Summary
Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.
Abstract
Les organoïdes du cerveau humain différenciés des cellules souches embryonnaires offrent l’occasion unique d’étudier des interactions compliquées de plusieurs types de cellules dans un système tridimensionnel. Ici nous présentons une méthode relativement simple et peu coûteuse qui donne des organoïdes de cerveau. Dans ce protocole, les cellules souches pluripotentes humaines sont divisées en petits groupes au lieu de cellules simples et cultivées dans des médias de base sans matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou facteurs de croissance exogènes, permettant aux indices développementaux intrinsèques de façonner le croissance de l’organoïde. Ce système simple produit une diversité de types de cellules cérébrales, y compris les cellules gliales et microgliales, les cellules souches et les neurones du cerveau avant, du cerveau moyen et du cerveau postérieur. Les organoïdes générés à partir de ce protocole présentent également des caractéristiques d’organisation temporelle et spatiale appropriée démontrées par des images de champ lumineux, l’histologie, l’immunofluorescence et la réaction en chaîne quantitative de transcription inverse en temps réel de polymérase de polymérase ( qRT-PCR). Parce que ces organoïdes contiennent des types de cellules de diverses parties du cerveau, ils peuvent être utilisés pour étudier une multitude de maladies. Par exemple, dans un article récent, nous avons démontré l’utilisation d’organoïdes générés par ce protocole pour étudier les effets de l’hypoxie sur le cerveau humain. Cette approche peut être utilisée pour étudier un éventail de conditions autrement difficiles à étudier telles que les handicaps neurodéveloppementaux, les troubles génétiques et les maladies neurologiques.
Introduction
En raison d’une myriade de limitations pratiques et éthiques, il y a eu beaucoup de difficulté à étudier le cerveau humain. Alors que les études utilisant des rongeurs ont été essentiels à notre compréhension du cerveau humain, le cerveau de la souris a de nombreuses différences1,2. Fait intéressant, les souris ont une densité neuronale qui est au moins 7 fois moins que le cerveau des primates3,4. Bien que les primates soient plus proches des humains que des rongeurs d’un point de vue évolutif, il n’est pas pratique pour la plupart des chercheurs de travailler avec eux. Le but de ce protocole était de récapituler beaucoup de dispositifs importants du cerveau humain utilisant une méthode simplifiée et moins chère sans avoir besoin d’une matrice hétérologue de membrane de sous-sol ou de facteurs de croissance exogènes tout en maintenant la diversité de cellules de cerveau et l’organisation cellulaire.
Les travaux de formation du laboratoire Sasai ont utilisé la culture sans sérum des corps embryonnaires (SFEBq) méthode pour générer des types de cellules neuronales à deux et trois dimensions à partir de cellules souches embryonnaires signalisées (ESC)5,6. Beaucoup de méthodes organoïdes du cerveau humain ont suivi un chemin relativement similaire à partir de CES signalés7,8. En revanche, ce protocole commence par des grappes d’ESC humains détachés (HESC), semblables aux premières étapes des travaux séminals des laboratoires Thomson et Zhang avant les étapes de placage9,10 ainsi que l’étape initiale du protocole organoïde du cerveau du laboratoire Pasca avant l’ajout de facteurs de croissance exogènes11. Des matrices de membrane de sous-sol (p. ex., matrigel) ont été utilisées dans de nombreux protocoles organoïdes du cerveau et il a été démontré qu’il s’agit d’un échafaudage efficace8. Cependant, les matrices de membrane de sous-sol les plus couramment utilisées ne viennent pas sans complications car elles co-purifie avec des quantités inconnues de facteurs de croissance avec la variabilité de lot à lot pendant la production12. De plus, ces matrices peuvent compliquer l’imagerie et augmenter le risque de contamination et de coût.
Alors que les organoïdes du cerveau humain peuvent être utilisés pour répondre à de nombreuses questions, il ya certaines limites à garder à l’esprit. D’une part, à partir de cellules souches embryonnaires, les organoïdes ressemblent plus étroitement aux cerveaux immatures qu’aux cerveaux âgés et, en tant que tels, ne sont peut-être pas des modèles idéaux pour les maladies qui surviennent chez la vieillesse, comme la maladie d’Alzheimer. Deuxièmement, alors que notre protocole a trouvé des marqueurs de développement du cerveau antérieur, du cerveau moyen et du cerveau postérieur qui sont utiles pour étudier l’effet d’un traitement ou d’une maladie sur les cellules de plusieurs régions du cerveau de concert, d’autres protocoles peuvent être suivis pour se concentrer sur des régions spécifiques du cerveau13,14. Enfin, une autre limitation des modèles organoïdes est celle de la taille, alors que la longueur moyenne d’un cerveau humain d’environ 167 mm, les organoïdes cérébraux fabriqués avec l’utilisation de l’agitation poussent jusqu’à 4 mm8 et les organoïdes formés par ce protocole se développent à 1-2 mm par 10 semaines. Néanmoins, ce protocole fournit un outil important pour étudier le tissu cérébral humain et l’interaction de plusieurs types de cellules.
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Protocol
1. Entretien des cellules souches
- Maintenir h9 hESCs sur une couche de facteur de croissance a réduit la matrice de membrane de sous-sol (voir le tableau des matériaux, désormais simplement appelé matrice) selon les instructions du fabricant.
- Pour enrober une assiette de 6 puits ou un plat de 10 cm, combiner 100 oL de matrice avec 5,9 ml de milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 modifié par du dulbecco. Envelopper les assiettes dans un film de paraffine et les conserver toute la nuit à 4 oC. Utilisez-les le lendemain pour passer les cellules après l’excès de matrice / média est aspiré.
- Culture les cellules semaine après semaine à environ un rapport de 1:12 tous les 7 jours. Maintenir les cellules à l’aide d’un support mTESR-1 dans un incubateur à faible teneur en oxygène de 37 oC (5 % O2, 5 % CO2). Rafraîchissez les médias tous les jours. Désherchez les cellules différenciant de la culture entre les passages à l’aide d’outils en verre.
- Les cellules H9 doivent être passages quatre à six jours avant de les utiliser pour produire des organoïdes. Les cellules doivent être passages à environ un rapport de 1:8 des amas cellulaires. Pour ce faire, commencez par rincer les cellules avec des médias DMEM F12 et dissocier les cellules avec une protéase neutre (par exemple, la dispase, désormais appelée simplement protéase), rincer avec DMEM/F-12, et la plaque comme 30-60 clusters cellulaires sur 4 plaques (6-bien ou 10 cm) à 20% de confluency. Deux jours avant la récolte, les faire passer à un incubateur régulier (21% O2, 5% CO2). Les plaques devraient atteindre 80 % de confluence lors du démarrage de la formation d’organoïdes.
2. Dissociation des HESC pour la culture organoïde
- Aliquot la solution de stock de protéase (5 U/mL).
REMARQUE : Nous gelons généralement 1 ml d’aliquots à -20 oC pour une utilisation sur plusieurs mois. - Diluer la solution de stock de protéase à la concentration de travail en ajoutant 1 ml de la solution de stock plus 5 ml de DMEM/F12 pour chaque plaque de 6 puits ou 10 cm de hESC.
- Aspirez et supprimez les supports de culture cellulaire, puis couvrez les HESC avec la solution de protéase. Placer les plaques dans l’incubateur pendant 10-15 min ou jusqu’à ce que les bords des colonies se rassemblent et commencent à se séparer de la matrice.
- Inclinez la plaque, aspirez la solution de protéase et lavez délicatement les cellules avec du DMEM/F12 trois fois. Utilisez 2 ml/puits pour chaque lavage lorsque vous utilisez une plaque de 6 puits et 6 ml lorsque vous utilisez une plaque de 10 cm. Assurez-vous que les colonies restent attachées à la matrice lors de l’exécution de cette étape.
- Rajoutez environ 1,5 ml de mTESR frais à chaque puits (ou 5 ml pour une plaque de 10 cm) et rincer les cellules de la plaque à l’aide d’un tuyauterie doux.
- À l’aide d’une pipette de 10 ml, aspirez doucement et distribuez le hESC dans la plaque jusqu’à ce qu’ils atteignent environ 1/30e de leur taille d’origine. Les grappes de colonies doivent ressembler à des carrés de taille de 250 à 350 m à l’achèvement de ces étapes.
3. Génération d’organoïdes
- Transférer les cellules dans un seul flacon T75 à attachement ultra-faible contenant 30 ml de mTESR sans facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF).
- Le lendemain, inclinez le flacon (s) de telle sorte que la piscine de cellules vivantes dans le coin (cela peut prendre 5-10 min le premier jour, mais deviendra plus rapide que les grappes deviennent plus grandes).
REMARQUE : S’il y a un grand nombre de cellules qui ont adhéré au fond du flacon à cette étape ou à toute étape suivante, transférez les cellules à un nouveau flacon. Il est normal d’avoir une population élevée de cellules mortes pendant les deux premiers jours. Lorsque vous effectuez des changements de médias, assurez-vous d’enlever autant de débris cellulaires que possible. - Une fois que les cellules se déposent, aspirez les milieux et les cellules mortes laissant environ 10 ml de milieux contenant les cellules vivantes.
- Ajouter 20 ml de faible bFGF (DMEM/F12 complété par 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x NEAA, 0,05% d’albumine de sérum bovin (BSA), et 0,1 mM monothioglycérol (MTG) complété par 30 ng/mL bGF).
- Vérifiez les cellules le jour 2. Si la plupart des cellules semblent saines et lumineuses, il n’est pas nécessaire de faire quoi que ce soit. Cependant, si plus d’un tiers des cellules semblent sombres, remplacez le support (en utilisant la même technique d’inclinaison que dans l’étape 3.2) par 20 mL de faible bFGF médias complétés par 20 ng/mL bFGF.
- Le jour 3, remplacer la moitié du support (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 mL de faible bFGF médias complétés par 10 ng/mL bFGF.
- Le jour 5, remplacer la moitié du milieu (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 ml de milieu xtronisme à induction neuronale (NIM: DMEM/F12, 1x N2 supplément, 0,1 mM MEM NEAA, 2 'g/mL héparine).
REMARQUE : S’il y a de grands groupes de cellules ou d’organoïdes qui sont beaucoup plus grands que les autres, ils devraient être retirés de la culture. La taille est estimée par l’apparence sous le microscope; par exemple, à l’aide d’un oculaire avec réticle. La majorité des organoïdes sont de taille similaire (environ 100 à 20 m). Nous avons enlevé les organoïdes qui étaient approximativement 2x plus petits ou plus grands que les autres. - Remplacer la moitié du milieu (15 ml) (en utilisant la technique d’inclinaison) par NIM tous les deux jours.
- Après 3 semaines de culture, ajouter 100x pénicilline/streptomycine aux médias (NIM: DMEM/F12, 1x Supplément N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 'g/mL d’héparine) à une concentration finale de 1x si désiré. Rafraîchissez les médias tous les deux jours.
REMARQUE: De cette façon, nous avons maintenu les organoïdes pour un jusqu’à 6 mois dans la culture.
4. Extraction et préparation de l’ARN
- Extraire délicatement environ 15 organoïdes (selon la taille) du flacon à l’aide d’une pipette de 10 ml et placer dans un tube de 1,5 ml.
- Pelleter doucement les organoïdes dans la centrifugeuse (200 x g pour 1 min), et rincer avec 1x DUlbecco PBS (DPBS) trois fois.
- Extraire l’ARN à l’aide d’un système ou d’un protocole validé (p. ex., kit RNeasy).
- Mesurer la valeur de densité optique de chaque échantillon à 260 et 280 nm.
- Préparer l’ADNc à l’aide d’un système ou d’un protocole validé (p. ex., kit de synthèse iScript cDNA).
- Effectuer qRT-PCR à l’aide d’amorces prévalidées (tableau 1) comprenant au moins un gène d’entretien ménager.
5. Immunohistochimie
- Fixation (Fixation)
- Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et la placer à 4 oC.
- À l’aide d’un rasoir stérile, couper la pointe d’une pipette de transfert stérile.
- Extraire délicatement les organoïdes à l’aide de la pipette de transfert de coupe, car ils peuvent être facilement décomposés, surtout quand ils grandissent, et les placer dans une plaque de 6 puits avec des supports supplémentaires ou DPBS.
- Inclinez la plaque, aspirez le support et remplacez-le par 1x DPBS. Rincer les cellules avec 1x DPBS deux fois de plus.
- Remplacer le DPBS par une solution PFA de 4 % et placer sur un shaker à 4 oC.
REMARQUE: Alors que nous avons fixé pendant 2 jours (pour les petits organoïdes) à 7 jours (pour les organoïdes '3 mois), des temps plus courts (par exemple, 16-24 h) peuvent également être possibles. - Préparez des solutions de saccharose de 30 %, 20 % et 10 % dans DPBS.
- Après fixation en PFA, remplacer par la solution de saccharose à 10% et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
- Remplacer le saccharose de 10 % par un saccharose de 20 % et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
- Remplacer le saccharose de 20 % par un saccharose de 30 % et placer sur un shaker à 4 oC pendant 24 h.
- Sections congelées
- Préparer une couche plate de glace sèche et placer un moule en plastique étiqueté sur elle.
- Verser une fine couche de milieu de coupe optimal (OCT) dans le moule et laisser commencer à durcir (en quelques secondes).
- Placez quelques organoïdes sur le dessus de l’OCT dans le moule à l’aide d’une pipette de transfert avec la pointe coupée et portez une attention particulière à l’emplacement des organoïdes.
- Ajouter lentement dans OCT jusqu’à ce que le moule est plein et les organoïdes sont couverts. Laisser durcir complètement pendant 10 min supplémentaires.
REMARQUE : Bien que la congélation de plus de 10 min contribue à assurer un placement relatif idéal de plusieurs organoïdes pour la section, il est possible d’utiliser un mélange de glace sec à l’éthanol ou de l’azote liquide pour geler plus rapidement. - Marquez l’emplacement relatif des organoïdes avec un marqueur pour les rendre plus faciles à trouver lors de la coupe.
- Placer les moules dans un sac ou une boîte et les conserver à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient prêts à couper les sections.
- À l’aide d’un cryostat, trancher les sections de 10 m et placer le tissu sur des lames étiquetées et chargées positivement.
- Coloration
- Préparer la solution de blocage (0,3% Triton X-100, 4% sérum d’âne normal en PBS).
- Utilisez un stylo pap hydrophobe pour dessiner autour du périmètre du tissu.
- Rincer les diapositives avec PBS 3 fois pendant 5 min chacune.
- Remplacer le PBS par une solution de blocage pendant 1 h à température ambiante.
- Remplacez la solution de blocage par une solution d’anticorps (anticorps à concentration appropriée, 0,1 % Triton X-100, 4 % sérum d’âne normal en PBS) à 4 oC pendant la nuit.
- Le lendemain, lavez la diapositive 3 fois avec du PBS pendant 10 min chacune.
- Remplacer le PBS par l’anticorps secondaire approprié (à la concentration appropriée) dilué dans la solution d’anticorps pendant 1 h à température ambiante.
- Rincer 3 fois pendant 10 min à chaque fois avec 1x PBS.
- Appliquer la tache de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et rincer trois fois pendant 10 min chacun avec 1x PBS.
- Affix couvre l’avant des glissières avec une solution de montage, laisser sécher à température ambiante dans l’obscurité, et stocker dans l’obscurité à 4 oC.
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Representative Results
La figure 1 montre des images représentatives de plusieurs points de temps pour démontrer à quoi ressemblent les cellules/organoïdes tout au long des différentes étapes du protocole. Les HESC ont été retirés de la plaque de culture tissulaire, brisés en petits morceaux, et placés dans un flacon d’attachement ultra-bas T75 où ils formaient des sphères. Il est important de noter que les cellules semblent brillantes et similaires dans la taille, sans sombre, cellules mourantes dans les centres de ces grappes. Les cellules ont été graduellement souflées outre de bFGF. Le jour 5, ils ont été placés dans les médias d’induction neurale et ils sont restés dans ce média tout au long de la période culturelle. Bien que les organoïdes deviennent plus grands et donc plus sombres au fil du temps, il est important de prendre note des structures neurales rosette-like (flèches noires) qui sont présents tout au long du développement organoïde du cerveau et de se développer. Les rosettes indiquent l’initiation de la différenciation neuronale et contiennent des caractéristiques du tube neural embryonnaire, affichant des caractéristiques épithéliales et entourant un lumen apical15.
La coloration des organoïdes avec de l’hématoxylin et de l’éosine à 5 mois de culture a indiqué qu’il n’y avait pas de grandes quantités de nécrose, même dans les centres, ce qui était d’une préoccupation initiale étant donné le système de culture stagnante (Figure 2A). Ces organoïdes ont démontré une morphologie histologique semblable au cortex humain basée sur l’évaluation microscopique légère par un neuropathologiste expérimenté (Figure 2B). Par histologie, de nombreuses morphologies cellulaires uniques ont été observées ressemblant à des glies (tête de flèche bleue), des neurones (tête de flèche rouge), des cellules avec la morphologie cajal-Retzius (flèches noires), et neuropil (tête de flèche orange) (Figure 2B,C).
Pour examiner plus en profondeur l’expression des gènes dans les cellules, qRT-PCR a été réalisé. Pour les résultats indiqués à la figure 3, chaque barre représente 3 lots distincts de cellules cultivées indépendamment et récoltées au moment spécifié. Ces échantillons ont ensuite été exécutés en tripleavec une paire d’apprêt au gène indiqué en plus du gène d’entretien ménager, GAPDH. Le transporteur de glutamate, Vglut1 (figure 3A), a été exprimé à 2,5 semaines, a augmenté à 5 semaines, et est resté cohérent pendant 5 mois dans la culture. Un marqueur de cerveau avant, Foxg1 (figure 3B), a été exprimé à de bas niveaux jusqu’à 5 semaines dans la culture. Le marqueur de couche profonde, Tbr1 (Figure 3C), a culminé environ 5 semaines et a diminué par la suite, tandis que le marqueur de couche supérieure, Satb2 (Figure 3D), a augmenté au fil du temps.
L’expression du marqueur ventral Engrailed1 (Eng1) (Figure 3E), le marqueur de l’arrière-cerveau/moelle épinière Hoxb4 (figure 3F), ainsi que le marqueur oligodendrocyte, Olig2 (Figure 3G), ont tous augmenté au fil du temps. En revanche, le marqueur de cellules souches, Sox2 (figure 3H), a diminué au fil du temps. Le marqueur glial, FAP (Figure 3I), a culminé à 5 semaines et est resté relativement constant par la suite. En outre, les données d’immunofluorescence étaient compatibles avec les données de qRT-PCR. À 10 semaines, il y avait une expression robuste de Foxg1 (Figure 4A). L’expression Sox2 était plus limitée aux zones ressemblant à la zone sous-ventriculaire (ZVS) ( figure 4B,C). Fait intéressant, il y avait aussi une certaine expression du marqueur de cellules gliales radiale externe, HopX (Figure 4D).
Figure 1 : Aperçu des conditions de croissance et de la morphologie des organoïdes. (A) Schéma des changements médiatiques. (B-M) Images représentatives des organoïdes au fur et à mesure qu’ils mûrissent. (B-M) H9 hESCs (B) ont été utilisés pour former les organoïdes du cerveau. Organoïdes sur (C) jour 2 en 20 ng/mL bFGF médias, et (D) jour 3 et (E) jour 4 en 10 ng/mL bFGF médias. (F-M) Organoïdes dans les médias d’induction neurale (NIM) les jours 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K), et 70 (L,M). Les flèches pointent vers les rosettes neurales. Barre d’échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les organoïdes partageaient des similitudes histologiques avec les tissus cérébraux humains. Coloration des organoïdes à 5 mois (A) avec quelques couches ressemblant au cortex humain (B). Au grossissement plus élevé de nombreuses morphologies cellulaires ont été observées, y compris les cellules (tête de flèche bleue), les neurones (tête de flèche rouge), le neuropil (tête de flèche orange) et les cellules avec la morphologie de Cajal-Retzius (flèches noires) (B,C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Expression des gènes neurodéveloppementaux dans les organoïdes cérébraux au fil du temps. Données quantitatives RT-PCR utilisant SYBR vert évaluant l’expression de Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H), et GFAP (I). Barres d’erreur , moyenne , déviation standard (n '3). Ce chiffre a été modifié à partir de16. Voir le tableau 1 pour obtenir de l’information sur les amorces. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Expression des protéines neurodéveloppementales dans les organoïdes du cerveau à 10 semaines. L’immunofluorescence a révélé une expression robuste de Foxg1 (A), expression localisée de Sox2 (B,C) et la présence de HopX (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Gène | Séquence (5' à 3') | Amplicon | Exon | |
| En1 (en) | F | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA (CGCAGCA) |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT GGCTAGA GGCTAGA |
2 | ||
| Foxg1 Foxg1 | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGTTGAGGGACAGATTG TGGC (en) |
1 | ||
| GAPDH (EN) | F | ACCACAGTCCATGCCAT Acc |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT AGCC (en) |
9 | ||
| GFAP (en) | F | AGAGATCCGCACGCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-avr | ||
| Hoxb4 (hoxb4) | F | AAAGCACCCTCTGACTG AAAGCACCCTTGACTG CCAGATA (en) |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAAGATGA GGGAGA GGGAGA |
2 | ||
| Olig2 (Olig2) | F | CCCTGAGGCTTTCGGA Gcg |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTTGA GACGC GACGC |
2 | ||
| Satb2 (Satb2) | F | TAGCCAAAGAATGCCCT Cct |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 (En) | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTTCCCTCGT Ttt |
1 | ||
| Tbr1 Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA GTCACCGCCTACCAGAA Acc |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 (en) | F | CAGAGTTTTCGGCTTTG CTATTG (en) |
183 | 5-avr |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG Gtg |
6 |
Tableau 1 : Séquences d’apprêt utilisées pour le RT-PCR quantitatif à la figure 3.
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Discussion
Semblable à d’autres modèles organoïdes, il s’agit d’un système artificiel qui vient avec plusieurs mises en garde. Bien qu’il y ait eu peu de variation de lot à lot en termes de niveaux d’expression globaux, les organoïdes individuels ont montré des différences. Par exemple, l’emplacement des zones positives Sox-2 n’était pas identique dans tous les organoïdes (figure 3). Bien que qPCR soit approprié pour rechercher des changements globaux dans des lots de cellules, des techniques additionnelles telles que RNAseq à cellule unique seront employées dans les études futures pour rassembler plus d’information sur une base de cellule-par-cellule. Une autre limitation de ce système, c’est qu’il n’intègre pas la vascularisation dans les organoïdes comme cela a été fait dans certaines des études les plus récentes17,18,19. Cependant, la transition des HESC d’un environnement faible à élevé en oxygène peut ressembler plus étroitement à la transition anaérobie à la transition aérobie dans un embryon en développement.
Les étapes critiques de ce protocole sont la formation des neurosphères ainsi que l’entretien approprié, y compris les changements des médias avec les médias de culture appropriés pour assurer des cellules saines et des nutriments adéquats pour les organoïdes en croissance sans surpeuplement . Pour dépanner la prolifération cellulaire inadéquate ou la différenciation, nous recommandons de commencer par un nouveau lot de ESC à faible passage et des médias fraîchement préparés, y compris les suppléments. Parfois, il peut y avoir une variation par lots de réactifs et de matériaux. Ainsi, nous recommandons d’acheter plusieurs bouteilles de réactifs tels que N2 et flacons d’attachement ultra-bas qui sont du même lot tant qu’ils peuvent être utilisés dans un laps de temps raisonnable.
Contrairement à beaucoup d’autres protocoles organoïdes du cerveau, cette méthode n’utilise pas de bioréacteur; au lieu de cela les cellules restent relativement stagnantes en dehors des changements de médias. Ceci est similaire aux travaux précédents avec les neurosphères, qui ont finalement été brisés pour faire des cultures neuronales 2D20. Dans ce modèle, les cellules sont conservées dans un format 3D et peuvent pousser jusqu’à 6 mois en culture. Il a été constaté que lors de l’utilisation de petits groupes au lieu d’agréger les cellules simples que les organoïdes regardé plus lumineux, que nous avons interprété comme moins nécrotique. Comme précédemment rapporté, quand les faisceaux d’organoïdes de cerveau ont été évalués par histologie et immunofluorescence à 5 mois, il n’y avait aucune zones évidentes de nécrose16. Bien que le départ de petits groupes de cellules introduit un peu de variété dans la taille des organoïdes formés, la majorité des organoïdes étaient d’une taille à peu près similaire.
L’utilisation d’une matrice hétérologue de membrane de sous-sol et d’un bioréacteur ont des avantages et des inconvénients. Certains types de cellules, ou de plus grands organoïdes de cerveau pourraient préférer la croissance sous une condition ou une autre. Matrices de membrane de sous-sol ou d’autres hydrogels pourraient être bénéfiques pour ajouter sélectivement des facteurs de croissance à des régions particulières ou créer des moules spécifiques. Bien que les matrices de membrane de sous-sol aient été montrées pour soutenir l’organisation tridimensionnelle et la différenciation15,il est intéressant de souligner que certains de ces produits ont une composition mal définie et variable qui inclut des quantités de facteurs de croissance12. En plus de simplifier le flux de travail tout en crepandant les organoïdes du cerveau, l’absence d’une matrice de membrane de sous-sol pourrait également améliorer les techniques d’imagerie tridimensionnelle.
Le développement de ce système de modèle organoïde du cerveau offre une nouvelle approche pour de nombreuses applications potentielles. Par exemple, des insultes toxiques comme l’hypoxie, l’hyperglycémie, l’hypercapnie et l’infection, entre autres, peuvent être testées avec ce système. En outre, les désordres neurodéveloppementaux peuvent être étudiés avec ce système en commençant par les cellules souches génétiquement modifiées ou les cellules souches pluripotentes induites par l’homme spécifiques au patient (hPSCs). La possibilité d’ajouter différents types de cellules pendant la culture organoïde offre également la possibilité d’étudier les interactions tumeur-cerveau. Compte tenu de la simplicité du protocole et du manque de matériaux spécialisés coûteux, nous espérons que cette approche pourra être considérée par les laboratoires à l’intérieur et à l’extérieur du champ comme une méthode potentielle avec ses propres avantages uniques pour faire progresser cette approche rapidement. discipline progressive et passionnante.
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Disclosures
S.G.K. est membre de SAB pour Dansar IT et Gene-in-Cell.
Acknowledgments
Nous remercions le Yale Stem Cell Core (YSCC) et le Yale Cancer Center (YCC) pour leur aide. Nous remercions le Dr Jung Kim pour son examen de neuropathologie. Ce travail a été soutenu par Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, et NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), le Yale Cancer Center et le Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) et un généreux don sans restriction de Joseph et Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
