Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60379

Summary

Этот протокол был создан в качестве средства для производства органов мозга в упрощенной, низкой стоимости образом без экзогенных факторов роста или подвальной мембранной матрицы, сохраняя при этом разнообразие типов клеток мозга и многие особенности клеточной организации.

Abstract

Органоиды мозга человека, отличающиеся от эмбриональных стволовых клеток, дают уникальную возможность изучать сложные взаимодействия нескольких типов клеток в трехмерной системе. Здесь мы представляем относительно простой и недорогой метод, который дает органоиды мозга. В этом протоколе человека плюрипотентных стволовых клеток разбиваются на небольшие кластеры вместо одиночных клеток и выращиваются в основных средствах массовой информации без гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста, что позволяет внутреннее развитие сигналов для формирования рост органоида. Эта простая система производит разнообразие типов клеток мозга, включая глиальные и микроглиальные клетки, стволовые клетки и нейроны передового мозга, среднего мозга и заднего мозга. Органоиды, генерируемые в этом протоколе, также отображают признаки соответствующей временной и пространственной организации, продемонстрированной яркими изображениями поля, гистологией, иммунофлуоресценцией и в режиме реального времени количественной реверсивной транспрессионной цепной реакцией ( qRT-PCR). Поскольку эти органоиды содержат типы клеток из различных частей мозга, они могут быть использованы для изучения множества заболеваний. Например, в недавней работе мы продемонстрировали использование органоидов, полученных из этого протокола, для изучения влияния гипоксии на человеческий мозг. Этот подход может быть использован для изучения массива в противном случае трудно изучить условия, такие как нейроразвития гандикапы, генетические расстройства, и неврологические заболевания.

Introduction

Из-за множества практических и этических ограничений, было много трудностей в изучении человеческого мозга. Хотя исследования с использованием грызунов имеют решающее значение для нашего понимания человеческого мозга, мыши мозг имеет много различий1,2. Интересно, что мыши имеют плотность нейронов, что, по крайней мере в 7 раз меньше, чем приматов мозга3,4. Хотя приматы ближе к человеку, чем грызуны с эволюционной точки зрения, это не практично для большинства исследователей, чтобы работать с ними. Цель этого протокола состояла в том, чтобы резюмировать многие важные особенности человеческого мозга с помощью упрощенного и менее дорогостоящего метода без необходимости гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста при сохранении разнообразия клеток мозга и клеточной организации.

Формативная работа из лаборатории Сасай использовала сыворотку свободной культуры эмбриональных тел (SFEBq) метод для создания двух- и трехмерных нейронных типов клеток из сигнализированных эмбриональных стволовых клеток (ESCs)5,6. Многие органоидные методы мозга человека следовали относительно похожим путем от сигнализированных ESCs7,8. В отличие от этого, этот протокол начинается с кластеров отдельных человека ESCs (hESCs), похожие на начальные шаги семенной работы Лаборатории Томсона и Чжана до покрытия шаги9,10, а также начальный шаг мозга органоидпротокол лаборатории Паска до добавления экзогенных факторов роста11. Подвал мембраны матрицы (например, матригель) были использованы во многих мозг органоидных протоколов и было показано, что эффективный эшафот8. Однако, наиболее часто используемые мембранные матрицы подвала не приходят без усложнений по мере того как они co-purify с неизвестными количествами факторов роста с партией к изменчивости партии во время продукции12. Кроме того, эти матрицы могут осложнить визуализацию и увеличить риск загрязнения и стоимости.

Хотя человеческий мозг органоиды могут быть использованы для ответа на многие вопросы, Есть определенные ограничения, чтобы иметь в виду. С одной стороны, начиная с эмбриональных стволовых клеток, органоиды больше напоминают незрелые мозги, чем в возрасте мозга и как таковой не может быть идеальным и моделям для заболеваний, которые происходят в пожилом возрасте, как болезнь Альцгеймера. Во-вторых, в то время как наш протокол нашел маркеры развития головного мозга, среднего и заднего мозга, которые полезны для изучения влияния лечения или болезни на клетки из нескольких областей мозга в согласии, другие протоколы могут быть соблюдены, чтобы сосредоточиться на конкретных областях мозга13,14. Наконец, еще одним ограничением органоидных моделей является то, что размер, в то время как средняя длина человеческого мозга около 167 мм, мозг органоидов, сделанных с использованием агитации вырастают до 4 мм8 и органоиды, сформированные этим протоколом, вырастают до 1-2 мм на 10 недель. Тем не менее, этот протокол является важным инструментом для изучения тканей мозга человека и взаимодействия нескольких типов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Обслуживание стволовых клеток

  1. Поддерживать H9 hESCs на слое фактора роста снижение подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов, отныне просто называют матрицы) в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Чтобы покрыть одну 6-колодую тарелку или одну тарелку 10 см, смешайте 100 л матрицы с 5,9 мл модифицированной среды Eagle (DMEM)/F12. Оберните тарелки в парафина фильм и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия. Используйте их на следующий день для прохождения клеток после избыточной матрицы / медиа аспирируется.
  2. Культура клетки неделю к неделе примерно 1:12 сплит-коэффициент каждые 7 дней. Поддержание клеток с помощью mTESR-1 средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию, низкий кислород инкубатор (5% O2,5% CO2). Обновлять средства массовой информации ежедневно. Отсеял дифференивационные клетки от культуры между проходами с помощью стеклянных инструментов.
  3. Клетки H9 должны пройти за четыре-шесть дней до их использования для производства органоидов. Клетки должны быть проложено примерно при соотношении 1:8 клеточных кластеров. Для этого начните с промывки ячеек с помощью DMEM F12 media и разъедините клетки с нейтральной протеазой (например, диспаз, отныне именуемый просто протеазой), промыть DMEM/F-12, а также пластины как 30-60 клеточные кластеры через 4 пластины (6-ну или 10 см) при неприязни. За два дня до сбора урожая, переход их в обычный инкубатор (21% O2, 5% CO2). Плиты должны достигать 80% вспыхиваемости при начале органоидного образования.

2. Диссоциация hESCs для Органоидной культуры

  1. Aliquot решение запаса протеже (5 U/mL).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно замораживаем вниз 1 мл aliquots на -20 градусов по Цельсию для использования в течение нескольких месяцев.
  2. Разбавить раствор протеазы до рабочей концентрации, добавив 1 мл бульонного раствора плюс 5 мл DMEM/F12 для каждой 6-ну скважины или 10 см пластины гЭСК.
  3. Аспирируйте и удаляйте средства культуры клеток, а затем покрывайте hESCs раствором протеазы. Поместите пластины в инкубатор на 10-15 мин или до тех пор, пока края колоний округляются и начинают отделяться от матрицы.
  4. Наклоните пластину, аспирировать раствор протеазы, и осторожно промыть клетки с DMEM / F12 три раза. Используйте 2 мл/хорошо для каждой стирки при использовании 6-колодца пластины и 6 мл при использовании 10 см пластины. Убедитесь, что колонии остаются прикрепленными к матрице при выполнении этого шага.
  5. Добавьте обратно около 1,5 мл свежих mTESR-носителей к каждому колодцу (или 5 мл для тарелки 10 см) и смойте клетки с пластины с помощью нежного пипетки.
  6. Используя пипетку объемом 10 мл, аккуратно аспирировать и распределять hESC в пределах пластины, пока они не достигнут примерно 1/30тыс. от их первоначального размера. Кластеры колоний должны напоминать квадраты размером 250-350 мкм по завершении этих ступеней.

3. Поколение органоидов

  1. Передача клеток в одну ультра-низкую колбу T75, содержащую 30 мл мт mTESR-носителей без основного фактора роста фибробластов (bFGF).
  2. На следующий день наклоните колбу (ы) так, что живые клетки бассейн в углу (это может занять 5-10 минут в первый день, но будет получать быстрее, как кластеры получить больше).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть большое количество клеток, которые придерживались нижней части колбы на этом этапе или любых последующих шагах, перенесите клетки в новую колбу. Это нормально иметь высокую популяцию мертвых клеток в течение первых двух дней. При выполнении изменений мультимедиа, не забудьте удалить как можно больше мусора клетки, как это возможно.
  3. После того, как клетки оседают, аспирируются от средств массовой информации и мертвых клеток оставляя около 10 мл средств массовой информации, содержащей живые клетки.
  4. Добавьте 20 мл низкой bFGF-медиа (DMEM/F12 дополнен 1x N2, 1x B27, 1x L-глютамин, 1x NEAA, 0,05% бычьего сывороточная альбумин (BSA), и 0,1 мМ монотиоглицерола (MTG) дополнены 30 нг/мЛ bFGF).
  5. Проверьте клетки на 2-й день. Если большинство клеток выглядят здоровыми и яркими, нет необходимости ничего делать. Однако, если более трети ячеек кажутся темными, замените носители (используя ту же технику наклона, что и в шаге 3.2) на 20 мл низких средств массовой информации bFGF, дополненных 20 ng/mL bFGF.
  6. На 3-й день замените половину носителя (используя технику наклона в шаге 3.2) на 20 мл низкой bFGF-носителей, дополненных 10 ng/mL bFGF.
  7. На 5-й день замените половину среды (с использованием метода наклона в шаге 3.2) на 20 мл нервной индукции (NIM: DMEM/F12, 1x N2 добавка, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг/мл гепарина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть какие-либо большие кластеры клеток или органоидов, которые гораздо больше, чем другие, они должны быть удалены из культуры. Размер оценивается по внешнему виду под микроскопом; например, использование окуляра с ретиком. Большинство органоидов имеют аналогичное размера (примерно 100 и 20 мкм). Мы удалили органоиды, которые были примерно в 2 раза меньше или больше, чем другие.
  8. Замените половину среды (15 мл) (с использованием техники наклона) с НИМ через день.
  9. После 3 недель в культуре, добавить 100x пенициллина / стрептомицина в средствах массовой информации (NIM: DMEM/ F12, 1x N2 дополнения, 0,1 мМ MEM NEAA, 2 мкг /мл гепарина) в окончательной концентрации 1x при желании. Обновлять средства массовой информации через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, мы поддерживали органоиды на срок до 6 месяцев в культуре.

4. Извлечение рнки и подготовка

  1. Аккуратно извлеките около 15 органоидов (в зависимости от размера) из колбы с помощью 10 мл пипетки и поместите в трубку 1,5 мл.
    1. Аккуратно гранулы органоидов в центрифуге (200 х г в течение 1 мин), и промыть с 1x Dulbecco в PBS (DPBS) в три раза.
  2. Извлекайте РНК с помощью проверенной системы или протокола (например, комплект RNeasy).
  3. Измерьте значение оптической плотности каждого образца на уровне 260 и 280 нм.
  4. Подготовка кДНК с помощью проверенной системы или протокола (например, набор синтеза iScript cDNA).
  5. Выполните qRT-PCR с помощью предварительно проверенных грунтовщиков(Таблица 1),включая по крайней мере один ген ведения домашнего хозяйства.

5. Иммуногистохимия

  1. Фиксации
    1. Подготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его на 4 градуса Цельсия.
    2. Используя стерильную бритву, отрежьте кончик стерильной передачи пипетки.
    3. Аккуратно извлекайте органоиды с помощью срезаного трубопровода пипетки, так как они могут быть легко разбиты на части, особенно когда они становятся большими, и поместите их в 6-колодную пластину с дополнительными носителями или DPBS.
    4. Наклоните пластину, аспирируйте носители и замените 1x DPBS. Промыть клетки с 1x DPBS два дополнительных раза.
    5. Замените DPBS 4% раствором PFA и поместите на шейкер при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мы фиксируют в течение 2 дней (для малых органоидов) до 7 дней (для органоидов ,3 месяца), более короткие времена (например, 16-24 ч) также может быть возможным.
    6. Приготовьте 30%, 20% и 10% сахарозных растворов в DPBS.
    7. После фиксации в PFA, заменить 10% раствор сахарозы и место на шейкер на 4 КК в течение 24 ч.
    8. Замените 10% сахарозу 20% сахарозой и поместите на шейкер при 4 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
    9. Замените 20% сахарозу 30% сахарозой и поместите на шейкер при 4 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
  2. Замороженные секции
    1. Приготовьте плоский слой сухого льда и поместите на нее маркированную пластиковую форму.
    2. Налейте тонкий слой оптимальной температуры резки среды (OCT) в форму и дайте ему начать затвердевать (в течение нескольких секунд).
    3. Поместите несколько органоидов на верхней части OCT в форму с помощью передачи пипетки с наконечником отрезали и обратить пристальное внимание на расположение органоидов.
    4. Медленно добавляйте OCT до тех пор, пока плесень не будет полной и органоиды покрыты. Пусть он затвердеет полностью в течение дополнительных 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При замораживании более 10 мин помогает обеспечить идеальное относительное размещение нескольких органоидов для секции, можно использовать этанол сухой ледяной смеси или жидкого азота, чтобы заморозить быстрее.
    5. Отметьте относительное расположение органоидов маркером, чтобы было легче найти их при резке.
    6. Поместите формы в сумку или коробку и хранить при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока готовы сократить разделы.
    7. Используя криостат, нарежьте 10 мкм секций и поместите ткань на помеченные, положительно заряженные слайды.
  3. Окрашивания
    1. Приготовьте блокирующее решение (0,3% Triton X-100, 4% нормальная сыворотка осла в PBS).
    2. Используйте гидрофобную пап-ручку, чтобы нарисовать по периметру ткани.
    3. Промыть слайды с PBS 3 раза в течение 5 минут каждый.
    4. Замените PBS блокирующим раствором на 1 ч при комнатной температуре.
    5. Замените блокирующий раствор раствором антител (антитела при соответствующей концентрации, 0,1% Triton X-100, 4% нормальной сыворотки осла в PBS) на 4 градусов по Цельсию за одну ночь.
    6. На следующий день, мыть слайд 3 раза с PBS в течение 10 минут каждый.
    7. Замените PBS соответствующимвторичным антителом (при соответствующей концентрации), разбавленным в антител оменитель номиналу на 1 ч при комнатной температуре.
    8. Промыть 3 раза в течение 10 минут каждый раз с 1x PBS.
    9. Нанесите 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно и промыть три раза в течение 10 минут каждый с 1x PBS.
    10. Affix покрывает спереди горки монтажным раствором, высушивает при комнатной температуре в темноте и хранит в темноте при температуре 4 градусов цельсия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны репрезентативные яркие изображения нескольких точек времени, чтобы продемонстрировать, как выглядят клетки/органоиды на разных этапах протокола. HESCs были удалены из ткани культуры пластины, разбиты на мелкие кусочки, и помещены в T75 ультра-низкой колбы вложения, где они образуют сферы. Важно отметить, что клетки выглядят яркими и похожими по размеру, без темных, умирающих клеток в центрах этих скоплений. Клетки постепенно отудались от bFGF. На 5-й день, они были помещены в нервной индукции средств массовой информации, и они остались в этом средств массовой информации на протяжении всего периода культуры. Хотя органоиды становятся больше и, таким образом, темнее с течением времени, важно принять к сведению нервной розетки, как структуры (черные стрелки), которые присутствуют на протяжении всего развития органов мозга и расширить. Розетки указывают на начало нервной дифференциации и содержат особенности эмбриональной нервной трубки, отображая эпителиальные характеристики и окружающие апикальный люмен15.

Окрашивание органоидов гематоксилином и эозином на 5 месяцев в культуре показало, что не было огромного количества некроза даже в центрах, что было первоначальное беспокойство, учитывая застойную систему культуры (Рисунок 2A). Эти органоиды продемонстрировали гистологическую морфологию, похожую на кору человека на основе свето-микроскопической оценки опытного невропатолога(рисунок 2B). По гистологии, многие уникальные морфологии клеток были замечены напоминающие глии (голубая стрелка головы), нейроны (красная стрелка), клетки с морфологией Cajal-Retzius (черные стрелки), и нейропил (оранжевая стрелка головы) (Рисунок 2B, C).

Чтобы более подробно рассмотреть экспрессию генов в клетках, был выполнен qRT-PCR. Для результатов, показанных на рисунке 3,каждый бар представляет 3 отдельные партии клеток, выращенных самостоятельно и собранных в указанный момент времени. Эти образцы были затем запустить в тройной с грунтовой пары указанного гена в дополнение к гену домашнего хозяйства, GAPDH. Глутамат транспортер, Vglut1 (Рисунок 3A), был выражен на 2,5 недели, увеличилось на 5 недель, и оставался последовательным в течение 5 месяцев в культуре. Маркер переднего мозга, Foxg1 (Рисунок 3B), был выражен на низких уровнях до 5 недель в культуре. Глубокий слой маркера, Tbr1 (Рисунок 3C), достиг пика около 5 недель и снизился впоследствии, в то время как верхний слой маркера, Satb2 (Рисунок 3D), увеличилось с течением времени.

Выражение брюшной маркер Engrailed1 (Eng1) (Рисунок 3E), задний мозг / спинной маркер мозга Hoxb4 (Рисунок 3F), а также олигодендроцит маркер, Olig2 (Рисунок 3G), все увеличилось с течением времени. В отличие от этого, маркер стволовых клеток, Sox2 (Рисунок 3H), уменьшилась с течением времени. Глиальный маркер, FAP (Рисунок 3I), достиг пика в 5 недель и оставался относительно постоянным впоследствии. Кроме того, данные иммунофлуоресценции согласуются с данными qRT-PCR. На 10 недель было надежное выражение Foxg1 (Рисунок 4A). Выражение Sox2 было более ограничено областями, напоминающими субвентрикулярную зону (СВЗ)(рисунок 4B, C). Интересно, что было также некоторое выражение внешнего радиального глиального маркера ячейки, HopX (Рисунок 4D).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор условий роста органоидов и морфологии. (A) Схема изменений средств массовой информации. (B-M) Репрезентативные образы органоидов по мере их созревания. (B-M) H9 hESCs(B) были использованы для формирования органов мозга. Органоиды на (C) день 2 в 20 нг / мЛ bFGF средств массовой информации, и (D) день 3 и (E) день 4 в 10 нг / мЛ bFGF средств массовой информации. (F-M) Органоиды в нервной индукции средств (НИМ) в дни 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35(J, K), и 70 (L, M). Стрелки указывают на нейронные розетки. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Органоиды разделяют гистологическое сходство с тканью мозга человека. Н И E окрашивания органоидов на 5 месяцев (A) с некоторыми слоями, напоминающими коры человека(B). При более высоком увеличении наблюдалось много клеточных морфологий, включая глию (синяя стрелка), нейроны (красная стрелка), нейропил (оранжевая стрелка головы) и клетки с морфологией Cajal-Retzius (черные стрелки) (B, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Выражение нейронных генов в органах мозга с течением времени. Количественные данные RT-PCR с использованием SYBR зеленый оценки выражения Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C, Satb2 (D, En1 (E, Hoxb4 (F, Olig2 (G), Sox2 (H, и GFAP (I). Бары ошибок - среднее стандартное отклонение (n No 3). Эта цифра была изменена с16. Смотрите таблицу 1 для получения информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Выражение белков нейроразвития в органах мозга на 10 недель. Иммунофлуоресценция выявила надежное выражение Foxg1 (A), локализованное выражение Sox2 (B, C) и наличие HopX (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Ген Последовательность (5' к 3') Ампликон Эксон
En1 F GGACAATGACGTGAAA
CGCAGCA
149 2
R AAGGTCGTAAGCGGTTTT
ГКЦТАГА
2
Foxg1 F АГААГАКГКААГТАК
Gaga
188 1
R TGTTGAGGGACAGATTG
TGGC
1
GAPDH F АККАКАГТККАТККАТ
Cac
449 8
R КАККАККТГТГТГТГТГГТГТГТГТ
АГКК
9
GFAP F АГАГАЦКККККЧАГГГГГТ
Atg
80 4
R TCTGCAAACTTGGAGCG
Gta
5-апрель
Hoxb4 F АААГКАКЦКТКТГКТККГКТКГКТГ
КАГАТА
80 2
R АТГгКакАААГАТА
ГГГАГА
2
Олиг2 F CCCTGAGGCTTTCGGA
Gcg
451 1
R GCGGCTGTGATCTTTGA
GACGC
2
Satb2 F TAGCCAAAGAATGCCCT
Ctc
94 6
R AAACTCCTGGCACTTGG
Ttg
7
Sox2 F CCCAGCAGACTTCACAT
Gt
150 1
R CCTCCCATTCCCTCGT
Ттт
1
Tbr1 F ГТКАККЧТАКАГАГАА
Cac
101 4
R ACAGCCGGTGTAGATCG
Tg
6
Vglut1 F КАГАГТТТЦКТТТГТТГ
CTATTG
183 5-апрель
R ГГАКТКТЦТЦТААГГ
GTG
6

Таблица 1: Секондсор последовательности, используемые для количественного RT-PCR на рисунке 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как и другие модели органоидов, это искусственная система, которая поставляется с несколькими оговорками. Хотя было мало партии партии изменения с точки зрения общего уровня выражения, отдельные органоиды действительно проявлять различия. Например, расположение положительных областей Sox-2 не было одинаковым в каждом органоидовом(рисунок 3). В то время как qPCR подходит для поиска общих изменений в партиях клеток, дополнительные методы, такие как одноклеточные РНК БУДУТ использованы в будущих исследованиях для сбора дополнительной информации о ячейке за клеткой основе. Еще одним ограничением этой системы, является то, что она не интегрирует сосуды в органоидов, как это было сделано в некоторых из последних исследований17,18,19. Однако переход hESCs от низкой к высокой кислородной среде может больше напоминать анаэробный к аэробному переходу в развивающемся эмбрионе.

Критическими шагами в рамках этого протокола являются формирование нейросфер, а также соответствующее обслуживание, включая изменения в средствах массовой информации с надлежащей культурой средств массовой информации для обеспечения здоровых клеток и адекватных питательных веществ для растущих органоидов без переполненности . Для устранения неполадок неадекватного пролиферации клеток или дифференциации, мы рекомендуем начать со свежей партии низких ESC прохода и свежеприготовленных средств массовой информации, включая добавки. Иногда могут быть пакетные вариации реагентов и материалов. Таким образом, мы рекомендуем приобрести несколько бутылок реагентов, таких как N2 и ультра-низких колб, которые из той же партии до тех пор, как они могут быть использованы в разумные сроки.

В отличие от многих других мозговых органоидных протоколов, этот метод не использует биореактор; вместо этого клетки остаются относительно застойными в стороне от изменений мультимедиа. Это похоже на предыдущую работу с нейросферами, которые в конечном итоге были разбиты, чтобы сделать 2D нейронных культур20. В этой модели клетки хранятся в 3D-формате и могут расти до 6 месяцев в культуре. Выяснилось, что при использовании небольших кластеров вместо агрегирования одиночных клеток органоиды выглядели ярче, что мы интерпретировали как менее некротические. Как сообщалось ранее, когда органоидные кластеры мозга оценивались по гистологии и иммунофлуоресценции в 5 месяцев, не было очевидных областей некроза16. Хотя, начиная с небольших скоплений клеток вводит небольшое разнообразие в размере органоидов формируется, большинство органоидов были примерно аналогичного размера.

Использование гетерологичной мембранной матрицы и биореактора имеет как преимущества, так и недостатки. Некоторые типы клеток, или большие органоиды мозга могут предпочесть рост при том или ином условии. Подвал мембраны матрицы или другие гидрогели может быть полезным для выборочно добавить факторы роста в конкретных регионах или создать конкретные формы. Хотя подвал мембраны матрицы были показаны для поддержки трехмерной организации и дифференциации15, стоит подчеркнуть, что некоторые из этих продуктов имеют плохо определенный и переменный состав, который включает в себя количество факторов роста12. В дополнение к упрощению рабочего процесса при культивирования органов мозга, отсутствие мембранной матрицы подвала может также улучшить трехмерные методы визуализации.

Развитие этой системы мозг органоидной модели предлагает новый подход для многих потенциальных приложений. Например, токсичные оскорбления, такие как гипоксия, гипергликемия, гиперкапния и инфекция среди других, могут быть проверены с помощью этой системы. Кроме того, нейроразвития расстройства могут быть изучены с этой системой, начиная либо с генетически модифицированных стволовых клеток или пациента конкретных человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (HPSCs). Способность добавлять различные типы клеток во время органоидной культуры также дает возможность изучать взаимодействия опухоли и мозга. Учитывая простоту протокола и отсутствие дорогостоящих специализированных материалов, мы надеемся, что этот подход может быть рассмотрен лабораториями как внутри, так и за пределами поля как один потенциальный метод со своими уникальными преимуществами для дальнейшего продвижения этого быстро прогрессирующей и захватывающей дисциплины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.G.K. является членом SAB для Dansar IT и Gene-in-Cell.

Acknowledgments

Мы благодарим ядро стволовых клеток йельского университета (YSCC) и онкологический центр (YCC) за помощь. Мы благодарим доктора Чжон Кима за его невропатологию обзора. Эта работа была поддержана Коннектикут регенеративной медицины научно-исследовательский фонд, марта Dimes, и NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), онкологический центр йельского и йельского онкологического биологии Учебная программа NCI CA193200 (E.B.) и щедрый неограниченный подарок от Джозефа и Люсиль Мадри.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA A11035
B27 Supplement Gibco, Waltham, MA, USA 17504-044
bFGF Life Technologies, Carlsbad, CA, USA PHG0263
BSA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647
BX43 microscope Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA D1306
Dispase STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 07913
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11330-032
DPBS Gibco, Waltham, MA, USA 10010023
FluroSave MilliporeSigma, Burlington, MA 345789
GFAP antibody NeuroMab, Davis, CA N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) Corning, Corning, NY, USA 356231
H9 hESCs WiCell, Madison, WI, USA WA09
Heparin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708880
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, Hercules, CA, USA 1708891
L-glutamine Gibco, Waltham, MA, USA 25030-081
Monothioglycerol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M6145
mTESR media STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada 85850
N2 NeuroPlex Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA 400-163
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ND-2000
NEAA Gibco, Waltham, MA, USA 11140-050
Normal Donkey Serum (NDS) ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 017-000-121
OCT Sakura Finetek, Torrance, CA, USA 25608-930
PFA Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA RT15710
qPCR machine Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA 1855196
RNeasy kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
Sox2 MilliporeSigma, Burlington, MA AB5603
TMS-F microscope Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks Corning, Corning, NY, USA 3814

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Tags

Биология развития Выпуск 157 органоиды мозга человеческие эмбриональные стволовые клетки нейроразвитие дифференциация нейронов моделирование заболеваний упрощенное факторы роста
Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boisvert, E. M., Means, R. E.,More

Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Thomson, J. J., Madri, J. A., Katz, S. G. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (157), e60379, doi:10.3791/60379 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter