Summary
该协议是作为一种以简化、低成本的方式生产脑器官的方法，没有外源性生长因子或基底膜基质，同时仍然保持脑细胞类型的多样性和细胞组织的许多特征。
Abstract
与胚胎干细胞不同的人脑器官为研究三维系统中多种细胞类型的复杂相互作用提供了独特的机会。在这里，我们提出了一个相对简单和廉价的方法，产生大脑器官。在本协议中，人类多能干细胞被分解成小簇，而不是单个细胞，在基本培养基培养基中生长，没有异质基底膜基质或外源性生长因子，允许内在发育线索形成有机物的生长。这个简单的系统产生多种脑细胞类型，包括胶质和微胶质细胞、干细胞和前脑、中脑和后脑的神经元。该协议生成的有机体还显示了适当的时空组织特征，这些特征通过明场图像、组织学、免疫荧光和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。由于这些有机物含有来自大脑各个部位的细胞类型，它们可用于研究多种疾病。例如，在最近的一篇论文中，我们演示了利用从这个协议生成的有机体来研究缺氧对人脑的影响。这种方法可用于研究一系列其他难以研究的条件，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经疾病。
Introduction
由于无数的实际和伦理限制，在研究人脑方面遇到了很大的困难。虽然利用啮齿动物的研究对于我们了解人脑至关重要，但老鼠脑却有许多不同。有趣的是，老鼠的神经元密度至少是灵长类脑3、4的7倍。虽然从进化的角度来看，灵长类动物比啮齿动物更接近人类，但大多数研究人员与它们合作是不现实的。该协议的目的是使用简化且成本较低的方法重新概括人脑的许多重要特征，而无需异质基底膜基质或外源性生长因子，同时保持脑细胞多样性和细胞组织。
Sasai实验室的造形工作使用胚胎体无血清培养法（SFEBq）方法，从信号胚胎干细胞（ESCs）5、6生成二维和三维神经元细胞类型。许多人脑器官方法都遵循了一个相对相似的路径，从信号ESCs7，8。相反，该协议从分离的人类ESCs（hESCs）开始，类似于在电镀步骤9、10之前汤姆森和张实验室的开创性工作的初始步骤，以及Pasca实验室在添加外源性生长因子11之前的大脑有机体协议的初始步骤。基底膜基质（例如，母体凝胶）已用于许多脑器官协议，并已被证明是一个有效的支架8。然而，最常用的基底膜基质基质并非没有并发症，因为它们与未知数量的生长因子共同纯化，在生产过程中分批到批次变异。此外，这些矩阵会使成像复杂化，并增加污染风险和成本。
虽然人脑器官可以用来回答许多问题，但有一定的局限性要记住。首先，从胚胎干细胞开始，器官比老年大脑更类似于不成熟的大脑，因此可能不是老年疾病（如阿尔茨海默氏症）的理想模型。其次，虽然我们的协议发现了前脑、中脑和后脑发育的标记物，这些标记有助于研究治疗或疾病对来自多个大脑区域的细胞的影响，但可以遵循其他协议，以专注于特定的大脑区域13、14。最后，有机体模型的另一个限制是大小，而人脑的平均长度约为167毫米，使用搅拌使大脑器官增长到4毫米8和由该协议形成的器官增长到1-2毫米10周。尽管如此，该协议为研究人类脑组织和多种细胞类型的相互作用提供了重要工具。
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Protocol
1. 干细胞维持
- 根据制造商的说明，在生长因子减少的层上保持H9 hESC（参见材料表，以后简称矩阵）。
- 要涂覆一个 6 孔板或一个 10 厘米的盘子，请将 100 μL 的基质与 5.9 mL 的冰冷 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM）/F12 介质相结合。将板包裹在石蜡薄膜中，并在 4°C 下存放过夜。在过量的基质/培养基被吸进后，第二天使用它们进行传交细胞。
- 以大约每 7 天 1：12 的分裂比率将细胞培养为每周到一周。在37°C低氧培养箱（5%O 2，5%CO2）中使用mTESR-1培养基保持细胞。每天刷新媒体。使用玻璃工具将细胞与通道之间的培养分离出来。
- H9细胞应在利用它们产生有机物之前四到六天通过。细胞应以大约1：8的细胞簇比例通过。为此，首先用DMEM F12介质冲洗细胞，用中性蛋白酶（例如，脱粒，以后简称为蛋白酶）分离细胞，用DMEM/F-12冲洗，在4个板（6孔或10厘米）的+20%汇合时将细胞作为30-60细胞簇。收获前两天，将它们转移到常规孵化器（21% O2，5%CO2）。板在开始有机体形成时应达到±80%的汇合度。
2. 组织文化hESC的分离
- 对蛋白酶溶液（5 U/mL）进行比分。
注意：我们通常在-20°C下冻结1 mL等分，以在几个月内使用。 - 通过为每个 6 孔或 10 厘米板的 hESC 添加 1 mL 的库存溶液加上 5 mL 的 DMEM/F12，将蛋白酶溶液稀释到工作浓度。
- 吸气并去除细胞培养基，然后用蛋白酶溶液覆盖hESC。将板放在培养箱中10-15分钟，或直到菌落的边缘四舍五入并开始从基质分离。
- 倾斜板，吸出蛋白酶溶液，用DMEM/F12轻轻清洗细胞三次。使用 6 孔板时，每次洗涤使用 2 mL/孔，使用 10 厘米板时使用 6 mL。执行此步骤时，请确保菌落与矩阵保持连接。
- 将大约 1.5 mL 的新鲜 mTESR 介质再添加到每口孔中（或 10 厘米板的 5 mL），并使用温和的移液将细胞从板上冲洗。
- 使用 10 mL 移液器，轻轻吸气并在板内分配 hESC，直到其达到其原始尺寸的大约1/30。完成这些步骤后，菌群簇应类似于 ±250-350 μm 大小的正方形。
3. 器官的生成
- 将细胞转移到单个超低附件T75烧瓶中，该瓶中含有30 mL的mTESR介质，没有基本的成纤维细胞生长因子（bFGF）。
- 第二天，倾斜烧瓶，使活细胞池在角落里（这可能需要5-10分钟的第一天，但会更快，因为集群变大）。
注：如果此步骤或任何后续步骤中大量细胞粘附在烧瓶底部，则将细胞转移到新的烧瓶中。头两天有大量死细胞是正常的。执行介质更换时，请确保清除尽可能多的电池碎屑。 - 一旦细胞沉降，吸出介质和死细胞留下约10 mL的含有活细胞的介质。
- 加入±20 mL的低bFGF介质（DMEM/F12辅以1xN2、1x B27、1x L谷氨酰胺、1x NEAA、0.05%牛血清白蛋白（BSA）和0.1m单二甘油（MTG）补充30纳克/mL bFGF）。
- 检查第 2 天的单元格。如果大多数细胞看起来健康和明亮，就没有必要做任何事情。但是，如果超过三分之一的细胞出现暗，则用 ±20 mL 的低 bFGF 介质，辅以 20 纳克/mL bFGF，将介质（使用与步骤 3.2 中的相同倾斜技术）替换。
- 在第 3 天，用 20 mL 的低 bFGF 介质（使用步骤 3.2 中的倾斜技术）替换一半的介质，并辅以 10 纳克/mL bFGF。
- 在第 5 天，用 20 mL 的神经感应介质（NIM：DMEM/F12、1x N2 补充剂、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mL 肝素）替换一半的介质（使用步骤 3.2 中的倾斜技术）。
注：如果有任何大簇的细胞或器官比其他细胞或有机体大得多，它们应该从培养物中删除。大小根据显微镜下的外观估计;例如，使用带心的目镜。大多数有机物的大小相似（大约100×20μm）。我们移除了大约2倍小于或大于其他的有机物。 - 每隔一天用 NIM 替换一半的介质（±15 mL）（使用倾斜技术）。
- 在培养3周后，向介质中加入100x青霉素/链霉素（NIM：DMEM/F12，1x N2补充剂，0.1mM MEM NEAA，2 μg/mL肝素），最终浓度为1倍（如果需要的话）。每隔一天刷新一次媒体。
注：在这种方式下，我们在文化中保持了长达6个月的有机物。
4. RNA提取和制备
- 使用 10 mL 移液器从烧瓶中轻轻提取大约 15 个有机物（取决于大小），然后放入 1.5 mL 管中。
- 在离心机中轻轻颗粒有机物（200 x g 1 分钟），然后用 1x Dulbeco 的 PBS （DPBS） 冲洗三次。
- 使用经过验证的系统或协议（例如，RNeasy 试剂盒）提取 RNA。
- 测量每个样品的光学密度值为 260 和 280 nm。
- 使用经过验证的系统或协议（例如，iScript cDNA 合成试剂盒）准备 cDNA。
- 使用预先验证的引源 （表 1） 执行 qRT-PCR，包括至少一个内务管理基因。
5. 免疫性化学
- 固定
- 制备4%的甲醛（PFA）溶液，并将其置于4°C。
- 使用无菌剃须刀，切断无菌转移移液器的尖端。
- 使用切割转移移液器轻轻提取有机物，因为它们很容易破碎，特别是当它们变大时，并将其放入带有附加介质或 DPBS 的 6 孔板中。
- 倾斜板，吸气介质，然后更换为 1x DPBS。用1x DPBS再冲洗两次细胞。
- 用 4% PFA 溶液替换 DPBS，并在 4°C 处放在摇摇器上。
注：虽然我们固定2天（对于小器官）到7天（对于器官>3个月），较短的时间（例如，16-24小时）也可能是可能的。 - 在 DPBS 中制备 30%、20% 和 10% 蔗糖溶液。
- 在 PFA 中固定后，用 10% 蔗糖溶液更换，并在 4°C 的摇摇器上放置 24 小时。
- 用20%蔗糖代替10%蔗糖，并在4°C下放在摇摇器上24小时。
- 用30%蔗糖代替20%蔗糖，并在4°C下放在摇摇器上24小时。
- 冻结部分
- 准备一层平坦的干冰，并在上面放置一个贴有标签的塑料模具。
- 将一层最优切削温度介质 （OCT） 倒入模具中，使其开始变硬（几秒钟内）。
- 使用切尖的转移移液器在模具中将一些有机体放在 OCT 的顶部，并密切注意有机体的位置。
- 慢慢加入OCT，直到模具饱满，有机物被覆盖。让它完全硬化10分钟。
注：虽然冷冻超过10分钟有助于确保多种有机物在切片时的理想相对位置，但可以使用乙醇干冰混合物或液氮更快地冻结。 - 用标记标记器官的相对位置，使其在切割时更容易找到它们。
- 将模具放入袋子或包装盒中，并储存在 -80°C，直到准备好切割部分。
- 使用低温片，切片 10 μm 部分，并将组织放在贴有正电荷的幻灯片上。
- 染色
- 制备阻断液（0.3%Triton X-100，PBS中4%正常驴血清）。
- 使用疏水性纸笔在组织周围绘制。
- 用 PBS 冲洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。
- 在室温下用阻隔溶液更换PBS1小时。
- 在4°C过夜4°C时，用抗体溶液（适当浓度的抗体，0.1%Triton X-100，PBS中4%正常驴血清）替换阻断溶液。
- 第二天，用PBS洗3次幻灯片，每次10分钟。
- 在室温下，用在抗体溶液中稀释1小时的适当二级抗体（在适当浓度下）替换PBS。
- 每次用 1x PBS 冲洗 3 次 10 分钟。
- 涂抹 4'，6-二酰胺-2-苯胺醇 （DAPI） 污渍，用 1x PBS 冲洗三次，每次 10 分钟。
- 用安装解决方案将盖板贴在幻灯片的前面，在黑暗中室温下晾干，并在黑暗中储存在 4°C 处。
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Representative Results
图 1显示了多个时间点的代表性亮场图像，以演示细胞/有机体在协议的不同阶段的外观。hESCs被从组织培养板中取出，分解成小块，并放置在T75超低附着瓶中，在那里形成球体。需要注意的是，这些细胞看起来明亮，大小相似，这些簇的中心没有黑暗的垂死细胞。细胞逐渐断掉bFGF。第5天，他们被安置在神经诱导介质中，在整个文化时期，他们一直留在这种媒介中。虽然随着时间的推移，有机体变大，因此变暗，但重要的是要注意神经玫瑰花状结构（黑色箭头），这些结构存在于整个大脑器官发育和膨胀中。玫瑰花表示神经分化的开始，并包含胚胎神经管的特征，显示上皮特征和周围一个表干15。
在培养中5个月对有机体进行血氧素和欧辛染色表明，即使在中心也没有大量坏死，这是最初关注的，因为文化系统停滞（图2A）。这些器官在由经验丰富的神经病理学家进行光微观评估的基础上，展示了一种类似于人类皮层的组织形态（图2B）。通过组织学，观察到许多独特的细胞形态类似胶质（蓝色箭头）、神经元（红色箭头）、具有Cajal-Retzius形态的细胞（黑色箭头）和神经孔（橙色箭头）（图2B，C）。
为了更深入地观察细胞内的基因表达，进行了qRT-PCR。对于图 3所示的结果，每个条形表示 3 个独立生长并在指定时间点收获的细胞批次。然后，这些样本与一个引源对指示基因的三联运行，除了内务管理基因，GAPDH。谷氨酸运输器，Vglut1（图3A），在2.5周时表示，在5周时增加，并在培养中维持5个月不变。前脑标记，Foxg1（图3B），在培养的5周内一直维持在低水平。深层标记Tbr1（图3C）在5周左右达到峰值，随后下降，而上层标记Satb2（图3D）随时间而增加。
腹腔标记Engrailed1 （Eng1） （图 3E）， 后脑/脊髓标记Hoxb4 （图 3F） 以及寡核苷酸标记物的表达 （图 3G）， 都随着时间的推移而增加.相反，干细胞标记物Sox2（图3H）随时间而减少。胶质标记，FAP（图3I），在5周时达到顶峰，随后保持相对稳定。此外，免疫荧光数据与qRT-PCR数据一致。在10周有一个有力的表达Foxg1 （图4A）。Sox2的表达更局限于类似于下室区域 （SVZ） 的区域（图4B，C）。有趣的是，外径向胶质细胞标记HopX（图4D）也有一些表达。
图1：器官生长条件和形态概述。（A） 介质变化的原理图.（B-M）有机物成熟时的代表图像。（B-M）H9 hESCs （B） 被用来形成大脑器官.（C） 第 2 天在 20 纳克/mL bFGF 介质中的有机体，和 （D） 第 3 天和 （E） 第 4 天在 10 纳克/mL bFGF 介质中的组织。（F-M）神经诱导介质 （NIM） 中的有机体 （NIM） 在第 5 天 （F）、 8 （G）、10 （H）、17 （I） 35 （J、 K） 和 70 （L，M.箭头指向神经玫瑰花环。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：有机体与人类脑组织有共同的组织相似性。H&E在5个月（A）时对器官进行染色，有些层类似于人体皮层（B）。在较高的放大倍率观察到许多细胞形态，包括胶质（蓝色箭头）、神经元（红色箭头）、神经毛（橙色箭头）和具有Cajal-Retzius形态的细胞（黑色箭头）（B，C）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：大脑中神经发育基因随时间的表达。定量RT-PCR数据使用SYBR绿色评估Vglut1（A），Foxg1（B），Tbr1（C），Satb2（D），En1（E），Hoxb4（F），Olig2（G），Sox2（H）和GFAP（I）。误差条 = 平均值 = 标准偏差 （n = 3）。这个数字已由16。有关引种信息，请参阅表 1。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：10周大脑器官内神经发育蛋白的表达。免疫荧光揭示了Foxg1（A）的强健表达，Sox2（B，C）的局部表达和HopX（D）的存在。请点击此处查看此图的较大版本。
| 基因 | 序列（5' 到 3'） | 安普利翁 | 外 显 子 | |
| En1 | F | GGACAATGTAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGAGGGTTT GGCTAGA |
2 | ||
| 福克斯格1 | F | AGAAAGAGAGAGTAC 加加 |
188 | 1 |
| R | 特格特加加加加格格格格 TGGC |
1 | ||
| 加普德 | F | ACCACAGTCACAT Cac |
449 | 8 |
| R | 中航协GTGTGTGT AGCC |
9 | ||
| Gfap | F | 阿加加特CACGCGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTGGGGGG 多伦多 |
4月5日 | ||
| 霍克斯b4 | F | AAAGCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGCACAAAGAAGA GGGAGA |
2 | ||
| 奥利格2 | F | CCCTGGTTCGGA 全球气候委员会 |
451 | 1 |
| R | GCGGCTTATATTTGA GACGC |
2 | ||
| 萨布2 | F | 塔加利亚加加特克 Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCGGCCCC Ttg |
7 | ||
| 索克斯2 | F | CCCAGATAT 燃气轮机 |
150 | 1 |
| R | CCCATATCTCGT TTT |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCCGCCTACCAA Cac |
101 | 4 |
| R | 阿科克格格格格塔加特格 Tg |
6 | ||
| 弗格鲁1 | F | 卡加特特格格格特格格格 反恐 |
183 | 4月5日 |
| R | GCGACTCCGTTTAG GTG |
6 |
表1：图3中用于定量RT-PCR的引性序列。
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Discussion
与其他有机体模型类似，这是一个带有几个警告的人工系统。虽然在整体表达水平上几乎没有批次变化，但单个器官确实表现出差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每一个有机体中并不相同（图 3）。虽然qPCR适合寻找细胞批次的整体变化，但附加技术，如单细胞RNAaq，将在今后的研究中使用，以逐细胞收集更多信息。这个系统的另一个限制是，它没有像最近的一些研究17、18、19那样，将血管整合在有机体中。然而，将hESC从低氧环境过渡到高氧环境可能更类似于发育中的胚胎中的厌氧过渡到有氧过渡。
该协议中的关键步骤是形成神经球以及适当的维护，包括使用适当的培养基进行介质变化，以确保生长的有机体的健康细胞和足够的营养，而不会过度拥挤.为了解决细胞增殖或分化不足的问题，我们建议从一批新的低通道ESC和新鲜准备的介质（包括补充剂）开始。有时可能会有试剂和材料的批次变化。因此，我们建议购买多瓶试剂，如N2和超低附件瓶，只要它们可以在合理的时间内使用，它们就来自同一批次。
与许多其他脑器官协议不同，这种方法不使用生物反应器;相反，除了介质变化之外，细胞仍然相对停滞。这与之前对神经球的工作类似，神经球最终被分解，使2D神经元培养20。在此模型中，细胞以 3D 格式保存，允许在培养中生长长达 6 个月。研究发现，当使用小簇而不是聚合单个细胞，有机体看起来更亮，我们解释为较少的坏死。如前所述，当大脑器官簇在5个月时通过组织学和免疫荧光评估时，没有明显的坏死16区。虽然从小细胞群开始，在形成的器官大小上引入一点变化，但大多数有机物的大小大致相似。
使用异质基底膜基质和生物反应器既有优点也有缺点。某些细胞类型，或较大的脑器官可能更喜欢生长在一种或另一种条件下。基底膜基质或其他水凝胶可能有利于选择性地向特定区域添加生长因子或创建特定模具。虽然基底膜基质已被证明支持三维组织和分化15，但值得强调的是，其中一些产品的定义和可变成分，包括生长因子12的数量。除了在培养大脑器官时简化工作流程外，没有基底膜基质也可能改善三维成像技术。
这种脑有机体模型系统的开发为许多潜在的应用提供了一种新的方法。例如，低血糖、高血糖、高血脂和感染等有毒侮辱可以通过这个系统进行测试。此外，神经发育障碍可以通过从转基因干细胞或患者特定的人类诱导多能干细胞（hPSCs）开始来研究。在器官培养过程中添加不同细胞类型的能力也为研究肿瘤-大脑相互作用提供了可能性。鉴于协议的简单性以及缺乏昂贵的特种材料，我们希望该领域内外的实验室能够将这种方法视为一种潜在的方法，具有其独特的优势，可进一步推动这一进展。进步和令人兴奋的纪律。
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Disclosures
S.G.K. 是 Dansar IT 和细胞内基因的 SAB 成员。
Acknowledgments
我们感谢耶鲁干细胞核心（YSCC）和耶鲁癌症中心（YCC）的帮助。我们感谢金正英博士的神经病理学评论。这项工作得到了康涅狄格州再生医学研究基金、Dimes 的三月和 NHLBI R01HL131793（S.G.K.）、耶鲁癌症中心和耶鲁癌症生物学培训计划 NCI CA193200 （E.B.） 的支持，以及约瑟夫和露西尔·马德里
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
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