwijder dan voorzichtig het dekglaasje en voeg PBS toe aan de monsterkamer om ervoor te zorgen dat het monster bedekt is. De voorbereiding en bevestiging van de Afdekstrook kan dan gewoon opnieuw worden gedaan.

Het koppelingslampje in de Waveguide wordt vereenvoudigd met het in dit document voorgestelde protocol. Er zijn echter enkele veelvoorkomende uitdagingen die de koppeling kunnen beperken. Ten eerste, als de chip niet goed werd gereinigd en eventuele overgebleven PBS volledig zijn verwijderd, kan er vuil of PBS op de Waveguide worden gekristalliseerd. Dit kan leiden tot grote verliezen, wat resulteert in zeer weinig macht in de Imaging regio. Het gebruik van een vochtig doekje om de regio buiten het afdekglas te reinigen kan het vermogen aanzienlijk verbeteren. Ten tweede, als het koppelings facet van de Waveguide beschadigd is (bijv. door onjuiste hantering), kan het koppelings verlies drastisch toenemen. Optische inspectie van de rand zal meestal onthullen eventuele schade gemakkelijk. Het volledige koppelings facet van de chip kan zorgvuldig worden gepolijst, net als een optische vezel, en geeft een glad koppelings facet, dat vervolgens het gekoppelde vermogen verhoogt.

Nadat het lampje is gekoppeld, is de beeldvormings procedure hetzelfde als bij elke conventionele dStorm-installatie. Als het beeld heeft inhomogene excitatie, zoals aangetoond in Figuur 2A, dan is het meest waarschijnlijk het gemiddelde van de modus werkte niet goed. De twee meest voorkomende redenen hiervoor zijn: 1) te weinig beelden die zijn vastgelegd om een gemiddelde stapel te maken en 2) te kort van een oscillatie afstand/te groot van een stapgrootte. Het verzamelen van te weinig afbeeldingen kan sommige excitatie patronen weglaten en het gemiddelde zal dus inhomo geen zijn. Dit kan eenvoudig worden opgelost door het aantal afbeeldingen in de gemiddelde stapel te verhogen. Een te korte oscillatie afstand kan ook resulteren in een inhomogene afbeelding, omdat niet genoeg modus patronen opgewonden zijn. Dit kan ook gemakkelijk worden opgelost door het verhogen van de oscillatie afstand en/of het verminderen van de stapgrootte. In dit werk hebben we een piëzo-podium gebruikt om de invoer laserstraal over 20 μm te scannen en ten minste 300-afbeeldingen te verkrijgen. Een andere aanpak zou kunnen zijn om High-Speed galvo-mirrors te gebruiken om het licht binnen een enkele acquisitie tijd over het input Waveguide-facet te scannen, zoals 10-30 MS. deze optie is geschikt voor Live-celtirf-beeldvorming, waarbij subcellulaire organellen constant in beweging zijn.

Chip-based dStorm biedt een ongekend groot gebied tirf-excitatie, waardoor het uitermate geschikt is voorbeeld vorming met hoge doorvoer. Het compacte karakter maakt het mogelijk om achteraf te monteren op commerciële systemen, waarbij de chip ondersteboven kan worden geplaatst voor omgekeerde opstellingen of transparante ondergronden kunnen worden ontwikkeld. De chips zijn massa gefabriceerd en kunnen worden aangepast aan vele behoeften. Momenteel is de belangrijkste beperking dat het beperkt is tot 2D. Het evanescerende veld is slechts ongeveer 200 nm verwijderd van het Waveguide-oppervlak, dus alleen fluor Foren binnen deze regio zullen enthousiast zijn. In totaal biedt het gebied van geïntegreerde optiek in de nabije toekomst veel mogelijkheden voor chip-based microscopie, door nieuwe beeldvormings vragen aan te pakken en nieuwe mogelijkheden te bieden aan bestaande.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-axis sample stage	Standa	7T173-20
2-axis sample translation stage	Mad City Labs		Custom order
3-axis NanoMax stage	Thorlabs	MAX311D
BXFM microscope body	Olympus	OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies	ThermoFisher	C10046
Cleanroom grade swabs	MRC Technology	MFS-758
Fiber-coupled laser	Cobolt	Flamenco
Filter Holder	Homemade
Hellmanex III, Hellma Gmbh	Sigma-Aldrich	Z805939	Cleaning detergent concentrate
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935-1L
KL 1600 LED	Olympus	OLY-LSM-E0433314
Olympus Coupling lens	Olympus	LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB	Mix according to descriptions
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit	Dow	1673921
Tip-tilt stage	Thorlabs	APR001
Vacuum holder	Thorlabs	HWV001
Wafer Tweezers Type 2W	Agar scientific	AGT5051