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Developmental Biology

Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60379

Summary

Dieses Protokoll wurde als Mittel zur Herstellung von Gehirnorganoiden in einer vereinfachten, kostengünstigen Weise ohne exogene Wachstumsfaktoren oder Kellermembranmatrix unter Beibehaltung der Vielfalt der Gehirnzelltypen und vieler Merkmale der zellulären Organisation erzeugt.

Abstract

Organoide des menschlichen Gehirns, die sich von embryonalen Stammzellen unterscheiden, bieten die einzigartige Möglichkeit, komplizierte Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen in einem dreidimensionalen System zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine relativ einfache und kostengünstige Methode, die Hirnorganoide ergibt. In diesem Protokoll werden menschliche pluripotente Stammzellen in kleine Cluster anstelle von Einzelzellen aufgebrochen und in Basismedien ohne heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren angebaut, so dass die intrinsischen Entwicklungshinweise die Organoidwachstum. Dieses einfache System produziert eine Vielzahl von Gehirnzelltypen, einschließlich Glia- und Mikrogliazellen, Stammzellen und Neuronen des Vorderhirns, des Mittelhirns und des Hinterhirns. Organoide, die aus diesem Protokoll generiert werden, zeigen auch Merkmale einer angemessenen zeitlichen und räumlichen Organisation, die durch Hellfeldbilder, Histologie, Immunfluoreszenz und quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit demonstriert wird ( qRT-PCR). Da diese Organoide Zelltypen aus verschiedenen Teilen des Gehirns enthalten, können sie für das Studium einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel haben wir in einem kürzlich erschienenen Papier die Verwendung von Organoiden demonstriert, die aus diesem Protokoll für die Untersuchung der Auswirkungen von Hypoxie auf das menschliche Gehirn generiert wurden. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um eine Reihe von ansonsten schwer zu untersuchenden Bedingungen wie neuroentwicklungsbedingten Handicaps, genetischestörungen und neurologischen Erkrankungen zu untersuchen.

Introduction

Aufgrund unzähliger praktischer und ethischer Einschränkungen gab es große Schwierigkeiten, das menschliche Gehirn zu studieren. Während Studien mit Nagetieren waren entscheidend für unser Verständnis des menschlichen Gehirns, die Maus Gehirn hat viele Unterschiede1,2. Interessanterweise haben Mäuse eine neuronale Dichte, die mindestens 7 mal kleiner ist als das Primatenhirn3,4. Obwohl Primaten dem Menschen aus evolutionärer Sicht näher sind als Nagetiere, ist es für die meisten Forscher nicht praktikabel, mit ihnen zu arbeiten. Der Zweck dieses Protokolls war es, viele wichtige Merkmale des menschlichen Gehirns mit einer vereinfachten und kostengünstigeren Methode zu rekapitulieren, ohne dass eine heterologe Kellermembranmatrix oder exogene Wachstumsfaktoren erforderlich sind, während die Vielfalt der Gehirnzellen und die zelluläre Organisation erhalten bleiben.

Die formative Arbeit des Sasai-Labors verwendete die serumfreie Kultur der embryoiden Körper (SFEBq) Methode, um zwei- und dreidimensionale neuronale Zelltypen aus signalisierten embryonalen Stammzellen (ESCs) zu erzeugen5,6. Viele organoide Methoden des menschlichen Gehirns haben einen relativ ähnlichen Weg von signalisierten ESCs7,8verfolgt. Im Gegensatz dazu beginnt dieses Protokoll mit Clustern von abgetrennten menschlichen ESCs (hESCs), ähnlich den ersten Schritten der bahnbrechenden Arbeit der Laboratorien Thomson und Zhang vor den Beschichtungsschritten9,10 sowie dem ersten Schritt des Hirnorganoidprotokolls des Pasca-Labors vor der Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren11. Kellermembranmatrizen (z.B. Matrigel) wurden in vielen Organoidprotokollen des Gehirns verwendet und es hat sich als ein effektives Gerüst8gezeigt. Jedoch, am häufigsten verwendete Keller Membranmatrizen kommen nicht ohne Komplikationen, da sie mit unbekannten Mengen von Wachstumsfaktoren mit Charge zu Charge Variabilität während der Produktion12mitreinigen. Darüber hinaus können diese Matrizen die Bildgebung erschweren und das Risiko von Kontamination und Kosten erhöhen.

Während menschliche Gehirn-Organoide verwendet werden können, um viele Fragen zu beantworten, Gibt es gewisse Einschränkungen zu beachten. Zum einen ähneln Organoide, ausgehend von embryonalen Stammzellen, unreifen Gehirnen eher als gealterte Gehirne und sind daher möglicherweise keine idealen Modelle für Krankheiten, die im Alter auftreten, wie die Alzheimer-Krankheit. Zweitens, während unser Protokoll Marker der Vor-, Hirn- und Hinterhirnentwicklung gefunden hat, die nützlich sind, um die Wirkung einer Behandlung oder Krankheit auf Zellen aus mehreren Hirnregionen gemeinsam zu untersuchen, können andere Protokolle befolgt werden, um sich auf bestimmte Hirnregionen zu konzentrieren13,14. Schließlich ist eine weitere Einschränkung der Organoid-Modelle die der Größe, während die durchschnittliche Länge eines menschlichen Gehirns etwa 167 mm, Gehirn-Organoide mit der Verwendung von Agitation wachsen bis zu 4 mm8 und die Organoide durch dieses Protokoll gebildet wachsen bis 1-2 mm von 10 Wochen. Dennoch bietet dieses Protokoll ein wichtiges Werkzeug, um menschliches Gehirngewebe und die Interaktion mehrerer Zelltypen zu untersuchen.

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Protocol

1. Stammzellpflege

  1. Halten Sie H9-HESCs auf einer Schicht von Wachstumsfaktor reduziert Kellermembranmatrix (siehe die Tabelle der Materialien, von nun an einfach als Matrix bezeichnet) nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Um eine 6-Well-Platte oder eine 10-cm-Schale zu beschichten, kombinieren Sie 100 l Matrix mit 5,9 ml eiskaltem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12-Medium. Platten in Paraffinfolie wickeln und über Nacht bei 4 °C lagern. Verwenden Sie sie am nächsten Tag für Passaging-Zellen, nachdem die überschüssige Matrix/Medien angesaugt wurden.
  2. Kultur die Zellen Woche für Woche bei etwa einem 1:12 Split-Verhältnis alle 7 Tage. Pflegen Sie die Zellen mit mTESR-1-Medien in einem 37 °C, sauerstoffarmen Inkubator (5%O2, 5%CO2). Aktualisieren Sie Medien täglich. Das Ausweichen von Zellen aus der Kultur zwischen den Passagen mit Glaswerkzeugen.
  3. H9-Zellen sollten vier bis sechs Tage vor ihrer Verwendung zur Herstellung von Organoiden durchgepassaget werden. Die Zellen sollten bei einem Verhältnis von etwa 1:8 von Zellclustern durchgangen. Beginnen Sie dazu mit dem Spülen der Zellen mit DMEM F12-Medien und dissoziieren Sie die Zellen mit einer neutralen Protease (z.B. Dispase, fortan einfach als Protease bezeichnet), spülen Sie mit DMEM/F-12 und platten als 30-60 Zellcluster auf 4 Platten (6-well oder 10 cm) bei 20 % Koninfluenza. Zwei Tage vor der Ernte in einen regulären Inkubator (21%O2, 5% CO2) überführen. Die Platten sollten bei Beginn der Organoidbildung eine Konfluenz von 80 % erreichen.

2. Dissoziation der hESCs für Organoidkultur

  1. Aliquot die Protease-Lagerlösung (5 U/ml).
    HINWEIS: Normalerweise frieren wir 1 ml Aliquots bei -20 °C für den Einsatz über mehrere Monate ein.
  2. Verdünnen Sie die Protease-Stammlösung auf die Arbeitskonzentration, indem Sie 1 ml der Stammlösung plus 5 ml DMEM/F12 für jede 6-Well- oder 10-cm-Platte hESCs hinzufügen.
  3. Aspirieren und entfernen Sie Zellkulturmedien, und decken Sie dann die hESCs mit der Protease-Lösung ab. Legen Sie Platten in den Inkubator für 10-15 min oder bis die Ränder der Kolonien runden sich auf und beginnen, von der Matrix zu trennen.
  4. Neigen Sie die Platte, aspirieren Sie die Proteaselösung und waschen Sie die Zellen mit DMEM/F12 dreimal. Verwenden Sie 2 ml/gut für jede Wäsche, wenn Sie eine 6-Well-Platte und 6 ml bei Verwendung einer 10 cm Platte verwenden. Stellen Sie sicher, dass Kolonien bei der Ausführung dieses Schritts an der Matrix hängen bleiben.
  5. Fügen Sie ca. 1,5 ml frische mTESR-Medien zu jedem Brunnen (oder 5 ml für eine 10 cm Platte) zurück und spülen Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung von der Platte.
  6. Mit einer 10 ml Pipette vorsichtig aspirieren und geben hESC innerhalb der Platte, bis sie etwa 1/30tel ihrer ursprünglichen Größe erreichen. Kolonie-Cluster sollten am Ende dieser Schritte Quadrate in einer Größe von 250-350 m ähneln.

3. Erzeugung von Organoiden

  1. Übertragen Sie Zellen in einen einzigen ultra-niedrigen Aufsatz T75-Kolben mit 30 ml mTESR-Medien ohne grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
  2. Am nächsten Tag, kippen Sie den Kolben(n) so, dass die lebenden Zellen pool in der Ecke (dies kann 5-10 min am ersten Tag dauern, aber wird schneller, wenn die Cluster größer werden).
    HINWEIS: Wenn es eine große Anzahl von Zellen gibt, die in diesem Schritt oder nachfolgenden Schritten am Boden des Kolbens kleben haben, übertragen Sie die Zellen in einen neuen Kolben. Es ist normal, eine hohe Population von abgestorbenen Zellen für die ersten zwei Tage zu haben. Achten Sie bei der Durchführung von Medienänderungen darauf, so viel wie möglich von zellgebundenen Ablagerungen zu entfernen.
  3. Sobald sich die Zellen absetzen, aspirieren Sie die Medien und abgestorbene Zellen und hinterlassen etwa 10 ml Medien, die die lebenden Zellen enthalten.
  4. Fügen Sie 20 ml niedrige bFGF-Medien hinzu (DMEM/F12 ergänzt durch 1x S2, 1x B27, 1x L-Glutamin, 1x NEAA, 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM Monothioglycerol (MTG) ergänzt mit 30 ng/mL bFGF).
  5. Überprüfen Sie die Zellen am 2. Tag. Wenn die meisten Zellen gesund und hell aussehen, gibt es keine Notwendigkeit, etwas zu tun. Wenn jedoch mehr als ein Drittel der Zellen dunkel erscheinen, ersetzen Sie die Medien (mit der gleichen Kipptechnik wie in Schritt 3.2) durch 20 ml niedrige bFGF-Medien, die mit 20 ng/ml bFGF ergänzt werden.
  6. Ersetzen Sie am 3. Tag die Hälfte der Medien (mit der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 ml niedrige bFGF-Medien, ergänzt durch 10 ng/mL bFGF.
  7. Ersetzen Sie an Tag 5 die Hälfte des Mediums (mit der Kipptechnik in Schritt 3.2) durch 20 ml neuronale Induktionsmedien (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Ergänzung, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml Heparin).
    HINWEIS: Wenn es große Cluster von Zellen oder Organoiden gibt, die viel größer als die anderen sind, sollten sie aus der Kultur entfernt werden. Die Größe wird durch das Aussehen unter dem Mikroskop geschätzt; z. B. mit einem Okular mit Absehen. Die meisten Organoide sind ähnlich groß (ca. 100 x 20 m). Wir entfernten Organoide, die etwa 2x kleiner oder größer als die anderen waren.
  8. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums (ca. 15 ml) (mit der Kipptechnik) jeden zweiten Tag durch NIM.
  9. Nach 3 Wochen Kultur 100x Penicillin/Streptomycin in die Medien geben (NIM: DMEM/F12, 1x N2-Ergänzung, 0,1 mM MEM NEAA, 2 g/ml Heparin) bei einer Endkonzentration von 1x, falls gewünscht. Aktualisieren Sie die Medien jeden zweiten Tag.
    HINWEIS: Auf diese Weise haben wir die Organoide für bis zu 6 Monate in der Kultur gepflegt.

4. RNA-Extraktion und -Extraktion

  1. Mit einer 10 ml Pipette ca. 15 Organoide (je nach Größe) vorsichtig aus dem Kolben extrahieren und in ein 1,5 ml-Rohr geben.
    1. Die Organoide in der Zentrifuge (200 x g für 1 min) sanft pellet und dreimal mit 1x Dulbeccos PBS (DPBS) abspülen.
  2. Extrahieren Sie RNA mit validiertem System oder Protokoll (z. B. RNeasy Kit).
  3. Messen Sie den optischen Dichtewert jeder Probe bei 260 und 280 nm.
  4. Bereiten Sie cDNA mit einem validierten System oder Protokoll (z. B. iScript cDNA Synthesis Kit) vor.
  5. Führen Sie qRT-PCR mit vorvalidierten Primern (Tabelle 1) einschließlich mindestens einem Housekeeping-Gen durch.

5. Immunhistochemie

  1. Fixierung
    1. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehydlösung (PFA) vor und legen Sie sie auf 4 °C.
    2. Schneiden Sie mit einem sterilen Rasiermesser die Spitze einer sterilen Transferpipette ab.
    3. Extrahieren Sie mit der geschnittenen Transferpipette schonsanft Organoide, da sie leicht auseinandergebrochen werden können, besonders wenn sie groß werden, und legen Sie sie in eine 6-Well-Platte mit zusätzlichen Medien oder DPBS.
    4. Neigen Sie die Platte, aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch 1x DPBS. Spülen Sie die Zellen mit 1x DPBS zwei zusätzliche Male.
    5. Ersetzen Sie den DPBS durch 4% PFA-Lösung und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C.
      HINWEIS: Während wir für 2 Tage (für kleine Organoide) bis 7 Tage (für Organoide >3 Monate) festgelegt haben, können kürzere Zeiten (z. B. 16-24 h) auch möglich sein.
    6. Bereiten Sie 30%, 20% und 10% Saccharoselösungen in DPBS vor.
    7. Nach der Fixierung in PFA durch die 10%ige Saccharoselösung ersetzen und 24 h bei 4 °C auf einen Shaker legen.
    8. Ersetzen Sie die 10% Saccharose durch 20% Saccharose und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C für 24 h.
    9. Ersetzen Sie die 20% Saccharose durch 30% Saccharose und legen Sie auf einen Shaker bei 4 °C für 24 h.
  2. Gefrorene Abschnitte
    1. Bereiten Sie eine flache Schicht trockeneis vor und legen Sie eine beschriftete Kunststoffform darauf.
    2. Gießen Sie eine dünne Schicht optimalen Schnitttemperaturmedium (OCT) in die Form und lassen Sie es beginnen zu härten (innerhalb weniger Sekunden).
    3. Legen Sie ein paar Organoide auf der Oberseite des OCT in der Form mit einer Transferpipette mit der Spitze abgeschnitten und achten Sie genau auf die Lage der Organoide.
    4. Fügen Sie langsam in OCT, bis die Form voll ist und die Organoide bedeckt sind. Lassen Sie es für weitere 10 min vollständig aushärten.
      HINWEIS: Während das Einfrieren über 10 min hilft, eine ideale relative Platzierung mehrerer Organoide für die Schnitte zu gewährleisten, ist es möglich, einen Ethanol-Trockeneis-Mix oder flüssigen Stickstoff zu verwenden, um schneller einzufrieren.
    5. Markieren Sie die relative Position der Organoide mit einem Marker, um sie beim Schneiden leichter zu finden.
    6. Legen Sie die Formen in eine Tasche oder Box und lagern Sie bei -80 °C, bis sie bereit sind, die Abschnitte zu schneiden.
    7. Mit einem Kryostat 10 m Abschnitte schneiden und das Gewebe auf beschriftete, positiv geladene Dias legen.
  3. Färbung
    1. Bereiten Sie die Blockierlösung vor (0,3% Triton X-100, 4% normales Eselserum in PBS).
    2. Verwenden Sie einen hydrophoben Pap-Stift, um den Umfang des Gewebes zu zeichnen.
    3. Spülen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 min.
    4. PBS durch Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur ersetzen.
    5. Ersetzen Sie die Blockierlösung bei 4 °C über Nacht durch Eine Antikörperlösung (Antikörper in entsprechender Konzentration, 0,1% Triton X-100, 4% normales Eselsserum in PBS).
    6. Am nächsten Tag die Rutsche 3 mal mit PBS für jeweils 10 min waschen.
    7. PBS durch den entsprechenden Sekundärantikörper (in der entsprechenden Konzentration) ersetzen, der in Einer Antikörperlösung für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird.
    8. Spülen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal mit 1x PBS.
    9. Den 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck auftragen und dreimal für jeweils 10 min mit 1x PBS abspülen.
    10. Befestigen Sie die Abdeckungen an der Vorderseite der Dias mit Montagelösung, lassen Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen und lagern Sie im Dunkeln bei 4 °C.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt repräsentative Hellfeldbilder mehrerer Zeitpunkte, um zu zeigen, wie die Zellen/Organoide in den verschiedenen Stadien des Protokolls aussehen. Die hESCs wurden von der Gewebekulturplatte entfernt, in kleine Stücke zerlegt und in einen T75 Ultra-Low-Befestigungskolben gelegt, wo sie Kugeln bildeten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen hell und ähnlich aussehen, ohne dunkle, sterbende Zellen in den Zentren dieser Cluster. Die Zellen wurden nach und nach von bFGF entwöhnt. Am 5. Tag wurden sie in neuronale Induktionsmedien versetzt und blieben während der gesamten Kulturzeit in diesen Medien. Obwohl die Organoide im Laufe der Zeit größer und damit dunkler werden, ist es wichtig, die neuronalen Rosetten-ähnlichen Strukturen (schwarze Pfeile) zur Kenntnis zu nehmen, die während der gesamten Organoidentwicklung des Gehirns vorhanden sind und sich ausdehnen. Die Rosetten weisen auf die Einleitung der neuronalen Differenzierung hin und enthalten Merkmale des embryonalen Neuralrohrs, das epitheliale Eigenschaften aufweist und ein apikales Lumen15umgibt.

Die Färbung der Organoide mit Hämatoxylin und Eosin bei 5 Monaten in der Kultur zeigte, dass es nicht große Mengen an Nekrose auch in den Zentren, die von anfänglicher Bedeutung angesichts der stagnierenden Kultursystem war (Abbildung 2A). Diese Organoide zeigten eine histologische Morphologie ähnlich dem menschlichen Kortex basierend auf einer lichtmikroskopischen Auswertung durch einen erfahrenen Neuropathologen (Abbildung 2B). Durch die Histologie wurden viele einzigartige Zellmorphologien beobachtet, die Glia (blauer Pfeilkopf), Neuronen (rote Pfeilspitze), Zellen mit Cajal-Retzius-Morphologie (schwarze Pfeile) und Neuropil (orange Pfeilkopf) ähneln (Abbildung 2B,C).

Um die Genexpression in den Zellen eingehender zu untersuchen, wurde qRT-PCR durchgeführt. Für die in Abbildung 3dargestellten Ergebnisse stellt jeder Balken 3 separate Chargen von Zellen dar, die unabhängig voneinander angebaut und zum angegebenen Zeitpunkt geerntet werden. Diese Proben wurden dann in Dreifacharbeit mit einem Primerpaar zum angegebenen Gen zusätzlich zum Housekeeping-Gen GAPDHausgeführt. Der Glutamattransporter Vglut1 (Abbildung 3A), wurde mit 2,5 Wochen ausgedrückt, erhöhte sich um 5 Wochen und blieb in der Kultur bis zu 5 Monate konstant. Ein Vorderhirnmarker, Foxg1 (Abbildung 3B), wurde auf niedrigem Niveau bis 5 Wochen in der Kultur ausgedrückt. Der Tiefschichtmarker Tbr1 (Abbildung 3C) erreichte einen Höchststand von etwa 5 Wochen und nahm anschließend ab, während der obere Schichtmarker Satb2 (Abbildung 3D) im Laufe der Zeit zunahm.

Die Expression des ventralen Markers Engrailed1 (Eng1) (Abbildung 3E), des Hinterhirns/Spinalmarkmarkers Hoxb4 (Abbildung 3F), sowie des Oligodendrozytenmarkers Olig2 (Abbildung 3G), alle im Laufe der Zeit erhöht. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Stammzellmarker Sox2 (Abbildung 3H), im Laufe der Zeit. Der Gliamarker FAP (Abbildung 3I) erreichte mit 5 Wochen seinen Höhepunkt und blieb anschließend relativ konstant. Darüber hinaus stimmten die Immunfluoreszenzdaten mit den qRT-PCR-Daten überein. Nach 10 Wochen gab es einen robusten Ausdruck von Foxg1 (Abbildung 4A). Der Sox2-Ausdruck beschränkte sich eher auf Bereiche, die der subventrikulären Zone (SVZ) ähnelten (Abbildung 4B,C). Interessanterweise gab es auch einen Ausdruck des äußeren radialen Gliazellmarkers HopX (Abbildung 4D).

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über die organoiden Wachstumsbedingungen und die Morphologie. (A) Schematic der Medienänderungen. (B-M) Repräsentative Bilder von Organoiden, wie sie gereift sind. (B-M) H9-HESCs (B) wurden zur Bildung der Hirnorganoide verwendet. Organoide am (C) Tag 2 in 20 ng/mL bFGF Medien und (D) Tag 3 und (E) Tag 4 in 10 ng/mL bFGF Medien. (F-M) Organoide in neuronalen Induktionsmedien (NIM) an den Tagen 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K) und 70 (L,M). Pfeile zeigen auf neuronale Rosetten. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Organoide teilten histologische Ähnlichkeiten mit menschlichem Hirngewebe. H&E Färbung der Organoide bei 5 Monaten (A) mit einigen Schichtungen, die dem menschlichen Kortex ähneln (B). Bei höherer Vergrößerung wurden viele Zellmorphologien beobachtet, darunter Glia (blauer Pfeilkopf), Neuronen (roter Pfeilkopf), Neuropil (orange Pfeilkopf) und Zellen mit Cajal-Retzius Morphologie (schwarze Pfeile) (B,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Expression neuroentwicklungsförmiger Gene innerhalb der Hirnorganoide im Laufe der Zeit. Quantitative RT-PCR-Daten mit SYBR grün zur Auswertung der Expression von Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) und GFAP (I). Fehlerbalken = Mittelwert bei Standardabweichung (n x 3). Diese Zahl wurde von16geändert. Siehe Tabelle 1 für Primerinformationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Expression neuroentwicklungsischer Proteine innerhalb der Hirnorganoide nach 10 Wochen. Die Immunfluoreszenz zeigte eine robuste Expression von Foxg1 (A), lokalisierte Expression von Sox2 (B,C) und das Vorhandensein von HopX (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gen Sequenz (5' bis 3') Amplicon Exon
En1 F GGACAATGACGTTGAAA
CGCAGCA
149 2
R AAGGTCGTAAGCGGTTT
GGCTAGA
2
Foxg1 F AGAAGAACGGCAAGTAC
Gaga
188 1
R TGTTGAGGGACAGATTG
TGGC
1
GAPDH F ACCACAGTCCATGCCAT
Cac
449 8
R CACCACCCTGTTGCTGT
Agcc
9
GFAP F AGAGATCCGCACGCAGT
Atg
80 4
R TCTGCAAACTTGGAGCG
Gta
5-Apr
Hoxb4 F AAAGCACCCTCTGACTG
CCAGATA
80 2
R ATGGGCACGAAAGATGA
GGGAGA
2
Olig2 F CCCTGAGGCTTTTCGGA
Gcg
451 1
R GCGGCTGTTGATCTTGA
GACGC
2
Satb2 F TAGCCAAAGAATGCCCT
Ctc
94 6
R AAACTCCTGGCACTTGG
Ttg
7
Sox2 F CCCAGCAGACTTCACAT
Gt
150 1
R CCTCCCATTTCCCTCGT
Ttt
1
Tbr1 F GTCACCGCCTACCAGAA
Cac
101 4
R ACAGCCGGTGTAGATCG
Sf
6
Vglut1 F CAGAGTTTTTTGGCTTTG
CTATTG
183 5-Apr
R GCGACTCCGTTCTAAGG
GTG
6

Tabelle 1: Primersequenzen für quantitative RT-PCR in Abbildung 3.

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Discussion

Ähnlich wie bei anderen Organoidmodellen ist dies ein künstliches System, das mit mehreren Einschränkungen einhergeht. Obwohl es in Bezug auf die Gesamtexpressionsniveaus nur geringe Batch-zu-Batch-Variationen gab, zeigten einzelne Organoide Unterschiede. Beispielsweise war die Position der Sox-2-positiven Bereiche nicht in jedem Organoid identisch (Abbildung 3). Während qPCR geeignet ist, nach allgemeinen Veränderungen in Zellchargen zu suchen, werden zusätzliche Techniken wie single cell RNAseq in zukünftigen Studien verwendet, um mehr Informationen auf Zell-für-Zelle-Basis zu sammeln. Eine weitere Einschränkung dieses Systems ist, dass es nicht vaskulatur innerhalb der Organoide integriert, wie in einigen der neueren Studien17,18,19getan wurde. Der Übergang der hESCs von einer Umgebung mit niedrigem bis zu hohem Sauerstoffgehalt kann jedoch eher dem anaeroben zu dem aeroben Übergang in einem sich entwickelnden Embryo ähneln.

Die entscheidenden Schritte innerhalb dieses Protokolls sind die Bildung der Neurosphären sowie die entsprechende Wartung einschließlich Medienveränderungen mit den richtigen Kulturmedien, um gesunde Zellen und ausreichende Nährstoffe für die wachsenden Organoide ohne Überbelegung zu gewährleisten. . Um eine unzureichende Zellproliferation oder Differenzierung zu beheben, empfehlen wir, mit einer neuen Charge von LOW-Passage-ESCs und frisch zubereiteten Medien einschließlich Ergänzungen zu beginnen. Gelegentlich kann es zu Chargenvariationen von Reagenzien und Materialien kommen. Daher empfehlen wir den Kauf mehrerer Flaschen Reagenzien wie N2 und ultra-niedrige Befestigungskolben, die aus dem gleichen Los sind, solange sie in einer angemessenen Menge von Zeit verwendet werden können.

Im Gegensatz zu vielen anderen Organoidprotokollen des Gehirns verwendet diese Methode keinen Bioreaktor; Stattdessen bleiben die Zellen neben Medienwechseln relativ stagnierend. Dies ist ähnlich wie frühere Arbeiten mit Neurosphären, die schließlich auseinander gebrochen wurden, um 2D neuronale Kulturen20zu machen. In diesem Modell werden die Zellen in einem 3D-Format gehalten und dürfen bis zu 6 Monate in der Kultur wachsen. Es wurde festgestellt, dass bei der Verwendung von kleinen Clustern statt der Aggregation einzelner Zellen die Organoide heller aussahen, was wir als weniger nekrotisch interpretierten. Wie bereits berichtet, gab es keine offensichtlichen Nekrosis-Bereiche16. Obwohl ausgehend von kleinen Zellhaufen eine kleine Vielfalt in der Größe der gebildeten Organoide eingeführt wird, war die Mehrheit der Organoide ungefähr ähnlich groß.

Der Einsatz einer heterologen Kellermembranmatrix und eines Bioreaktors hat Vor- und Nachteile. Bestimmte Zelltypen, oder größere Gehirnorganoide könnten Wachstum unter der einen oder anderen Bedingung bevorzugen. Kellermembranmatrizen oder andere Hydrogele könnten vorteilhaft sein, um selektiv Wachstumsfaktoren zu bestimmten Regionen hinzuzufügen oder spezifische Formen zu erzeugen. Obwohl Kellermembranmatrizen nachweislich dreidimensionale Organisation und Differenzierung unterstützen15, ist es erwähnenswert, dass einige dieser Produkte eine schlecht definierte und variable Zusammensetzung haben, die Mengen von Wachstumsfaktoren12enthält. Neben der Vereinfachung des Arbeitsablaufs bei der Kultivierung der Hirnorganoide könnte das Fehlen einer Kellermembranmatrix auch dreidimensionale Bildgebungstechniken verbessern.

Die Entwicklung dieses Gehirnorganoid-Modellsystems bietet einen neuen Ansatz für viele potenzielle Anwendungen. Zum Beispiel, toxische Beleidigungen wie Hypoxie, Hyperglykämie, Hyperkapnie, und Infektion unter anderem, kann mit diesem System getestet werden. Darüber hinaus können neuroentwicklungsbedingte Störungen mit diesem System untersucht werden, indem entweder mit genetisch veränderten Stammzellen oder patientenspezifischen humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hPSCs) begonnen wird. Die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen während der organoiden Kultur hinzuzufügen, bietet auch die Möglichkeit, Tumor-Hirn-Wechselwirkungen zu studieren. Angesichts der Einfachheit des Protokolls und des Mangels an teuren Spezialmaterialien hoffen wir, dass dieser Ansatz von Laboratorien innerhalb und außerhalb des Feldes als eine mögliche Methode mit eigenen einzigartigen Vorteilen betrachtet werden kann, um dies rasch voranzutreiben. Fortschritt und spannende Disziplin.

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Disclosures

S.G.K. ist SAB-Mitglied für Dansar IT und Gene-in-Cell.

Acknowledgments

Wir danken dem Yale Stem Cell Core (YSCC) und dem Yale Cancer Center (YCC) für die Unterstützung. Wir danken Dr. Jung Kim für seine neuropathologische Rezension. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, und NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), dem Yale Cancer Center und dem Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) und einem großzügigen, uneingeschränkten Geschenk von Joseph und Lucille Madri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen
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Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

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