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Bioengineering

Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/60383
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para implementar litografía multifotópica para fabricar matrices tridimensionales de marcadores fiduciarios fluorescentes incrustados en hidrogeles basados en poli(etilenglicol) para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia y de tracción para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia Plataformas. Usando estas instrucciones, la medición de la tensión de material 3D y el cálculo de las tracciones celulares se simplificaparan para promover mediciones de fuerza de tracción de alto rendimiento.

Abstract

La cuantificación de la deformación del material inducida por células proporciona información útil sobre cómo las células detectan y responden a las propiedades físicas de su microambiente. Si bien existen muchos enfoques para medir la tensión de material inducida por las células, aquí proporcionamos una metodología para monitorear la tensión con resolución submicrones de una manera libre de referencia. Mediante un proceso de patrón fotolitográfico activado por dos fotones, demostramos cómo generar sustratos sintéticos mecánica y bioactivamente ajustables que contienen matrices incrustadas de marcadores fiduciarios fluorescentes para medir fácilmente tridimensionales ( 3D) perfiles de deformación del material en respuesta a las tracciones superficiales. Usando estos sustratos, los perfiles de tensión celular se pueden mapear usando una sola pila de imágenes 3D de una celda de interés. Nuestro objetivo con esta metodología es hacer de la microscopía de fuerza de tracción una herramienta más accesible y fácil de implementar para los investigadores que estudian los procesos de mecanotransducción celular, especialmente los recién llegados al campo.

Introduction

La microscopía de fuerza de tracción (TFM) es el proceso de aproximación de las tracciones celulares utilizando campos de desplazamiento interpolados de marcadores fiduciarios generados por una célula adherente y contráctil. Usando TFM, la influencia de las señales mecánicas en el entorno extracelular en procesos celulares importantes como la proliferación, diferenciación y migración se puede investigar1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Desafortunadamente, muchos enfoques existentes pueden ser difíciles de implementar o requieren familiaridad con herramientas analíticas y computacionales altamente especializadas, lo que dificulta el uso de TFM para investigadores inexpertos. Describimos una metodología para generar una plataforma TFM que elimina parte de la dificultad en el análisis al tiempo que proporciona una adquisición de datos de alto rendimiento.

De los enfoques de MFT existentes, el más comúnmente utilizado para cuantificar la tensión del material implica la incorporación de pequeños marcadores fluorescentes (típicamente cuentas fluorescentes del tamaño de nano o micrometro) en un hidrogel deformable, como la poliacrilamida (PAA) o la poli Diacrilato de etilenglicol (PEGDA)13,14,15. Estos enfoques basados en cuentas proporcionan la capacidad de agrupar densamente marcadores fiduciarios alrededor de una celda de interés para maximizar el muestreo de desplazamiento. Desafortunadamente, la distribución de las cuentas a través del hidrogel no se puede controlar directamente por lo que la organización espacial es aleatoria. Esta colocación aleatoria conduce a problemas tales como perlas que están demasiado cerca unas de otras para resolver con precisión, o así se extienden que los parches del sustrato producen datos de baja calidad. La incapacidad de predecir dónde se encuentran los marcadores fiduciarios en ausencia de celdas también crea una restricción que, para cada conjunto recopilado de datos de tracción de celda, también se debe capturar una imagen de referencia adicional de los marcadores subyacentes en un estado relajado. La imagen de referencia es necesaria para que el desplazamiento en la imagen estresada se pueda aproximar como la diferencia entre las imágenes estresadas y no estresadas. Para lograr un estado relajado, las células que se miden se relajan químicamente o se eliminan por completo. Este proceso a menudo impide la adquisición de mediciones experimentales adicionales, inhibe los estudios celulares a largo plazo y limita el rendimiento. Una imagen de referencia también requiere técnicas de registro de imágenes para adaptarse a la deriva que puede haber ocurrido durante la experimentación, lo que a menudo conduce a una coincidencia manual engorrosa de imágenes de estado de tensión para hacer referencia a imágenes.

Otros métodos de MFT considerados libres de referencias, implementan algún tipo de control sobre la distribución de marcadores fiduciarios, ya sea por litografía de alta resolución, impresión de microcontactos o micromoldeo16,17,18 ,19,20. El MFT libre de referencias se logra a través de la suposición de que el estado relajado para cada marcador fiduciario se puede predecir en función de cómo se prescribieron las posiciones de los marcadores durante el proceso de fabricación. Estos métodos permiten la captura completa del estado de tensión de una celda dentro de una única captura de imagen en la que se miden los desplazamientos de marcadores fiduciarios en comparación con una referencia implícita que se puede deducir de la geometría del marcador fiduciario. Mientras que la consistencia en la colocación de marcadores se logra típicamente usando estas plataformas, generalmente sufren de sus propias deficiencias en relación con los enfoques ampliamente utilizados basados en cuentas incluyendo: 1) disminución de la resolución de tracción; 2) disminución de la precisión de los desplazamientos fuera del plano (en algunos casos una incapacidad total de medir); y 3) disminución de la personalización de sustratos y materiales de plataforma (por ejemplo, presentación de ligandos, propiedades mecánicas).

Para abordar estas deficiencias, diseñamos una nueva plataforma tofa de referencia libre de referencias. La plataforma utiliza química activada por multifotones para recruzar un pequeño volumen de un fluoróforo en ubicaciones 3D específicas dentro del hidrogel que sirven como marcadores fiduciarios para medir la tensión del material. De esta manera, hemos diseñado una plataforma que funciona de manera similar a los enfoques basados en perlas, pero con el beneficio significativo de que los marcadores fiduciarios se organizan en matrices cuadriculadas que permiten el seguimiento de deformación unitaria de material libre de referencias. Esta propiedad libre de referencias ofrece muchas ventajas. En primer lugar, permite la monitorización no intrusiva de los estados de tracción celular (es decir, elude la necesidad de relajar o eliminar células para adquirir posiciones de referencia de marcadores fiduciarios desplazados). Este era nuestro objetivo principal en el diseño de este sistema, ya que pretendíamos incorporar otros métodos analíticos posteriores en conjunto con TFM, que pueden ser difíciles con enfoques destructivos de TFM de punto final. En segundo lugar, el uso de una referencia implícita basada en matrices cuadriculadas permite una automatización casi completa del análisis de desplazamiento. La regularidad de las matrices crea un flujo de trabajo predecible donde la aparición de casos excepcionales (es decir, datos de celda de ejemplo que contienen artefactos imprevistos, como el espaciado de marcadores subóptimo socada o las discrepancias de registro) se pueden mantener como mínimo. En tercer lugar, la falta de adquirir una imagen de referencia proporciona la libertad de supervisar muchas celdas en una sola muestra durante largos períodos de tiempo. Esto contrasta con los enfoques tradicionales basados en perlas, donde, dependiendo de la fidelidad de los movimientos escénicos automatizados del microscopio, se pueden acumular errores en el posicionamiento y aumentar la dificultad de registrar correctamente las imágenes de referencia a la tensión celular Imágenes. En general, esta plataforma facilita un mayor rendimiento en la recopilación de datos de tensión celular.

Con este protocolo, esperamos familiarizar a los lectores con la técnica de litografía de escaneo láser de dos fotones que implementamos para generar esta plataforma TFM libre de referencias para medir los componentes de tracción dentro y fuera del plano generados por las células sembradas en la superficie. No se trata en este protocolo es la síntesis de algunos de los componentes monoméricos. En general, estas reacciones incluyen esquemas de reacción de síntesis casi idénticos "una olla" descritos anteriormente21, y alternativas a estos productos también se pueden comprar. También pretendemos familiarizar a los lectores con las herramientas basadas en software que generamos para promover el uso de microscopios de escaneo láser disponibles comercialmente como herramientas de impresión 3D y facilitar el análisis de desplazamientos de marcadores fiduciarios.

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Protocol

1. Fotopolimerización de un hidrogel base PEGDA

  1. Reactivos de recolección
    1. Recoger el litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), 3,4 kDa de poli(etileno) diacrilato de glicol (PEGDA), pirrolidona de n-vinilo (NVP), AlexaFluor 488 etiquetado PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiquetado PEGDA (PEG-633) y péptido RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de sus respectivos congeladores y llevar cada uno a temperatura ambiente.
    2. En tubos de microcentrífuga ámbar separados, mida 3 mg de LAP, 10 mg de PEGDA, 5 mg de PEG-488, 20 mg de PEG-633 y 6 mg de péptido RGDS.
  2. Preparación de la solución prepolímero
    1. Disolver el REVESTIMIENTO en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4). Utilice 200 l de la solución LAP disuelta para disolver el PEGDA. A continuación, utilice 200 l de la solución pegDA para disolver el PEG-RGDS.
      NOTA: Si se desea el control de la forma de la célula, omita la disolución de PEG-RGDS en la solución de prepolímero de hidrogel base, ya que se agregará a través de la litografía de escaneo láser de dos fotones más adelante en el protocolo.
    2. Utilice 80 s l de PBS para disolver el PEG-488. Añadir 2,5 ml de esta solución a la solución prepolímero.
      NOTA: El PEG-488 dará al hidrogel final una señal fluorescente que se puede utilizar para navegar durante el patrón y la concentración se puede modificar para alterar la intensidad de la señal.
    3. Filtrar la solución prepolímero completa a través de un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 m para eliminar las partículas que puedan estar presentes en la solución. Si los reactivos se sintetizan correctamente, el filtro no debe obstruirse.
  3. Fotopolimerización del hidrogel base
    1. Coloque 3 l de la solución prepolímero en una lámina plana delgada de alcanos perfluoroalcoxinos (PFA). Coloque tiras planas de polidimetilsiloxano (PDMS) de 150 m de espesor que rodean, pero no están en contacto con, la gota de solución prepolímero. Coloque un cubreobjetos acrilato-silanizado21,22,23,24 en el PDMS, con la gota prepolímero centrada debajo del cubreobjetos, para aplanar la gota prepolímero al grosor de la Espaciadores PDMS.
    2. Exponer la solución de prepolímero emparedado a la luz UV hasta que un hidrogel esté completamente formado (aproximadamente 1 min a 14 mW/cm2 de luz de 370-400nm).
    3. Separe cuidadosamente el cubreobjetos de los espaciadores PDMS y adjúntelo a una placa Petri de fondo abierto utilizando adhesivo acrílico de doble cara de alto rendimiento. Aplique presión sobre la superficie de contacto adhesiva para crear un sello completo entre el cubreobjetos, el adhesivo y la placa Petri, con cuidado de no romper el vidrio.
    4. Enjuague el hidrogel en la placa Petri con PBS filtrado estéril para minimizar los contaminantes biológicos y de partículas.
    5. Repita los pasos 1.3.1-1.3.4 según sea necesario para crear el número deseado de hidrogeles.
    6. Agregue 8 l de NVP a los 800 l restantes de solución LAP y mantenga esta solución, así como peg-633 no disuelto hasta que esté listo para el patrón.
      NOTA: La solución LAP con NVP es muy sensible a la luz y se polimerizará si no se mantiene en la oscuridad. Envolver el tubo en papel de aluminio puede ayudar a mejorar su vida útil.

2. Creación de instrucciones de patrón

  1. Diseño de una imagen binaria
    1. Para crear una máscara virtual para prescribir matrices de marcadores fiduciarios, utilice el software de procesamiento de imágenes o dibujo para crear una imagen con una relación de aspecto de 100:1 (por ejemplo, 2000 píxeles de largo x 20 píxeles de ancho).
    2. Cree una fila de 100 píxeles blancos espaciados uniformemente sobre un fondo negro centrado a lo largo del eje largo de la imagen.
    3. Guarde esta imagen como un tipo de archivo *.tif.
      NOTA: Si se desea controlar la forma de la celda21,25,26,27,28, cree una máscara virtual adicional. Utilice un lienzo de imagen de forma cuadrada y cree entidades blancas positivas sobre un fondo negro. Para aproximar un tamaño adecuado para las entidades blancas (que eventualmente apoyarán la adhesión celular) suponga mosquenos que el tamaño total de la imagen es equivalente al tamaño del campo de vista del microscopio utilizado para la litografía de escaneo láser.
  2. Convertir una imagen binaria en una máscara digital
    1. Descargue las funciones LSM-ROI-Generator disponibles gratuitamente en el repositorio de software29.
    2. Abra Matlab y busque el directorio de los archivos de función descargados. Una vez en el directorio, abra el script de Matlab run_script.m y ejecute el script.
    3. Seleccione el archivo *.tif binario para la conversión. A continuación, seleccione una carpeta para guardar los archivos de regiones.
    4. Introduzca el tamaño final deseado, en micras, de la imagen seleccionada. La imagen de entrada se escalará y acotará para que coincida con estos parámetros. Para que toda la imagen quepa en el campo de vista del microscopio, el tamaño total de la imagen debe ser menor o igual que el tamaño del campo de vista del microscopio.
    5. Si crea una matriz de píxeles único, en las Opciones de ROI-Generator, asegúrese de desmarcar la casilla Eliminar en Regiones pequeñas/píxeles únicos, para marcar la casilla de verificación con la etiqueta Cuadradosy desmarque Usar en Líneasde rotura horizontales . A continuación, haga clic en Aceptar.
      NOTA: Si crea un archivo de regiones para crear patrones de celda única, las opciones predeterminadas son adecuadas.
    6. Busque el archivo *.ovl resultante en la carpeta especificada anteriormente. Este archivo debe llevarse al microscopio para cargar las regiones deseadas que controlan el obturador láser durante la litografía de escaneo láser de dos fotones.

3. Fabricación de matrices de marcadores fiduciarios

  1. Remojar el hidrogel base
    1. En condiciones de poca luz, agregue 200 l de la solución LAP/NVP al AF633 (ambos preparados en el paso 1). Mezcle bien mientras protege de la luz.
    2. Retire toda la solución de PBS de la placa Petri que contiene un hidrogel PEGDA del paso 1.
    3. Añadir el PEG-633 disuelto al hidrogel para formar una gota que abarque completamente el hidrogel base.
      NOTA: Si el orificio en la placa Petri es sólo ligeramente más grande que el hidrogel, puede servir como un pozo para sostener la solución de patrón. De lo contrario, asegúrese de que el cubreobjetos esté completamente seco antes de añadir la solución de patrón o puede salir del hidrogel causando que el hidrogel se deshidrate durante el patrón.
    4. Cargue el plato Petri en el portamuestras en el escenario del microscopio y coloque la tapa en la placa Petri. Deje que la solución de patrón se empape en el hidrogel durante al menos 30 minutos en la oscuridad.
      NOTA: El microscopio se puede encender y configurar durante este tiempo de remojo. El uso del láser de 488 nm para la imagen del hidrogel durante el remojo está bien.
  2. Configuración del microscopio
    1. Usando una línea láser de 488 nm y filtros apropiados para la imagen AlexaFluor 488, localice el hidrogel utilizando la señal PEG-488. Colección de bloques de longitudes de onda de emisión más largas del detector, ya que éstas se saturarán con la señal del PEG-633.
    2. Encuentre el centro del hidrogel en el plano XY usando escaneos de baldosas verticales y horizontales y cero la posición del escenario aquí.
    3. Encuentre la superficie del hidrogel utilizando escaneos de línea y la función z-stack. Cero la posición de enfoque aquí. Nivele el hidrogel repitiendo estos escaneos de línea lejos del centro XY para identificar la posición de la superficie y ajustando los tornillos establecidos para la etapa del microscopio.
    4. En el espacio de trabajo del software del microscopio, cree un archivo de experimento independiente para el fotopatrón. Establezca la potencia multifotón en 1,8% (15,5 mW a 740 nm medida en la apertura posterior del objetivo) y la velocidad de escaneo en 6 (0,1 m/s). Ajuste el tamaño del marco de la imagen en píxeles para lograr un tamaño de píxel de 0,1 m por píxel y una relación de aspecto de 100:1.
    5. Cargue el archivo de regiones (*.ovl) creado en el paso 2.2 en la pestaña Regiones.
    6. Encienda la función z-stack y establezca el espaciado en 3,5 m para una profundidad total de 28 m y un número total de rodajas z de 9.
    7. Utilice la función de posiciones para establecer ubicaciones específicas en el hidrogel donde las matrices de marcadores fiduciarios serán fotopatrónadas.
      NOTA: La ubicación z de estas posiciones dictará la posición central de cada pila z; al colocar posiciones, asegúrese de que cada posición garantizará que el volumen modelado se superponga con el hidrogel en todas las ubicaciones de la superficie.
    8. Utilice la función de mosaico para especificar filas y columnas adicionales en cada posición. Tenga cuidado de evitar regiones con patrones superpuestas. Idealmente, asegúrese de que las áreas con patrones estén lo suficientemente cerca como para eliminar ubicaciones vacías e inutilizables entre posiciones.
  3. Fotopatrón de las matrices de marcadores fiduciarios
    1. A medida que el tiempo de remojo se acerca a la marca de 30 minutos, realice exploraciones sucesivas de la línea de la pila z de la superficie del hidrogel cada 5 minutos para comprobar la hinchazón en función de los cambios en la ubicación de la superficie en relación con la posición de enfoque a cero.
    2. Si no se produce ningún cambio en la posición de la superficie en un intervalo de 5 minutos, cargue y ejecute la configuración de patrón creada en el paso 3.2.4
    3. Una vez que el experimento de patrón ha terminado de funcionar, utilice el láser de 488 nm para verificar que la superficie del hidrogel no se movió durante el patrón.
      NOTA: Si la superficie del hidrogel no está en la misma posición que antes del patrón, existen varios escenarios. El hidrogel no había alcanzado el equilibrio de hinchazón antes del patrón, el hidrogel comenzó a secarse durante el patrón, o el microscopio experimentó z-drift. El origen de esta traducción de superficie debe identificarse y corregirse en las ejecuciones de patrón posteriores.
    4. Retire el hidrogel del microscopio y aspire la solución PEG-633 de la placa Petri.
      NOTA: El hidrogel sigue siendo extremadamente sensible a la luz. Mantener el hidrogel en la oscuridad es muy importante hasta que se complete todo el enlinging.
    5. Enjuague el hidrogel 3 veces con PBS filtrado estérilmente, asegurándose de eliminar completamente el enjuague entre cada enjuague sucesivo. Repita este enjuague triple cada 15 minutos durante 1 h.
    6. Deje que el hidrogel se enjuague en PBS durante la noche.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
    7. Enjuague tres veces el hidrogel con PBS. A continuación, enjuague rápidamente el hidrogel rápidamente con una solución de etanol a prueba de 200, seguido de otro triple enjuague con PBS. No permita que el hidrogel se quede en 200 etanol a prueba durante largos períodos de tiempo.
      NOTA: Algunos componentes de la solución de patrón pueden estrellarse fuera de la solución y depositarse en la superficie del hidrogel y aparecer como una capa sólida de fluorescencia (1-5 micras de espesor) bajo una iluminación de 633 nm. El rinsing con 200 etanol a prueba debe eliminar estos componentes no deseados.
  4. Uso de fotopatrones sucesivos para generar patrones de celda única (opcional)
    NOTA: Si se desea controlar el área de propagación de celda y la forma, se pueden realizar varias rondas de patrón. El gel base debe tener PEG-RGDS omitido de su formulación inicial. Se recomienda que el patrón de las matrices de marcadores fiduciarios se realice en último lugar para evitar el blanqueo de los marcadores fiduciarios fluorescentes.
    1. Disolver 20 mg de PEG-RGDS en la solución LAP/NVP preparada en el paso 1.
    2. Repita los pasos 3.1 – 3.3 utilizando la solución PEG-RGDS en lugar de la solución PEG-633. Utilice el archivo de regiones adecuado que define los patrones de celda única (consulte el paso 2 para obtener instrucciones).
      NOTA: Para visualizar las matrices de patrones PEG-RGDS, hay varias opciones. Una variante fluorescente de PEG-RGDS se puede utilizar21,30 o el PEG-RGDS se puede dopar con PEG fluorescente. Recomendado: Alternativamente, la línea láser de 488 nm se puede ejecutar en tándem con el láser de patrón multifotón para blanquear la señal PEG-488 en el hidrogel base, creando regiones no fluorescentes que coinciden con la incorporación de RGDS.

4. Visualización de matrices de marcadores fiduciarios

  1. Adquirir una imagen de la pila z de la matriz fabricada
    1. Reemplace PBS en la placa Petri por los medios celulares utilizados para el cultivo celular.
      NOTA: Se recomienda el uso de medios libres de color rojo fenol durante la adquisición de la imagen para evitar la fototoxicidad.
    2. Después de 1 h de tiempo de remojo, utilice un microscopio de fluorescencia de campo ancho equipado con un módulo de iluminación estructurado y una lente objetivo de inmersión en agua de alta aumento para visualizar los hidrogeles utilizando un conjunto de filtros adecuado para los marcadores fiduciarios fluorescentes.
    3. Recoger una pila z de alta resolución de imágenes (espaciadas de 0,4 m en Z) que abarcan al menos 20 m de profundidad desde la superficie del hidrogel en el hidrogel en el área estampada, asegurándose de que el límite superior de la pila z incluya al menos 1-2 imágenes físicamente por encima de la área de patrón (es decir, donde los marcadores fiduciarios fluorescentes ya no son visibles y sólo hay ruido presente).
      NOTA: La adquisición de esta pila de imágenes es necesaria para verificar que todos los parámetros de patrón son correctos y se pueden analizar junto con los datos de celda en el paso 5.3.

5. Realización de MFT utilizando hidrogeles fotopatrónizados

  1. Células de sembrado
    NOTA: Para mantener la esterilidad, siga todas las prácticas estándar de cultivo de tejidos.
    1. Antes de la sembración de células, siga los protocolos estándar para la línea celular respectiva para el cultivo y el mantenimiento celular.
    2. (Opcional) Si la esterilidad del hidrogel es una preocupación, incubar el hidrogel durante 24 horas en medios que contengan antibióticos seguidos de enlinamiento con medios normales.
    3. Para las células de semilla, primero vuelva a suspender las células tintentapsinizadas en el volumen final de los medios que se utilizarán en la placa de hidrogel Petri.
    4. Retire toda la solución de la placa de hidrogel y sustitúyala por el medio cargado de células.
    5. Deje que el hidrogel se quede sin perturbaciones en medios cargados de células durante 10 minutos.
    6. Mueva cuidadosamente el plato De Petri a una incubadora. Mantener las células en la incubadora durante 4 h o hasta que las células se adhieran visiblemente.
    7. Reemplace el medio cargado de celdas por medios libres de celdas para eliminar las celdas no adheridas.
  2. Adquirir imágenes de células y marcadores fiduciarios
    1. Ajuste la temperatura de la cámara de incubación en el microscopio a 37 oC y CO2 a 5% y permita que la cámara llegue a los puntos de ajuste.
    2. Coloque la placa Petri en el soporte de la muestra y localice las áreas con patrón.
    3. Localice una celda de interés (COI) y adquiera una imagen transmitida o fluorescente del COI.
      NOTA: Esta imagen se utilizará para segmentar el límite de la celda durante el análisis, por lo que la imagen debe visualizar claramente los tableros de celdas.
    4. Adquiera una pila z de la matriz con patrones debajo del COI como en el paso 4.1.4.
    5. Adquirir un segundo conjunto de imágenes transmitidas o fluorescentes de la célula.
      NOTA: Compare la segunda imagen establecida con la primera para determinar si se observa daño celular debido a la fototoxicidad y si es necesario ajustar los ajustes de adquisición de la imagen. Las células que se encogen después de la exposición probablemente han sufrido efectos fototóxicos significativos, que pueden afectar los resultados.
    6. Repita los pasos 5.2.3-5.2.5 para cada COI.

6. Análisis de las imágenes

  1. Preparación de los archivos de imagen para el análisis
    1. Usando los datos recopilados en el paso 5.2, prepare una pila de imágenes recortadas del área alrededor de un COI de modo que la imagen inferior (primera imagen) de la pila represente el primer fotograma donde: (1) >80% de las columnas de marcador estampadas son visibles, (2) la imagen superior (última imagen) en la pila ya no contiene ningún marcador fiduciario visible (es decir, por encima de la superficie del hidrogel), y (3) hay al menos 20 m de marcadores fiduciarios no estresados que rodean el COI.
      NOTA: Recortar las imágenes reduce en gran medida el tiempo de cálculo durante el análisis. El código de análisis en pasos posteriores se puede ejecutar sin recortar las imágenes, pero esto no se recomienda.
    2. Cree una imagen recortada de la imagen transmitida y/o fluorescente para que coincida con el recorte XY de la pila en el paso anterior.
    3. Utilice la imagen transmitida recortada o fluorescente, lo que sea más representativo de la forma de la celda, para segmentar la imagen a mano (trazar el borde de la celda) o a través de herramientas de procesamiento de imágenes.
    4. Convierta esta imagen en una imagen binaria donde el interior de la celda es negro (es decir, intensidad 0) y el área que rodea la celda es blanca (es decir, intensidad a 0). Guarde esta imagen como Binary Mask.tif.
    5. Para cada COI, recopile el archivo de pila de imágenes, el archivo de imagen transmitido y el archivo de máscara binaria en una sola carpeta.
  2. Ejecución de scripts de análisis en las imágenes
    1. Clonar o descargar las funciones de análisis TFM disponibles gratuitamente en el repositorio de software29. Se debe descargar todo el repositorio, ya que hay un número significativo de dependencias en las subcarpetas.
    2. Abra Matlab y agregue el directorio y todas las subcarpetas del clon local del repositorio de código a la ruta de acceso.
    3. Establezca el directorio dentro del espacio de trabajo de Matlab en la ubicación de la carpeta donde se almacenaron las imágenes preparadas en el paso 6.1.
    4. Abra y ejecute el script tracking.m. Cuando se le solicite, siga las instrucciones para cargar las imágenes adecuadas, realizar los pasos de preprocesamiento iniciales y comprobar los errores del algoritmo de seguimiento de objetos.
    5. Una vez completado el script, abra y ejecute la función dispShear.m. Este script no debe requerir la entrada del usuario.
    6. Una vez completado el script dispShear.m, abra y ejecute disp3D.m. Si se le pide que abra cualquier imagen, siga las instrucciones.
      NOTA: Durante el tiempo de ejecución, el script puede pedir al usuario que dibuje una línea en una imagen de la matriz con patrones. Esta línea debe representar el eje de movimiento primario del láser de escaneado durante el patrón y debe alinearse con una fila de marcadores fiduciarios estampados. Este proceso indica al código en cuanto a qué dirección (es decir, filas o columnas de marcadores fiduciarios) probablemente produce las filas más alineadas de marcadores fiduciarios.
    7. Una vez completado el código dispShear.m, ejecute el código dispSurface.m seguido del código interpFinal3D_2.m. Estos scripts no deben requerir entradas del usuario.
      NOTA: El script interpFinal3D_2.m convierte los datos de desplazamiento en tracciones superficiales utilizando software obtenido externamente, que se ha descrito anteriormente31. Para aplicar estas funciones externas, interpFinal3D_2.m interpola los datos de desplazamiento en cuadrículas uniformes para servir como entradas para las funciones de conversión. Si se utiliza un método de conversión diferente, o si no se necesitan tracciones, este paso se puede omitir.
    8. Una vez que se han ejecutado todos los scripts, asegúrese de que todos los datos y salidas se pueden encontrar en el directorio inicial.
    9. Repita los pasos 6.2.3 – 6.2.8 para cada COI.
      NOTA: Dentro del repositorio de código, hay una carpeta que contiene scripts que permiten la ejecución automática por lotes de cada uno de los scripts en una lista de directorios. Consulte los propios scripts de automatización (es decir, comentarios dentro del código) para obtener instrucciones sobre cómo usarlos.

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Representative Results

A lo largo del protocolo, hay una serie de puntos de control que proporcionan retroalimentación para evaluar la calidad del procedimiento de patrón. Para proporcionar información sobre cómo evaluar el progreso en cada uno de estos puntos de control, proporcionamos resultados representativos de un experimento real. Los resultados ponen de relieve la aplicación de este protocolo realizado en un hidrogel fotopatrón preparado para el análisis DeMF de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC). Los resultados incluyen datos de imagen sin procesar, así como salidas de datos procesadas en cada paso crítico.

El primer punto de control se produce en el paso 4, una vez que la matriz de marcadores fiduciarios ha sido fotopatrónada en el hidrogel. Al recopilar una pila de imágenes, las imágenes resultantes deben mostrar una matriz regular de entidades con patrones(Figura 1A-C) que oscilan en intensidad en función de la posición z dentro de la pila de imágenes. Si la superficie estampada no estaba perfectamente nivelada, diferentes regiones de cada segmento de imagen pueden parecer fuera de fase entre sí con respecto a estas oscilaciones; esto se espera y no debe afectar al análisis excepto en casos extremos.

Los puntos de comprobación restantes utilizan salidas de cada uno de los scripts que se ejecutan durante el análisis de un COI determinado. El script tracking.m proporciona varias imágenes de diagnóstico, incluida una proyección z de marcadores fiduciarios fluorescentes(Figura 2A)para evaluar la calidad del preprocesamiento, una gráfica de centroides detectados codificados en color en función de la posición z ( Figura 2B) para evaluar la calidad de detección de objetos y una gráfica de pistas que representan centroides de marcadores detectados que se han vinculado a columnas en la dirección z (Figura 2C) para evaluar la calidad de seguimiento de objetos.

Para una detección precisa del centroide 3D necesaria para calcular las coordenadas y desplazamientos de referencia, los marcadores fiduciarios fluorescentes deben asemejarse a las formas elipsoidales con una intensidad que disminuye radialmente desde el centro. El script disp3D.m proporciona una gráfica de intensidad en función de la posición z para cada columna de entidades detectadas en una pila de imágenes determinada(Figura 3A,B)para evaluar la calidad de los perfiles de intensidad de marcador escéptica. Tanto disp3D.m como dispShear.m juntos proporcionan histogramas de ruido de desplazamiento medido en cada una de las dimensiones de coordenadas cartesianas(Figura 4A-C),así como mapas de calor interpolados de desplazamiento(Figura 4 E,F). Por último, el interpFinal3D_2.m proporciona mapas de calor de tracciones superficiales calculadas utilizando código externalizado(Figura 5)31.

Figure 1
Figura 1: Resultados típicos de patrones.
(A) Imágenes fluorescentes de marcadores fiduciarios que muestran fluctuaciones de intensidad a través de la dimensión Z desde la superficie del hidrogel hasta 12,4 m dentro del hidrogel. (B) Una representación volumétrica procesada revela la forma elipsoidal de los marcadores fiduciarios. (C) Las visualizaciones de perfil seccionadas de la representación volumétrica muestran datos de marcadores sin procesar. A,C: Barra de escala de 5 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Salidas de diagnóstico del algoritmo de seguimiento de partículas.
El software de detección y seguimiento de objetos genera varias imágenes de diagnóstico, incluyendo (A) una proyección ponderada en Z de los marcadores fiduciarios fluorescentes y (B) una gráfica de dispersión de posiciones de marcador con posición Z codificada por color. (C) Una salida adicional muestra una proyección ponderada en z, como en (A), con detecciones 2D de cada fotograma vinculado a columnas. (D) Una mirada más cercana (B) muestra más claramente las detecciones 2D individuales de color codificado por posición z. R: Barra de escala de 20 m. C: Barra de escala de 5 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Salidas de diagnóstico del algoritmo de desplazamiento 3D.
(A, B) Los trazados de línea de intensidad de marcador en función de la posición del fotograma muestran oscilaciones entre marcadores agrupados en la dirección vertical. Estas gráficas de línea permiten una evaluación cualitativa de la alineación de la rejilla con el plano de imagen, así como la calidad general de los marcadores fiduciarios estampados. (A) Las oscilaciones superpuestas en la intensidad del marcador confirman la alineación aceptable del plano de imagen con las matrices de marcadores fiduciarios con patrones. La inclusión de fotogramas vacíos en la parte superior de una pila Z permite el cálculo automatizado de un umbral de ruido en el software de procesamiento. (B) Una mala superposición entre las oscilaciones es a menudo indicativo de una alineación deficiente de las rejillas con patrón con el plano de imagen, pero también puede sugerir que la propia cuadrícula está desalineada y puede producir resultados deficientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Salidas de diagnóstico de los algoritmos de desplazamiento 2D y 3D.
(A-C) Los histogramas de desplazamientos medidos en regiones consideradas "no deformadas" (es decir, ruido de desplazamiento) proporcionan una evaluación cuantitativa de la precisión de las líneas de referencia calculadas para aproximar las posiciones de referencia de los marcadores. Los campos de desplazamiento proporcionan una representación visual de los desplazamientos medidos fuera del plano(S) y(E)fuera del plano (normal). D: Barra de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Salidas de diagnóstico del algoritmo de conversión de tracción.
(A-C) Las tensiones de tracción se pueden calcular en función de los campos de desplazamiento interpolados para determinar la tracción total (B), la tracción de cizallamiento (C)y la tracción normal (D). R: Barra de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo que alivie gran parte de la dificultad asociada con la generación y análisis de datos TFM. Una vez preparados, los hidrogeles fotopatrónidos son fáciles de usar, lo que requiere sólo el conocimiento de las prácticas estándar de cultivo de tejidos y la microscopía de fluorescencia. El aspecto libre de referencia permite la navegación despreocupada en hidrogeles cargados de células y elimina los engorrosos pasos de procesamiento de imágenes, como el registro de imágenes entre imágenes de referencia y deformadas. El análisis resultante está casi completamente automatizado y los datos de los COI individuales se pueden analizar de principio a fin en menos de 10 minutos.

Los principales desafíos de este protocolo se derivan de la fabricación del hidrogel fotopatrón. Debido a que la mayoría de los reactivos utilizados en el protocolo se sintetizan internamente, esperamos que los usuarios con poca experiencia en el uso de materiales de hidrogel sintético pueden ser algo disuadidos de intentar este protocolo. Dicho esto, todos los componentes PEGylated utilizados en este protocolo se sintetizan a partir de protocolos casi idénticos utilizando reacciones de un solo disco y muchos de los componentes se pueden comprar a proveedores comerciales.

Este protocolo también requiere cierta maestría sobre el uso de microscopios de exploración láser. Los parámetros de escaneo láser deben optimizarse para cada microscopio diferente, ya que las intensidades láser, las lentes objetivas y otros componentes del microscopio variarán, incluso entre microscopios del mismo modelo. Un enfoque simple para determinar los mejores ajustes del microscopio para el fotopatrones es realizar un panel de escaneos con ajustes variados. Cualquier ajuste que afecte a la exposición láser total recibida por la muestra afectará el tamaño y la calidad de los marcadores estampados. Esto incluye: velocidad de escaneo, tamaño de píxel, número de promedio, potencia/intensidad/fluidez láser, aumento y apertura numérica32,33. A menudo es más fácil ajustar la potencia del láser y la velocidad de escaneo, por lo que se recomienda comenzar con esos dos parámetros. También debe tenerse en cuenta que el software utilizado para generar archivos de regiones fue diseñado específicamente para la marca de microscopios que utilizamos y puede necesitar ser aumentado para acomodar otras marcas y modelos de microscopio. Con los ajustes proporcionados en el protocolo, el usuario debe esperar generar marcadores elipsoidales con perfiles de intensidad gaussianos 3D de dimensiones de ancho completo de media máxima de 0,84 a 0,11 m en XY y 3,73 a 0,30 m en Z. El algoritmo de detección de objetos utiliza un centro de intensidad para identificar centroides de marcadores y funcionará mejor cuando los marcadores presenten un degradado de intensidad definido.

Ensionar adecuadamente el hidrogel y protegerlo de la luz y de los contaminantes es de vital importancia para el cultivo celular. Como se mencionó en el protocolo, algunos de los componentes de patrón pueden estrellarse fuera de la solución y el depósito en la superficie del hidrogel. Si estos componentes no se enjuagan completamente de la superficie, la adhesión celular puede verse afectada de forma impredecible. Si se expone a la luz del espectro UV, incluso en pequeñas dosis, mientras que el hidrogel está empapado en la solución de patrón, la solución de patrón comenzará a polimerizar y producirá resultados pobres. Por último, las partículas en el aire o las partículas sin filtrar complicarán el análisis, especialmente si son fluorescentes. Se debe tener especial cuidado para evitar que estos contaminantes entren en la muestra en todos los pasos del protocolo.

El código de análisis predice las ubicaciones de referencia de los marcadores fiduciarios deformados prediciendo la matriz original a partir de marcadores no deformados en la misma fila o columna que el marcador deformado. Si bien esto simplifica en gran medida el análisis, también impone algunas restricciones sobre lo que se puede o no se puede analizar. Como mínimo, cada marcador deformado que se está analizando debe tener 2 o más miembros de su columna y fila de marcadores que no se deforman para que se pueda realizar una predicción precisa. Una fila se define mediante el grupo de puntos impresos en un escaneo de una sola línea en el microscopio, y una columna se define mediante marcadores estampados en un solo eje vertical mediante una función de pila z. Esto limita el análisis a celdas individuales o clústeres de celdas pequeñas en función de la longitud y profundidad de cada área con patrón. Es importante tener en cuenta que esto no se corrige colocando dos regiones con patrones perfectamente una al lado de la otra. Esto se debe a que aunque los componentes XY pueden alinearse, no es factible alinear perfectamente los componentes posicionales Z de las matrices, a menos que la superficie de la muestra esté perfectamente nivelada tanto con el plano focal como con el escenario. La mejor manera de evitar esta limitación es emplear rondas adicionales de patrón que dicten específicamente la colocación del ligando de adhesión. Si se alinea correctamente, la adhesión de celdas se puede restringir a áreas utilizables en los patrones.

El código de análisis se ha optimizado para matrices cuadradas en las que los marcadores están espaciados aproximadamente a 3,5 m de distancia en Z y 2,1 m en X e Y. El espaciado final variará en función de la fidelidad y la hinchazón del patrón, pero esto no debería afectar en gran medida al rendimiento si el espaciado en fila es consistente (la variabilidad del espaciado entre hileras no afectará al seguimiento). Aunque el código puede ejecutarse hasta su finalización en matrices prescritas de forma diferente, su estado actual puede producir resultados deficientes si las matrices no coinciden con los parámetros enumerados aquí. Nuestros objetivos actuales para el código de análisis son incluir soporte para el espaciado variable, así como matrices triangulares, lo que puede mejorar la precisión de la reconstrucción de la tracción y reducir el sesgo regional en comparación con los arreglos cuadrados.

Para concluir, proporcionamos un enfoque de TFM que permite la recopilación y análisis fácil de datos de TFM sin perturbar la función celular. Nuestro objetivo con este enfoque es proporcionar un enfoque de MFT más accesible y no intrusivo, sin comprometer la resolución y calidad de los datos de MFT. Esperamos que esta metodología promueva la convergencia del conocimiento bioquímico de los fenotipos celulares con las propiedades físicas observadas de las células.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

O. A. Banda fue apoyado por la financiación de una beca NSF IGERT SBE2 (1144726), fondos de startup proporcionados por la Universidad de Delaware, y los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Cáncer PROGRAMA IMAT (R21CA214299). JHS es apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Cáncer Programa IMAT (R21CA214299) y el Programa de Premios CAREER de la Fundación Nacional de Ciencia (1751797). El acceso a la microscopía fue apoyado por subvenciones del NIH-NIGMS (P20 GM103446), el NSF (IIA-1301765) y el estado de Delaware. El microscopio de iluminación estructurada fue adquirido con fondos del Programa Federal de Becas de Investigación y Desarrollo del Estado de Delaware (16A00471). El microscopio confocal LSM880 utilizado para la litografía de escaneo láser de dos fotones fue adquirido con una beca de instrumentación compartida (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

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References

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Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

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