Summary
تم إنشاء هذا البروتوكول كوسيلة لإنتاج organoids الدماغ بطريقة مبسطة ومنخفضة التكلفة دون عوامل النمو الخارجية أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الحفاظ على تنوع أنواع خلايا الدماغ والعديد من ميزات التنظيم الخلوي.
Abstract
توفر أجهزة الدماغ المميزة عن الخلايا الجذعية الجنينية فرصة فريدة لدراسة التفاعلات المعقدة لأنواع الخلايا المتعددة في نظام ثلاثي الأبعاد. هنا نقدم طريقة واضحة نسبيا وغير مكلفة أن تسفر عن organoids الدماغ. في هذا البروتوكول يتم تقسيم الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات صغيرة بدلاً من الخلايا المفردة وتزرع في الوسائط الأساسية دون مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير المغايرة أو عوامل النمو الخارجية ، مما يسمح للإشارات التنموية الجوهرية لتشكيل نمو العضوي. هذا النظام البسيط ينتج مجموعة متنوعة من أنواع خلايا الدماغ بما في ذلك الخلايا الدبقية والدقيقة، والخلايا الجذعية، والخلايا العصبية من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ، والدماغ الخلفي. Organoids ولدت من هذا البروتوكول أيضا عرض السمات المميزة للتنظيم المناسب الزمانية والمكانية التي أظهرتها الصور brightfield ، الأنسجة ، الفلور المناعي والوقت الحقيقي الكمية عكس النسخ البوليميراز تفاعل سلسلة ( qRT-PCR). لأن هذه الاعضاء تحتوي على أنواع الخلايا من أجزاء مختلفة من الدماغ، ويمكن استخدامها لدراسة العديد من الأمراض. على سبيل المثال، في ورقة حديثة أظهرنا استخدام الأورجادات الاعضاء المتولدة من هذا البروتوكول لدراسة آثار نقص الأكسجة على الدماغ البشري. يمكن استخدام هذا النهج للتحقيق في مجموعة من الحالات التي يصعب دراستها مثل الإعاقات العصبية النمائية والاضطرابات الوراثية والأمراض العصبية.
Introduction
بسبب عدد لا يحصى من القيود العملية والأخلاقية، كان هناك قدر كبير من الصعوبة في دراسة الدماغ البشري. في حين أن الدراسات التي تستخدم القوارض كانت حاسمة لفهمنا للدماغ البشري ، فإن دماغ الفأر لديه العديد من أوجه الاختلاف1،2. ومن المثير للاهتمام أن الفئران لديها كثافة عصبية أقل بـ 7 مرات على الأقل من دماغ الرئيسيات3و4. على الرغم من أن الرئيسيات أقرب إلى البشر من القوارض من وجهة نظر تطورية ، إلا أنه ليس من العملي لمعظم الباحثين العمل معهم. وكان الغرض من هذا البروتوكول لتلخيص العديد من السمات الهامة للدماغ البشري باستخدام طريقة مبسطة وأقل تكلفة دون الحاجة إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير مغاير أو عوامل النمو الخارجية مع الحفاظ على تنوع خلايا الدماغ والتنظيم الخلوي.
استخدم العمل التكويني من مختبر Sasai الثقافة الحرة للخلايا الجنينية (SFEBq) لتوليد أنواع الخلايا العصبية ثنائية وثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)5،6. وقد اتبعت العديد من أساليب الأعضاء في الدماغ البشري مسارا مماثلا نسبيا من ESCs الإشارات7،8. في المقابل ، يبدأ هذا البروتوكول مع مجموعات من ESCs البشرية المنفصلة (hESCs) ، على غرار الخطوات الأولية للعمل المنوي لمختبرات طومسون وتشانغ قبل خطوات الطلاء9،10 وكذلك الخطوة الأولية لبروتوكول الجهاز في الدماغ من مختبر باسكا قبل إضافة عوامل النمو الخارجية11. وقد استخدمت مصفوفات غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، matrigel) في العديد من بروتوكولات الأجهزة الدماغية، وقد ثبت أن تكون سقالة فعالة8. ومع ذلك ، فإن مصفوفات غشاء الطابق السفلي الأكثر استخدامًا لا تأتي دون مضاعفات لأنها تشارك في تنقية كميات غير معروفة من عوامل النمو مع تقلب الدفعة أثناء الإنتاج12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه المصفوفات تعقيد التصوير ، وزيادة خطر التلوث والتكلفة.
في حين يمكن استخدام الأجهزة الاعضاء في الدماغ البشري للإجابة على العديد من الأسئلة، وهناك بعض القيود التي يجب أن تضع في اعتبارها. لأحد، بدءا من الخلايا الجذعية الجنينية، وorganoids تشبه بشكل وثيق العقول غير ناضجة من العقول القديمة وعلى هذا النحو قد لا تكون نماذج مثالية للأمراض التي تحدث في سن الشيخوخة، مثل مرض الزهايمر. ثانيا، في حين أن بروتوكولنا وجدت علامات من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ وتطور الدماغ الخلفي التي هي مفيدة لدراسة تأثير العلاج أو المرض على الخلايا من مناطق الدماغ متعددة في الحفل، يمكن اتباع بروتوكولات أخرى للتركيز على مناطق الدماغ محددة13،14. وأخيرا ، فإن هناك قيدا آخر من النماذج organoid هو أن من الحجم ، في حين أن متوسط طول الدماغ البشري ما يقرب من 167 ملم ، organoids الدماغ المصنوعة باستخدام التحريض تنمو تصل إلى 4 ملم8 وorganoids التي شكلتها هذا البروتوكول تنمو إلى 1-2 ملم من قبل 10 أسابيع. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول أداة هامة لدراسة أنسجة الدماغ البشري والتفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة الخلايا الجذعية
- الحفاظ على H9 hESCs على طبقة من عامل النمو انخفاض مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد، من الآن فصاعدا ببساطة يشار إليها باسم مصفوفة) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- لمعطف واحد لوحة 6-جيدا أو واحد طبق 10 سم، والجمع بين 100 ميكرولتر من المصفوفة مع 5.9 مل من الجليد الباردة دولبيكو في المتوسط النسر المعدلة (DMEM)/F12 وسائل الإعلام. التفاف لوحات في فيلم البارافين وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. استخدامها في اليوم التالي لتمرير الخلايا بعد أن يتم استنشاق المصفوفة الزائدة / وسائل الإعلام.
- ثقافة الخلايا من الأسبوع إلى الأسبوع بنسبة انقسام 1:12 تقريبًا كل 7 أيام. الحفاظ على الخلايا باستخدام الوسائط mTESR-1 في 37 درجة مئوية، حاضنة الأكسجين منخفضة (5٪ O2،5٪ CO2). تحديث الوسائط يوميًا. التّفزّزب الخلايا من الثقافة بين ممرات يستعمل زجاج أدوات.
- وينبغي أن تمر خلايا H9 قبل أربعة إلى ستة أيام من استخدامها لإنتاج organoids. وينبغي أن تكون الخلايا التي تم تمريرها في ما يقرب من 1:8 نسبة من مجموعات الخلايا. للقيام بذلك، تبدأ بشطف الخلايا مع وسائط DMEM F12 وفصلها الخلايا مع بروتياز محايدة (على سبيل المثال، dispase، يشار إليها من الآن فصاعدا ببساطة كما بروتياز)، شطف مع DMEM/F-12، ولوحة كما 30-60 مجموعات الخلية عبر 4 لوحات (6-جيدا أو 10 سم) في التقاء ~ 20٪. قبل يومين من الحصاد ، انتقل إلى حاضنة منتظمة (21٪ O2، 5٪ CO2). وينبغي أن تصل لوحات ~ 80٪ التقاء عند بدء تشكيل organoid.
2. تفكك hESCs للثقافة الأورجانية
- Aliquot حل الأسهم البروتياز (5 U / mL).
ملاحظة: نحن عادة تجميد أسفل 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام على مدى عدة أشهر. - تمييع محلول مخزون البروتياز إلى تركيز العمل عن طريق إضافة 1 مل من محلول المخزون بالإضافة إلى 5 مل من DMEM/F12 لكل صفيحة 6-well أو 10 سم من hESCs.
- استثير وإزالة وسائط ثقافة الخلية، ثم تغطية hESCs مع حل البروتياز. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 10-15 دقيقة أو حتى حواف المستعمرات الجولة والبدء في فصل من المصفوفة.
- إمالة لوحة، يستنشق حل البروتياز، وغسل بلطف الخلايا مع DMEM/F12 ثلاث مرات. استخدم 2 مل/جيد لكل غسلة عند استخدام لوحة 6-well و 6 مل عند استخدام لوحة 10 سم. تأكد من بقاء المستعمرات متصلة بالمصفوفة عند تنفيذ هذه الخطوة.
- إضافة مرة أخرى حوالي 1.5 مل من وسائل الإعلام mTESR الطازجة إلى كل بئر (أو 5 مل للوحة 10 سم) وطرد الخلايا قبالة لوحة باستخدام pipetting لطيف.
- باستخدام 10 مل ماصة، يستنشق بلطف والاستغناء عن hESC داخل لوحة حتى تصل إلى ما يقرب من 1/30th من حجمها الأصلي. يجب أن تشبه مجموعات المستعمرات ~ 250-350 ميكرومتر مربع ة الحجم عند الانتهاء من هذه الخطوات.
3. جيل من organoids
- نقل الخلايا إلى واحد جدا منخفضة المرفق T75 قارورة تحتوي على 30 مل من وسائل الإعلام mTESR دون عامل نمو الليفية الأساسية (bFGF).
- في اليوم التالي، إمالة قارورة (s) بحيث تجمع الخلايا الحية في الزاوية (وهذا قد يستغرق 5-10 دقيقة في اليوم الأول، ولكن سوف تحصل على أسرع كما تحصل على مجموعات أكبر).
ملاحظة: إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا التي انضمت إلى الجزء السفلي من القارورة في هذه الخطوة أو أي خطوات لاحقة، نقل الخلايا إلى قارورة جديدة. من الطبيعي أن يكون عدد الخلايا الميتة مرتفعًا خلال اليومين الأولين. عند إجراء تغييرات الوسائط، تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن من حطام الخلية. - وبمجرد أن تستقر الخلايا، تستنشق وسائل الإعلام والخلايا الميتة تاركة حوالي 10 مل من الوسائط التي تحتوي على الخلايا الحية.
- أضف ~ 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة (DMEM/F12 تكملها 1x N2, 1x B27, 1x L-الجلوتامين, 1x NEAA, 0.05% بوملين مصل البقر (BSA), و 0.1 m m monothioglycerol (MTG) تكملها مع 30 نانوغرام / مل bFGF).
- تحقق من الخلايا في اليوم 2. إذا كانت معظم الخلايا تبدو صحية ومشرقة، ليست هناك حاجة للقيام بأي شيء. ومع ذلك، إذا كان أكثر من ثلث الخلايا تظهر مظلمة، استبدال الوسائط (باستخدام نفس تقنية الميل كما هو الحال في الخطوة 3.2) مع ~ 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكملها 20 نانوغرام / مل bFGF.
- في اليوم 3، استبدال نصف وسائل الإعلام (باستخدام تقنية إمالة في الخطوة 3.2) مع 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكملها مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
- في اليوم 5، استبدل نصف المتوسط (باستخدام تقنية الإمالة في الخطوة 3.2) بـ 20 مل من الوسائط التعريفية العصبية (NIM: DMEM/F12، 1x N2 الملحق، 0.1 m MEM NEAA، 2 ميكروغرام/مل الهيبارين).
ملاحظة: إذا كان هناك أي مجموعات كبيرة من الخلايا أو organoids التي هي أكبر بكثير من الآخرين، يجب إزالتها من الثقافة. ويقدر حجم من قبل ظهور تحت المجهر; على سبيل المثال، باستخدام العدسة مع شبين. غالبية الاعضاء هي مماثلة الحجم (حوالي 100 ± 20 ميكرون). أزلنا الأجزاء الاعضاء التي كانت تقريبا 2x أصغر أو أكبر من غيرها. - استبدل نصف المتوسط (~ 15 مل) (باستخدام تقنية الإمالة) مع NIM كل يومين.
- بعد 3 أسابيع في الثقافة، إضافة 100x البنسلين/ ستريبتومسين إلى وسائل الإعلام (NIM: DMEM/F12، 1x N2 الملحق، 0.1 m M MEM NEAA، 2 ميكروغرام/مل الهيبارين) في تركيز نهائي من 1x إذا رغبت في ذلك. تحديث وسائل الإعلام كل يومين.
ملاحظة: بهذه الطريقة، حافظنا على organoids لمدة تصل إلى 6 أشهر في الثقافة.
4. استخراج الحمض النووي الريبي وإعداد
- استخراج بلطف ما يقرب من 15 organoids (اعتمادا على حجم) من قارورة باستخدام ماصة 10 مل ووضعها في أنبوب 1.5 مل.
- بيليه بلطف organoids في جهاز الطرد المركزي (200 × ز لمدة 1 دقيقة)، وشطف مع 1x دالبيكو في برنامج تلفزيوني (DPBS) ثلاث مرات.
- استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام نظام أو بروتوكول معتمد (على سبيل المثال، مجموعة RNeasy).
- قياس قيمة الكثافة البصرية لكل عينة في 260 و 280 نانومتر.
- إعداد cDNA باستخدام نظام أو بروتوكول تم التحقق من صحته (على سبيل المثال، مجموعة توليف iScript cDNA).
- قم بإجراء qRT-PCR باستخدام الكبريرز التي تم التحقق من صحتها مسبقًا(الجدول 1)بما في ذلك جين واحد على الأقل من جينات التدبير المنزلي.
5- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية
- تثبيت
- إعداد محلول بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ (PFA) ووضعه عند 4 درجات مئوية.
- باستخدام شفرة حلاقة معقمة، قطع تلميح قبالة ماصة نقل معقمة.
- استخراج الاعضاء بلطف باستخدام ماصة نقل قطع، كما أنها يمكن أن تكون مقسمة بسهولة، وخصوصا عندما تنمو كبيرة، ووضعها في لوحة 6-جيدا مع وسائل الإعلام إضافية أو DPBS.
- إمالة لوحة، يستنشق وسائل الإعلام، واستبدال مع 1x DPBS. شطف الخلايا مع 1x DPBS مرتين إضافية.
- استبدال DPBS مع 4٪ PFA الحل ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: في حين أننا ثابتة لمدة 2 أيام (للorganoids الصغيرة) إلى 7 أيام (للorganoids > 3 أشهر)، أوقات أقصر (على سبيل المثال، 16-24 ح) قد يكون من الممكن أيضا. - إعداد 30٪، 20٪ و 10٪ حلول السكروز في DPBS.
- بعد التثبيت في PFA، استبدال مع محلول السكروز 10٪ ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- استبدال السكروز 10٪ مع 20٪ السكروز ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- استبدال السكروز 20٪ مع 30٪ السكروز ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- المقاطع المجمدة
- إعداد طبقة مسطحة من الجليد الجاف ووضع قالب من البلاستيك المسمى على أعلى من ذلك.
- صب طبقة رقيقة من المتوسط درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) في القالب والسماح لها تبدأ في تصلب (في غضون ثوان قليلة).
- وضع عدد قليل من organoids على الجزء العلوي من أكتوبر في القالب باستخدام ماصة نقل مع تلميح قطع وإيلاء اهتمام وثيق لموقع organoids.
- إضافة ببطء في أكتوبر حتى القالب هو كامل ويتم تغطية organoids. السماح لها تصلب تماما لمدة 10 دقيقة إضافية.
ملاحظة: في حين أن تجميد أكثر من 10 دقيقة يساعد على ضمان الموضع النسبي المثالي للorganoids متعددة للقسم، فمن الممكن استخدام مزيج الجليد الجاف الإيثانول أو النيتروجين السائل لتجميد بسرعة أكبر. - وضع علامة على الموقع النسبي للorganoids مع علامة لجعله أسهل للعثور عليهم عند القطع.
- ضع القوالب في كيس أو صندوق واخزنها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لقطع المقاطع.
- باستخدام cryostat، شريحة 10 ميكرون المقاطع ووضع الأنسجة على المسمى، الشرائح المشحونة إيجابيا.
- تلطيخ
- إعداد حل الحجب (0.3٪ تريتون X-100، 4٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني).
- استخدام القلم باب مسعور لرسم حول محيط الأنسجة.
- شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع حل حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال محلول الحجب مع محلول الأجسام المضادة (الأجسام المضادة في التركيز المناسب، 0.1٪ تريتون X-100، 4٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، اغسل الشريحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- استبدال PBS مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (في التركيز المناسب) المخفف في محلول الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة مع 1x PBS.
- تطبيق 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وصمة عار وشطف ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع كل 1x PBS.
- الصق القسائم إلى الجزء الأمامي من الشرائح مع حل متصاعد، واسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وتخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 صور ًا تمثيلية لحقل مشرق لعدة نقاط زمنية لإظهار شكل الخلايا/الأجهزة الاعضاء في جميع مراحل البروتوكول المختلفة. تمت إزالة hESCs من لوحة زراعة الأنسجة ، وتقسيمها إلى قطع صغيرة ، ووضعها في قارورة مرفق منخفضة للغاية T75 حيث شكلت المجالات. من المهم ملاحظة أن الخلايا تبدو مشرقة ومتشابهة في الحجم ، دون خلايا مظلمة ومظلمة في مراكز هذه المجموعات. تم فلل الخلايا تدريجيا قبالة bFGF. في اليوم الخامس، تم وضعها في وسائل الإعلام التعريفي العصبية وبقيت في هذه الوسائط طوال فترة الثقافة. على الرغم من أن organoids الحصول على أكبر وبالتالي أكثر قتامة مع مرور الوقت، من المهم أن تأخذ علما الهياكل العصبية مثل الوردية (السهام السوداء) التي هي موجودة في جميع أنحاء تطور الجهاز في الدماغ وتوسيع. تشير الورود إلى بدء التمايز العصبي وتحتوي على ميزات الأنبوب العصبي الجنيني ، وعرض الخصائص الظهارية والمحيطة بتجويفأبي15.
تلطيخ organoids مع الهيماتوكسيلين وإيوسين في 5 أشهر في الثقافة وأشار إلى أنه لم يكن هناك كميات هائلة من نخر حتى في المراكز، والتي كانت مصدر قلق في البداية نظرا لنظام الثقافة الراكدة(الشكل 2A). أظهرت هذه الاعضاء مورفولوجيا هيسولوجية مشابهة لقشرة الإنسان على أساس التقييم المجهري الخفيف من قبل أخصائي أمراض عصبية من ذوي الخبرة(الشكل 2B). حسب الأنسجة، لوحظ تُلَحَلُم خلايا فريدة من نوعها تشبه الغليا (رأس السهم الأزرق)، الخلايا العصبية (رأس السهم الأحمر)، الخلايا مع Cajal-Retzius مورفولوجيا (الأسهم السوداء)، وneuropil (رأس السهم البرتقالي)(الشكل 2B، C).
لإلقاء نظرة أكثر تعمقا على التعبير الجيني داخل الخلايا، تم إجراء qRT-PCR. بالنسبة للنتائج الموضحة في الشكل 3، يمثل كل شريط 3 دفعات منفصلة من الخلايا التي تزرع بشكل مستقل ويتم حصادها في النقطة الزمنية المحددة. ثم تم تشغيل هذه العينات في ثلاثية مع زوج التمهيدي إلى الجين المشار إليه بالإضافة إلى الجين التدبير المنزلي، GAPDH. تم التعبير عن ناقل الغلوتامات ، Vglut1 (الشكل 3A)، في 2.5 أسابيع ، وزاد في 5 أسابيع ، وظل ثابتًا خلال 5 أشهر في الثقافة. علامة الدماغ الأمامي، Foxg1 (الشكل 3B)،وأعرب عن مستويات منخفضة حتى 5 أسابيع في الثقافة. علامة الطبقة العميقة ، Tbr1 (الشكل 3C)، بلغت ذروتها حوالي 5 أسابيع وانخفضت في وقت لاحق ، في حين أن علامة الطبقة العليا ، Satb2 (الشكل 3D)، زادت مع مرور الوقت.
التعبير عن علامة البطن ية Engrailed1 (Eng1)(الشكل 3E)، علامة الدماغ الخلفي / الحبل الشوكي Hoxb4 (الشكل 3F)، وكذلك علامة oligodendrocyte ، Olig2 (الشكل 3G)، زادت جميعها مع مرور الوقت. في المقابل ، فإن علامة الخلايا الجذعية ، Sox2 (الشكل 3H)، انخفضت مع مرور الوقت. علامة الدبقية ، FAP (الشكل 3I)، بلغت ذروتها في 5 أسابيع وظلت ثابتة نسبيا في وقت لاحق. وبالإضافة إلى ذلك، كانت بيانات الفلور المناعي متسقة مع بيانات qRT-PCR. في 10 أسابيع كان هناك تعبير قوي من Foxg1 (الشكل 4A). كان تعبير Sox2 أكثر حصرًا في المناطق التي تشبه المنطقة تحت البطينية (SVZ)(الشكل 4B, C). ومن المثير للاهتمام، كان هناك أيضا بعض التعبير عن علامة الخلية الدبقية الشعاعية الخارجية، HopX (الشكل 4D).
الشكل 1: نظرة عامة على ظروف النمو العضوي والمورفولوجيا. (أ)التخطيط للتغييرات الإعلامية. (B-M) صور تمثيلية للأعضاء الاعضاء كما نضجت. (ب-م) H9 hESCs(B)استخدمت لتشكيل organoids الدماغ. Organoids على (C) اليوم 2 في 20 نانوغرام / مل bFGF وسائل الإعلام، و (D)اليوم 3 و (E)اليوم 4 في 10 نانوغرام / مل bFGF وسائل الإعلام. (F-M) الأوروبويدات في وسائل الإعلام التعريفي العصبي (NIM) في الأيام 5(F)و 8(G)و 10(H)و 17(I)35(J, K)و 70(L, M). السهام تشير إلى الورود العصبية. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شاركت الأرغنأوجه النسيجية مع أنسجة الدماغ البشري. تلطيخ H & E من organoids في 5 أشهر(A)مع بعض الطبقات تشبه قشرة الإنسان(B). في التكبير العالي لوحظ تمورف الخلايا العديد من مورفولوجيا الخلايا بما في ذلك غليا (رأس السهم الأزرق)، والخلايا العصبية (رأس السهم الأحمر)، neuropil (رأس السهم البرتقالي)، والخلايا مع Cajal-Retzius مورفولوجيا (السهام السوداء)(B، C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعبير عن الجينات العصبية النمائية داخل الأعضاء في الدماغ مع مرور الوقت. بيانات RT-PCR الكمية باستخدام SYBR الخضراء تقييم التعبير عن Vglut1 (أ)، Foxg1 (B) ، Tbr1 (C) ، Satb2 (D) ، En1 (E) ، Hoxb4 (F) ، Olig2 (G) ، Sox2(H) ، وGFAP(I). أشرطة الخطأ = متوسط ± الانحراف المعياري (ن ≥ 3). وقد تم تعديل هذا الرقم من16. انظر الجدول 1 للحصول على معلومات التمهيدي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعبير عن البروتينات العصبية النمائية داخل الأجهزة الدماغية في 10 أسابيع. كشفت الفلورة المناعية عن تعبير قوي عن Foxg1(A)، والتعبير المترجمة عن Sox2(B، C)ووجود HopX(D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجينات | تسلسل (5'إلى 3') | أمبليكون | إكسون | |
| En1 | و | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT GGCTAGA |
2 | ||
| Foxg1 | و | أغاغااكاغاكاغ غاغا |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGGGACAGATTG TGGC |
1 | ||
| GAPDH | و | ACCACAGTCCATGCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGTGT مجلس التعاون الخليجي |
9 | ||
| GFAP | و | AGAGATCCGCACGCAGT ATG |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-أبريل | ||
| Hoxb4 | و | AAAGCACCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAAGATGA جيغاغا |
2 | ||
| Olig2 | و | CCCTGAGGCTTTCGGA جي جي جي |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTGTCTCTTGA GACGC |
2 | ||
| Satb2 | و | تاغازاغااتGCCCT اللجنه |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG TTG |
7 | ||
| سوكس2 | و | CCCAGCAGACTTCACAT جي تي |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTCCCTCGT TTT |
1 | ||
| Tbr1 | و | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG تيراغرام |
6 | ||
| Vglut1 | و | CAGAGTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-أبريل |
| R | GCGACTCCGTTCTAGG GTG |
6 |
الجدول 1: تسلسلات التمهيدي المستخدمة لـ RT-PCR الكمية في الشكل 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على غرار النماذج الاعضاء الأخرى، وهذا هو نظام اصطناعي الذي يأتي مع العديد من المحاذير. على الرغم من أنه كان هناك القليل دفعة إلى دفعة الاختلاف من حيث مستويات التعبير العام، organoids الفردية لم تظهر الاختلافات. على سبيل المثال ، لم يكن موقع المناطق الإيجابية Sox-2 متطابقًا في كل عضو(الشكل 3). في حين أن qPCR مناسب للبحث عن التغييرات الشاملة في دفعات من الخلايا ، سيتم استخدام تقنيات إضافية مثل RNAseq الخلية الواحدة في الدراسات المستقبلية لجمع المزيد من المعلومات على أساس كل خلية على حدة. قيود أخرى لهذا النظام، هو أنه لا يدمج الأوعية الدموية داخل organoids كما تم القيام به في بعض الدراسات الأكثر حداثة17،18،19. ومع ذلك، فإن نقل hESCs من بيئة منخفضة إلى عالية الأكسجين قد يشبه بشكل أكبر الانتقال اللاهوائي إلى الانتقال الهوائي في الجنين النامي.
الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي تشكيل الخلايا العصبية وكذلك الصيانة المناسبة بما في ذلك التغييرات الإعلامية مع وسائل الإعلام الثقافة المناسبة لضمان الخلايا السليمة والمواد المغذية الكافية للorganoids المتنامية دون اكتظاظ . لاستكشاف عدم كفاية انتشار الخلايا أو التمايز، نوصي بدءا من دفعة جديدة من ESCs مرور منخفض والوسائط المعدة حديثا بما في ذلك المكملات الغذائية. في بعض الأحيان يمكن أن يكون هناك اختلاف دفعة من الكواشف والمواد. وبالتالي، نوصي بشراء زجاجات متعددة من الكواشف مثل N2 وقوارير مرفق منخفضة للغاية والتي هي من نفس الكثير طالما أنها يمكن استخدامها في فترة معقولة من الزمن.
على عكس العديد من بروتوكولات الأعضاء الأخرى في الدماغ ، لا تستخدم هذه الطريقة مفاعلًا حيويًا . بدلا من ذلك الخلايا تبقى راكدة نسبيا جانبا من التغييرات وسائل الإعلام. هذا يشبه العمل السابق مع علم الأعصاب ، والتي تم تقسيمها في نهاية المطاف لجعل الثقافات العصبية 2D20. في هذا النموذج يتم الاحتفاظ الخلايا في شكل 3D ويسمح لتنمو لمدة تصل إلى 6 أشهر في الثقافة. ووجد أنه عند استخدام مجموعات صغيرة بدلا من تجميع الخلايا المفردة التي بدت organoids أكثر إشراقا، والتي فسرناها على أنها أقل نخرية. كما ذكر سابقا ، عندما تم تقييم مجموعات الأعضاء في الدماغ من قبل الأنسجة والفلور المناعي في 5 أشهر ، لم تكن هناك مناطق واضحة من النخر16. على الرغم من أن البدء من مجموعات صغيرة من الخلايا يدخل مجموعة متنوعة قليلا في حجم organoids شكلت، وكانت غالبية organoids من حجم مماثل تقريبا.
استخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير مغاير ومفاعل حيوي على حد سواء مزايا وعيوب. قد تفضل أنواع معينة من الخلايا، أو أجهزة الخلايا الأكبر في الدماغ النمو في حالة أو أخرى. قد تكون مصفوفات غشاء الطابق السفلي أو الهيدروجيلات الأخرى مفيدة لإضافة عوامل النمو بشكل انتقائي إلى مناطق معينة أو إنشاء قوالب محددة. على الرغم من أن المصفوفات غشاء الطابق السفلي قد ثبت لدعم التنظيم ثلاثي الأبعاد والتمايز15، تجدر الإشارة إلى أن بعض هذه المنتجات لديها تكوين غير محدد ومتغير يتضمن كميات من عوامل النمو12. بالإضافة إلى تبسيط سير العمل أثناء زراعة الأعضاء في الدماغ ، فإن عدم وجود مصفوفة غشاء الطابق السفلي قد يحسن أيضًا تقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد.
تطوير هذا النظام نموذج عضوي الدماغ يقدم نهجا جديدا للعديد من التطبيقات المحتملة. على سبيل المثال، يمكن اختبار الإهانات السامة مثل نقص الأكسجة، وفرط السكر في الدم، وفرط الكعف، والعدوى من بين أمور أخرى، مع هذا النظام. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة الاضطرابات العصبية النمائية مع هذا النظام من خلال البدء إما بالخلايا الجذعية المعدلة وراثياً أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها المريض البشري." كما توفر القدرة على إضافة أنواع مختلفة من الخلايا أثناء الاستزراع الأوروفياني إمكانية دراسة التفاعلات بين الورم والدماغ. ونظرا لبساطة البروتوكول وعدم وجود مكلفة ، والمواد المتخصصة ونأمل أن هذا النهج يمكن أن ينظر من قبل المختبرات داخل وخارج الميدان على حد سواء كطريقة محتملة واحدة مع فوائدفريدة من نوعها لمزيد من التقدم في هذا بسرعة تقدم والانضباط مثيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. هو عضو ساب لDansar تكنولوجيا المعلومات وجين في الخلية.
Acknowledgments
نشكر نواة الخلايا الجذعية في جامعة ييل (YSCC) ومركز ييل للسرطان (YCC) على المساعدة. نشكر الدكتور جونغ كيم على استعراضه لعلم الأمراض العصبية. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي في ولاية كونيتيكت، ومارس من الدايمات، وNHLBI R01HL131793 (S.G.K.)، ومركز ييل للسرطان وبرنامج ييل للتدريب على بيولوجيا السرطان NCI CA193200 (E.B.) وهدية سخية غير مقيدة من جوزيف و لوسيل مادري
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
