Summary
Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.
Abstract
Embriyonik kök hücrelerden farklı laşan insan beyin organoidleri, üç boyutlu bir sistemde birden fazla hücre türünün karmaşık etkileşimlerini incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. Burada beyin organoidleri verimleri nispeten basit ve ucuz bir yöntem salıyoruz. Bu protokolde insan pluripotent kök hücreleri tek hücreler yerine küçük kümelere ayrılır ve heterolog bir bazal membran matrisi veya eksojen büyüme faktörleri olmaksızın temel ortamda büyütülür ve içsel gelişimsel ipuçlarının organoid in büyümesi. Bu basit sistem glial ve mikroglial hücreler de dahil olmak üzere beyin hücresi türlerinin bir çeşitlilik üretir, kök hücreler, ve ön beyin nöronlar, orta beyin, ve arka beyin. Bu protokolden üretilen organoidler ayrıca brightfield görüntüleri, histolojisi, immünororesans ve gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gösterilen uygun zamansal ve mekansal organizasyonun işaretlerini de göstermektedirler ( qRT-PCR). Bu organoidler beynin çeşitli bölgelerinden hücre tipleri içerdiğinden, çok sayıda hastalığın incelenmesinde kullanılabilirler. Örneğin, yakın zamanda yayınlanan bir makalede, hipoksinin insan beyni üzerindeki etkilerini incelemek için bu protokolden üretilen organoidlerin kullanımını gösterdik. Bu yaklaşım, nörogelişimsel handikaplar, genetik bozukluklar ve nörolojik hastalıklar gibi başka türlü zor koşulları araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Sayısız pratik ve etik sınırlamalar nedeniyle, insan beynini incelemekte büyük bir zorluk olmuştur. Kemirgenler kullanan çalışmalar insan beyninin anlayışı için kritik olmuştur iken, fare beyin birçok farklılıklar vardır1,2. İlginçtir, fareler primatbeyin3,4en az 7 kat daha az bir nöronal yoğunluğu var. Primatlar insanlara evrimsel açıdan kemirgenlerden daha yakın olsalar da, çoğu araştırmacının onlarla çalışması pratik değildir. Bu protokolün amacı, beyin hücresi çeşitliliği ve hücresel örgütlenmeyi korurken heterolog bir bazal membran matrisine veya eksojen büyüme faktörlerine gerek kalmadan basitleştirilmiş ve daha ucuz bir yöntem kullanarak insan beyninin birçok önemli özelliğini özetlemekti.
Sasai laboratuarından biçimlendirici çalışma sinyalize embriyonik kök hücrelerden iki ve üç boyutlu nöronal hücre tipleri oluşturmak için embriyoid organların serum ücretsiz kültür (SFEBq) yöntemi kullanılır (ESCs)5,6. Birçok insan beyin organoid yöntemleri sinyalize ESCs nispeten benzer bir yol izlemiştir7,8. Buna karşılık, bu protokol müstakil insan ESCs kümeleri ile başlar (hESCs), kaplama adımları önce Thomson ve Zhang laboratuvarlarının seminal çalışmanın ilk adımları benzer9,10 yanı sıra eksojen büyüme faktörlerinin eklenmesinden önce Pasca laboratuvarının beyin organoid protokolünün ilk adım11. Bazal membran matrisler (örneğin, matrigel) birçok beyin organoid protokolleri kullanılmıştır ve etkili bir iskele olduğu gösterilmiştir8. Ancak, en sık kullanılan bazal membran matrisler onlar üretim sırasında toplu değişkenlik için toplu büyüme faktörlerinin bilinmeyen miktarlarda co-arındırmak gibi komplikasyonlar olmadan gelmez12. Buna ek olarak, bu matrisler görüntülemekarmaşık ve kontaminasyon ve maliyet riskini artırabilir.
İnsan beyin organoidler birçok soruya cevap için kullanılabilir iken, akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, embriyonik kök hücrelerden başlayarak, organoidler daha yakından yaşlı beyinlere göre olgunlaşmamış beyinler benzer ve bu nedenle yaşlılıkta meydana gelen hastalıklar için ideal modeller olmayabilir, Alzheimer hastalığı gibi. İkinci olarak, protokolümüz de konserde birden fazla beyin bölgesinden hücreler üzerinde bir tedavi veya hastalığın etkisini incelemek için yararlı olan ön beyin, orta beyin ve arka beyin gelişimi belirteçleri bulundu, diğer protokoller belirli beyin bölgeleri üzerinde konsantre takip edilebilir13,14. Son olarak, organoid modellerin bir diğer sınırlama boyutu, bir insan beyninin ortalama uzunluğu ise yaklaşık 167 mm, ajitasyon kullanımı ile yapılan beyin organoidler kadar büyümek 4 mm8 ve bu protokol tarafından oluşturulan organoidler 10 hafta 1-2 mm büyür. Yine de, bu protokol insan beyin dokusu ve birden fazla hücre tiplerinin etkileşimi incelemek için önemli bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kök Hücre Bakımı
- Büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matris bir tabaka üzerinde H9 hESCs korumak (Malzemeler Tablosubakınız , bundan böyle sadece matris olarak anılacaktır) üreticinin talimatlarına göre.
- Bir 6-iyi plaka veya bir 10 cm çanak kaplamak için, buz gibi Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 medya 5,9 mL ile matris 100 μL birleştirir. Plakaları parafin filmine sarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Aşırı matris/ortam aspire edildikten sonra hücreleri geçirmek için ertesi gün kullanın.
- Kültür hücreleri hafta hafta yaklaşık 1:12 bölünmüş oranı her 7 günde. Hücreleri 37 °C'lik bir mTESR-1 media, düşük oksijen inkübatör (%5 O2,%5 CO2)kullanarak koruyun. Medyayı her gün yenileyin. Cam aletler kullanarak pasajlar arasındaki kültürlerden ayırıcı hücreleri ayırArak ayırın.
- H9 hücreleri organoidler üretmek için onları kullanmadan önce dört ila altı gün önce geçit edilmelidir. Hücreler hücre kümelerinin yaklaşık 1:8 oranında geçmelidir. Bunu yapmak için, hücreleri DMEM F12 media ile durulayarak başlayın ve hücreleri nötr bir proteaz (örneğin, dispase, bundan böyle sadece proteaz olarak adlandırılır), DMEM/F-12 ile durulayın ve 4 plaka (6-iyi veya 10 cm) arasında ~%20'lik bir arada 30-60 hücre kümesi şeklinde durulayın. Hasattan iki gün önce, onları normal bir kuluçka makinesine geçirin (%21 O2,%5 CO2). Organoid formasyona başlarken plakalar ~%80 birleşmeye ulaşmalıdır.
2. Organoid Kültür için HESC'lerin Dissosiyatasyonu
- Aliquot proteease stok çözeltisi (5 U/mL).
NOT: Genellikle -20 °C'de 1 mL aliquots aşağı birkaç ay boyunca kullanılmak üzere dondurun. - Proteaz stok çözeltisini, her 6 kuyu veya 10 cm'lik hESC'ler için 1 mL stok çözeltisi artı 5 mL DMEM/F12 ekleyerek çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
- Aspire ve hücre kültürü medya kaldırmak, sonra proteaz çözeltisi ile hESCs kapağı. Plakaları 10-15 dakika boyunca kuvöze yerleştirin veya kolonilerin kenarları yuvarlanıp matristen ayırmaya başlayana kadar.
- Plakayı yatırın, proteaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri DMEM/F12 ile üç kez hafifçe yıkayın. 10 cm'lik bir tabak kullanırken 6 kuyulu bir tabak ve 6 mL kullanırken her yıkama için 2 mL/iyi kullanın. Bu adımı gerçekleştirirken kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun.
- Her kuyuya yaklaşık 1,5 mL taze mTESR ortam (veya 10 cm plaka için 5 mL) ekleyin ve hücreleri nazik pipetleme kullanarak plakadan temizler.
- 10 mL'lik pipet kullanarak, hESC'yi orijinalboyutlarının yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde hafifçe aspire edin ve dağıtın. Koloni kümeleri bu adımların tamamlanmasında ~250-350 μm ölçekli karelere benzemelidir.
3. Organoidlerin Üretimi
- Hücreleri, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) olmadan 30 mL mTESR ortam içeren tek bir ultra düşük eki T75 şişesine aktarın.
- Ertesi gün, köşede canlı hücre havuzu (bu ilk gün 5-10 dakika sürebilir, ancak kümeleri büyüdükçe daha hızlı alacak) gibi şişe (ler) tilt.
NOT: Bu adımda veya sonraki adımlarda şişenin altına yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarın. İlk iki gün yüksek sayıda ölü hücreye sahip olması normaldir. Ortam değişiklikleri gerçekleştirirken, hücre enkazının mümkün olduğunca çoğunu kaldırdığınızdan emin olun. - Hücreler yerleştikten sonra, canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mL'lik ortam bırakarak ortam ve ölü hücreleri aspire edin.
- 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamin, 1x NEAA, %0.05 sığır serum albumini (BSA) ve 0.1 mM monotiyogliserol (MTG) ile birlikte 30 ng/mL bFGF ile desteklenen ~ 20 mL düşük bFGF medya (DMEM/F12) ekleyin.
- 2. günde hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünüyorsa, bir şey yapmanıza gerek yoktur. Ancak, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu renk görünürse, ortamı (adım 3.2'deki yle aynı yatırma tekniğini kullanarak) ~20 mL düşük bFGF medya ile 20 ng/mL bFGF ile tamamlanır.
- 3. günde, 10 ng/mL bFGF ile desteklenen 20 mL düşük bFGF ortamile ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) değiştirin.
- 5. günde, ortamın yarısını (adım 3.2'deki yatırma tekniğini kullanarak) 20 mL nöral indüksiyon media (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) ile değiştirin.
NOT: Diğerlerinden çok daha büyük büyük hücre veya organoid kümeleri varsa, kültürden uzaklaştırılmalıdır. Boyut mikroskop altında görünüm tarafından tahmin edilmektedir; örneğin, reticle ile bir gözlük kullanarak. Organoidlerin çoğu benzer büyüklüktedir (kabaca 100 ± 20 μm). Diğerlerinden yaklaşık 2 kat daha küçük veya daha büyük olan organoidleri çıkardık. - Ortamın yarısını (~15 mL) (yatırma tekniğini kullanarak) nim ile her gün değiştirin.
- Kültürde 3 hafta sonra, ortama 100x penisilin/streptomisin ekleyin (NIM: DMEM/F12, 1x N2 takviyesi, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL heparin) istenirse 1x son konsantrasyonunda. Medyayı her gün yenileyin.
NOT: Bu şekilde, kültürde 6 aya kadar organoidleri koruduk.
4. RNA Çıkarma ve Hazırlama
- 10 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden yaklaşık 15 organoidi (boyuta bağlı olarak) hafifçe ayıklayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Santrifüjdeki (1 dk için 200 x g) organoidleri hafifçe peletleyin ve 1x Dulbecco'nun PBS 'si (DPBS) ile üç kez durulayın.
- Doğrulanmış sistem veya protokol (örn. RNeasy kiti) kullanarak RNA ayıklayın.
- Her numunenin optik yoğunluk değerini 260 ve 280 nm olarak ölçün.
- Doğrulanmış bir sistem veya protokol (örneğin, iScript cDNA sentez kiti) kullanarak cDNA hazırlayın.
- En az bir temizlik geni de dahil olmak üzere önceden onaylanmış astarlar(Tablo 1)kullanarak qRT-PCR gerçekleştirin.
5. İmmünohistokimya
- Fiksasyon
- %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'ye yerleştirin.
- Steril bir jilet kullanarak, steril bir transfer pipetinin ucunu kesin.
- Kesme transfer pipetini kullanarak organoidleri yavaşça ayıklayın, çünkü özellikle büyüdüklerinde kolayca parçalanabilirler ve ek ortam veya DPBS ile 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin.
- Plakayı yatırın, ortama aspire edin ve 1x DPBS ile değiştirin. Hücreleri 1x DPBS ile iki kez daha durulayın.
- DPBS'yi %4 PFA çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin.
NOT: 2 gün (küçük organoidler için) 7 güne (organoidler için >3 ay) sabitlenirken, daha kısa süreler (örn. 16-24 saat) de mümkündür. - DPBS'de %30, %20 ve %10 sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
- PFA'da fiksasyondan sonra % 10 sakaroz çözeltisi ile değiştirin ve 4 °C'de 24 saat çalkalayın.
- %10 sakarozun yerine %20 sakaroz ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
- %20 sakarozun yerine %30 sakaroz yerleştirin ve 4 °C'de 24 saat boyunca bir shaker üzerine yerleştirin.
- Dondurulmuş bölümler
- Kuru buz düz bir tabaka hazırlayın ve üstüne etiketli bir plastik kalıp yerleştirin.
- Kalıbın içine en uygun kesme sıcaklığıorta (OCT) ince bir tabaka dökün ve sertleşmeye başlayalım (birkaç saniye içinde).
- İpucu kesilmiş bir transfer pipetkullanarak kalıp OCT üstüne birkaç organoidler yerleştirin ve organoidlerin konumuna yakın dikkat.
- Yavaş yavaş kalıp dolu ve organoidler kaplı olana kadar OCT ekleyin. Ek bir 10 dakika boyunca tamamen sertleşsin.
NOT: 10 dakikanın üzerinde donma, kesit için birden fazla organoidin ideal göreceli yerleşimini sağlamaya yardımcı olurken, daha hızlı donmak için etanol-kuru buz karışımı veya sıvı nitrojen kullanmak mümkündür. - Keserken bulmayı kolaylaştırmak için organoidlerin göreceli konumunu bir işaretle işaretleyin.
- Kalıpları bir torbaya veya kutuya yerleştirin ve bölümleri kesmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
- Bir kriyostat kullanarak, 10 μm kesitleri dilimleyin ve dokuyu etiketli, pozitif yüklü slaytlara yerleştirin.
- Boy -ama
- Bloke çözeltisi hazırlayın (%0.3 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu).
- Doku çevresi etrafında çizmek için bir hidrofobik pap kalem kullanın.
- Slaytları PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca durulayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'yi bloklama çözeltisi ile değiştirin.
- Bloke çözeltisini bir gecede 4 °C'de antikor solüsyonu (uygun konsantrasyonda antikor, %0.1 Triton X-100, PBS'de %4 normal eşek serumu) değiştirin.
- Ertesi gün, her biri 10 dakika pbs ile 3 kez slayt yıkayın.
- PBS'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca antikor çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorla (uygun konsantrasyonda) değiştirin.
- 1x PBS ile her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez durulayın.
- 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) lekesini uygulayın ve 1x PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın.
- Yapıştırmak kapakları kapakları, montaj çözeltisi ile kaydırakların ön kısmı, karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin ve 4 °C'de karanlıkta saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, protokolün farklı aşamalarında hücrelerin/organoidlerin nasıl göründüğünü göstermek için birkaç zaman noktasının temsili parlak alan görüntülerini gösterir. HESC'ler doku kültür plakasından çıkarıldı, küçük parçalara ayrıldı ve küreler oluşturdukları T75 ultra-düşük ek şişesine yerleştirildi. Bu hücrelerin parlak ve benzer boyutlarda, karanlık olmadan, bu kümelerin merkezlerinde ölmekte olan hücreler bakmak dikkat etmek önemlidir. Hücreler yavaş yavaş bFGF kapalı kesildi. 5. gün, nöral indüksiyon ortamına yerleştirildiler ve kültür dönemi boyunca bu medyada kaldılar. Organoidler zamanla daha büyük ve dolayısıyla koyu olsun rağmen, beyin organoid gelişimi boyunca mevcut nöral rozet benzeri yapılar (siyah oklar) dikkat çekmek ve genişletmek önemlidir. Rozetler nöral farklılaşmanın başlangıcını gösterir ve embriyonik nöral tüpün özelliklerini içerir, epitel özellikleri gösteren ve apikal lümeni çevreleyen15.
Kültürde 5 ayda hematoksilin ve eozin ile organoidlerin boyanması, durgun kültür sistemi göz önüne alındığında ilk endişe kaynağı olan merkezlerde bile büyük miktarda nekroz olmadığını göstermiştir(Şekil 2A). Bu organoidler, deneyimli bir nöropatolog tarafından yapılan ışık mikroskobik değerlendirmesine dayanarak insan korteksine benzer histolojik morfoloji göstermiştir(Şekil 2B). Histoloji ile glia (mavi ok başı), nöronlar (kırmızı ok ucu), Cajal-Retzius morfolojisi (siyah oklar) ve nöropil (turuncu ok başı)(Şekil 2B,C)hücrelerine benzeyen birçok benzersiz hücre morfolojisi gözlenmiştir.
Hücrelerdeki gen ekspresyonuna daha derinlemesine bakmak için qRT-PCR uygulandı. Şekil 3'tegösterilen sonuçlar için, her çubuk bağımsız olarak yetiştirilen ve belirtilen zaman noktasında hasat edilen 3 ayrı hücre toplunu temsil eder. Bu örnekler daha sonra temizlik geni, GAPDHek olarak belirtilen gen bir astar çifti ile triplicate çalıştırıldı. Glutamat taşıyıcı, Vglut1 (Şekil 3A), 2.5 hafta olarak ifade edildi, 5 hafta arttı, ve kültür de 5 ay boyunca tutarlı kaldı. Bir ön beyin belirteci, Foxg1 (Şekil 3B), kültürde 5 haftaya kadar düşük seviyelerde ifade edildi. Derin tabaka belirteci, Tbr1 (Şekil 3C), yaklaşık 5 hafta doruğa ulaştı ve daha sonra azaldı, üst tabaka belirteci ise, Satb2 (Şekil 3D), zamanla arttı.
Ventral marker Engrailed1 (Eng1) (Şekil 3E), arka beyin/omurilik belirteci Hoxb4 (Şekil 3F),oligodendrosit belirteci, Olig2 (Şekil 3G), zamanla artmıştır. Buna karşılık, kök hücre belirteci, Sox2 (Şekil 3H), zamanla azalmıştır. Glial marker, FAP (Şekil 3I),5 hafta ile doruğa ulaştı ve daha sonra nispeten sabit kaldı. Buna ek olarak, immünoresans verileri qRT-PCR verileri ile tutarlıydı. 10 hafta orada Foxg1 sağlam bir ifade oldu (Şekil 4A). Sox2 ekspresyonu subventriküler zonu (SVZ)(Şekil 4B,C)benzeyen bölgelerle daha sınırlıydı. İlginçtir, ayrıca dış radyal glial hücre belirteci bazı ifade vardı, HopX (Şekil 4D).
Şekil 1: Organoid büyüme koşullarına ve morfolojiye genel bakış. (A) Medya değişikliklerinin şeması. (B-M) Organoidlerin olgunlaştıkça ki temsili görüntüleri. (B-M) H9 hESCs(B) beyin organoidleri oluşturmak için kullanılmıştır. Organoidler (C) gün 20 ng/mL bFGF medya, ve (D) gün 3 ve (E) gün 4 10 ng/mL bFGF medya. (F-M) 5 (F), 8 (G), 10 (H), 17 (I) 35 (J,K), 70(L,M)gün içinde nöral indüksiyon media (NIM) organoidler. Oklar sinir rozetlerini işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Organoidler histolojik benzerlikleri insan beyin dokusuna paylaştılar. Organoidlerin H&E 5 ay(A)ile insan korteksine benzeyen bir tabaka ile boyanma(B). Yüksek büyütme de glia (mavi ok başı), nöronlar (kırmızı ok ucu), nöropil (turuncu ok başı) ve Cajal-Retzius morfolojisi (siyah oklar)(B,C)hücreleri gibi birçok hücre morfolojisi gözlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zamanla beyin organoidleri içindeki nörogelişimsel genlerin ekspresyonu. SYBR yeşili kullanılarak yapılan kantitatif RT-PCR verileri Vglut1 (A), Foxg1 (B), Tbr1 (C), Satb2 (D), En1 (E), Hoxb4 (F), Olig2 (G), Sox2 (H) ve GFAP (I) ifadesini değerlendirir. Hata çubukları = ortalama ± standart sapma (n ≥ 3). Bu rakam16'dandeğiştirilmiştir. Astar bilgileri için Tablo 1'e bakınız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Beyin organoidlerinde nörogelişimsel proteinlerin ekspresyonu 10 hafta. İmmünofloresans Foxg1 sağlam bir ekspresyonu ortaya (A), Sox2 lokalize ekspresyonu (B,C) ve HopX varlığı (D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | Sıra (5' ila 3') | Amplicon | Exon | |
| En1 | F | GGACAATGACGTTGAAA CGCAGCA |
149 | 2 |
| R | AAGGTCGTAAGCGGTTT GGCTAGA |
2 | ||
| Foxg1 | F | AGAAGAACGGCAAGTAC Gaga |
188 | 1 |
| R | TGTTGAGGGACAGATTG TGGC |
1 | ||
| GAPDH | F | ACCACAGTCCATGCCAT Cac |
449 | 8 |
| R | CACCACCCTGTTGCTGT AGCC |
9 | ||
| GFAP | F | AGAGATCCGCACCAGT Atg |
80 | 4 |
| R | TCTGCAAACTTGGAGCG Gta |
5-Nis | ||
| Hocab4 | F | AAAGCACCCTCTGACTG CCAGATA |
80 | 2 |
| R | ATGGGCACGAAAGATGA GGGAGA |
2 | ||
| Olig2 | F | CCCTGAGGCTTTTCGGA GCG |
451 | 1 |
| R | GCGGCTGTTGATCTTGA GACGC |
2 | ||
| Satb2 | F | TAGCCAAAGAATGCCCT Ctc |
94 | 6 |
| R | AAACTCCTGGCACTTGG Ttg |
7 | ||
| Sox2 | F | CCCAGCAGACTTCACAT Gt |
150 | 1 |
| R | CCTCCCATTTCCCTCGT TTT |
1 | ||
| Tbr1 | F | GTCACCGCCTACCAGAA Cac |
101 | 4 |
| R | ACAGCCGGTGTAGATCG Tg |
6 | ||
| Vglut1 | F | CAGAGTTTTCGGCTTTG CTATTG |
183 | 5-Nis |
| R | GCGACTCCGTTCTAAGG Gtg |
6 |
Tablo 1: Şekil 3'te nicel RT-PCR için kullanılan astar dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diğer organoid modellere benzer şekilde, bu çeşitli uyarılar ile birlikte gelen yapay bir sistemdir. Genel ifade düzeyleri açısından toplu olarak çok az parti olmasına rağmen, bireysel organoidler farklılıklar sergiledi. Örneğin, Sox-2 pozitif alanların yeri her organoidde aynı değildi (Şekil 3). QPCR hücre toplu genel değişiklikleri aramak için uygun olsa da, tek hücreli RNAseq gibi ek teknikler hücre bazında daha fazla bilgi toplamak için gelecekteki çalışmalarda kullanılacaktır. Bu sistemin bir diğer sınırlama, bazı daha yeni çalışmalarda yapılmış olduğu gibi organoidler içinde vaskülatür entegre değildir17,18,19. Ancak, hESC'lerin düşük oksijenli bir ortamdan yüksek oksijenli ortama geçişi, gelişmekte olan bir embriyoda anaerobik geçişe daha yakın olabilir.
Bu protokoldeki kritik adımlar nörosferlerin oluşumu ve aşırı kalabalık olmadan büyüyen organoidler için sağlıklı hücreler ve yeterli besin sağlamak için uygun kültür ortamı ile medya değişiklikleri de dahil olmak üzere uygun bakım . Yetersiz hücre çoğalması veya farklılaşmasını gidermek için, yeni bir paket düşük geçişLI ESC'ler ve takviyeler de dahil olmak üzere yeni hazırlanmış ortamla başlamanızı öneririz. Bazen reaktifler ve malzemelerin toplu varyasyon olabilir. Bu nedenle, n2 ve ultra düşük eki maada gibi reaktifler birden fazla şişe satın almanızı öneririz onlar makul bir süre içinde kullanılabilir sürece aynı çok olan.
Diğer birçok beyin organoid protokolleri aksine, Bu yöntem bir biyoreaktör kullanmaz; bunun yerine hücreler medya değişiklikleri bir yana nispeten durgun kalır. Bu nörosferler ile önceki çalışmaya benzer, hangi sonunda 2D nöronal kültürleri yapmak için ayrı kırıldı20. Bu modelde hücreler 3B formatta tutulur ve kültürde 6 aya kadar büyümesine izin verilir. Tek hücreleri bir araya etmek yerine küçük kümeler kullanırken organoidlerin daha parlak göründüğü ve bunu daha az nekrotik olarak yorumladığımız bulunmuştur. Daha önce bildirildiği gibi, beyin organoid kümeleri histoloji ve immünoresans tarafından değerlendirildiğinde 5 ay, nekroz belirgin alanları vardı16. Hücrelerin küçük kümeleri başlayarak oluşan organoidlerin boyutu biraz çeşitli tanıttı rağmen, organoidlerin çoğunluğu kabaca benzer boyutta idi.
Heterolog bazal membran matris ve biyoreaktör kullanımı hem avantajları hem de dezavantajları vardır. Bazı hücre tipleri, ya da daha büyük beyin organoidleri bir koşul veya başka altında büyüme tercih edebilir. Bazal membran matrisler veya diğer hidrojeller seçici belirli bölgelere büyüme faktörleri eklemek veya belirli kalıplar oluşturmak için yararlı olabilir. Her ne kadar temel membran matrisler üç boyutlu organizasyon ve farklılaşma15desteklemek için gösterilmiştir rağmen, bu ürünlerin bazıları büyüme faktörleri12miktarları içeren bir kötü tanımlanmış ve değişken kompozisyon olduğunu vurgulayarak değer. Beyin organoidleri kültüre ederken iş akışını basitleştirmenin yanı sıra, bir bodrum membran matris yokluğu da üç boyutlu görüntüleme teknikleri artırabilir.
Bu beyin organoid model sisteminin geliştirilmesi birçok potansiyel uygulamalar için yeni bir yaklaşım sunuyor. Örneğin, hipoksi gibi toksik hakaretler, hiperglisemi, hiperkapni, ve diğerleri arasında enfeksiyon, bu sistem ile test edilebilir. Buna ek olarak, nörogelişimsel bozukluklar genetik olarak değiştirilmiş kök hücreler veya hastaya özgü insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hPSCs) ile başlayarak bu sistem ile çalışılabilir. Organoid kültür sırasında farklı hücre tipleri eklemek için yeteneği de tümör-beyin etkileşimleri çalışma imkanı sunuyor. Protokolün basitliği ve pahalı, özel malzemelerin eksikliği göz önüne alındığında, bu yaklaşımın hem saha içinde hem de dışında laboratuvarlar tarafından, bu yaklaşımı daha da ilerletmek için kendi benzersiz faydaları ile potansiyel bir yöntem olarak değerlendirilebileceğini umuyoruz ilerleme ve heyecan verici bir disiplin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.G.K. Dansar BT ve Hücre İçi Gen için SAB üyesidir.
Acknowledgments
Biz Yardım için Yale Kök Hücre Çekirdeği (YSCC) ve Yale Kanser Merkezi (YCC) teşekkür ederiz. Dr. Jung Kim'e nöropatoloji incelemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Connecticut Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu, Dimes Mart ve NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Kanser Merkezi ve Yale Kanser Biyolojisi Eğitim Programı NCI CA193200 (E.B.) ve Joseph cömert bir sınırsız hediye ve tarafından desteklendi ve Lucille Madri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
