Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Summary

Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.

Abstract

Hücre kaynaklı malzeme deformasyonunun ölçülmesi, hücrelerin mikro çevrelerinin fiziksel özelliklerini nasıl algılayıp tepki verdikleri hakkında yararlı bilgiler sağlar. Hücre kaynaklı malzeme gerilmelerini ölçmek için birçok yaklaşım mevcut olmakla birlikte, burada sub-mikron çözünürlüğü ile gerinimin referanssız bir şekilde izlenmesi için bir metodoloji salıyoruz. İki fotonlu aktif fotolitografik desenleme işlemini kullanarak, üç boyutlu () üç boyutlu olarak kolayca ölçmek için, floresan fiducial belirteçlerin gömülü dizilerini içeren mekanik ve biyo-aktif olarak tunable sentetik yüzeylerin nasıl üretilebildiğini gösteriyoruz. Yüzey çekişlerine yanıt olarak 3D) malzeme deformasyon profilleri. Bu yüzeyler kullanılarak, hücre gerilimi profilleri ilgi bir hücrenin tek bir 3B görüntü yığını kullanılarak eşlenebilir. Bu metodoloji ile amacımız, özellikle alana yeni gelen hücresel mekanotransdüksiyon süreçlerini inceleyen araştırmacılar için çekiş kuvvetini mikroskobu daha erişilebilir ve uygulaması daha kolay hale getirmektir.

Introduction

Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM), yapışık ve kontraktil hücre tarafından oluşturulan fiduyal belirteçlerin enterpolasyonlu yer değiştirme alanlarını kullanarak hücresel çekişlere yaklaşma işlemidir. TFM kullanılarak, hücre dışı ortamdaki mekanik ipuçlarının çoğalma, farklılaşma ve göç gibi önemli hücresel süreçler üzerindeki etkisi^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12}. Ne yazık ki, mevcut pek çok yaklaşımın uygulanması zor olabilir veya tfm'nin deneyimsiz araştırmacıların kullanmasını zorlaştıran son derece özel analitik ve hesaplamalı araçlara aşinalık gerektirmektedir. Yüksek iş hacmi ne kadar veri toplama sağlarken, aynı zamanda analizdeki bazı zorlukları ortadan kaldıran bir TFM platformu oluşturmak için bir metodoloji tanımlıyoruz.

Mevcut TFM yaklaşımları arasında, malzeme geriniminin ölçülmesinde en yaygın olarak kullanılan, poliakrilamid (PAA) veya poli gibi deforme edilebilir bir hidrojele küçük floresan belirteçlerin (genellikle nano veya mikrometre boyutunda floresan boncuklar) eklenmesidir. (etilen glikol) diakrilat (PEGDA)^13,14,15. Bu boncuk tabanlı yaklaşımlar, yer değiştirme örneklemesini en üst düzeye çıkarmak için bir ilgi hücresi etrafında fiducial belirteçleri yoğun bir şekilde kümeleme olanağı sağlar. Ne yazık ki, hidrojel boyunca boncuk dağılımı doğrudan bu yüzden mekansal organizasyon rasgele kontrol edilemez. Bu rasgele yerleşim, doğru bir şekilde çözmek için birbirlerine çok yakın boncuklar gibi sorunlara yol açar, ya da böylece substrat yamaları düşük kaliteli veri verim yayıldı. Hücrelerin yokluğunda güvenilir belirteçlerin nerede yattığını tahmin edememe, toplanan her hücre çekiş verisi kümesi için, rahat bir durumda temel işaretçilerin ek bir referans görüntüsünün de yakalanması gereken bir kısıtlama oluşturur. Vurgulanmış görüntüdeki yer değiştirmenin stresli ve vurgusuz görüntüler arasındaki fark olarak yaklaşık olarak tahmin edilebilmeleri için referans görüntüsü gereklidir. Rahat bir duruma ulaşmak için, ölçülen hücreler ya kimyasal olarak rahatya alınır ya da tamamen kaldırılır. Bu süreç genellikle daha fazla deneysel ölçümlerin elde etmesini engeller, uzun süreli hücre çalışmalarını engeller ve iş hacmini sınırlar. Bir referans görüntü de deneme sırasında meydana gelmiş olabilir sürüklenme karşılamak için görüntü kayıt teknikleri gerektirir, genellikle referans görüntüleri stres durumu görüntüleri hantal manuel eşleştirme yol açan.

Referanssız kabul edilen diğer TFM yöntemleri, yüksek çözünürlüklü litografi, mikrotemas baskı veya mikromolding^{16,17,18 ile fiducial belirteçlerin dağıtımı üzerinde bir çeşit kontrol uygulayın ,19,20}. Referanssız TFM, her bir fiducial işaretleyici için rahat durumunun, üretim işlemi sırasında marker konumlarının nasıl reçete edildiğine bağlı olarak tahmin edilebildiği varsayımıyla elde edilir. Bu yöntemler, bir hücrenin gerilim durumunun, fiducial marker geometrisinden çıkarılabilen ima edilen bir referansla karşılaştırıldığında ölçüldüğü tek bir görüntü yakalama içinde tam olarak yakalanmasını sağlar. Marker yerleştirmede tutarlılık genellikle bu platformlar kullanılarak elde edilirken, genellikle yaygın olarak kullanılan boncuk tabanlı yaklaşımlara göre kendi eksikliklerinden muzdariptir: 1) azalmış çekiş çözünürlüğü; 2) uçak dışı yer değiştirmelerin doğruluğunda azalma (bazı durumlarda ölçülemezlik); ve 3) platform yüzeyleri ve malzemelerinin (örn. ligand sunumu, mekanik özellikler) özelleştirilebilirliğini azalttı.

Bu eksiklikleri gidermek için yeni bir referanssız TFM platformu tasarladık. Platform, hidrojel içinde bir florofor küçük bir hacim liorofor küçük bir hacim malzeme gerginliği ölçmek için güvenilir belirteçleri olarak hizmet veren belirli 3D yerlere çapraz bağlantı multifoton aktif kimya kullanır. Bu şekilde, boncuk bazlı yaklaşımlara benzer şekilde çalışan bir platform tasarladık, ancak fiduyal belirteçlerin referanssız malzeme gerinim takibine olanak tanıyan ızgaralı diziler halinde düzenlenmesi nin önemli yararıyla. Bu referanssız özellik birçok avantaj sağlar. Her şeyden önce, hücresel çekiş durumlarının müdahaleci olmayan izlenmesine izin verir (örneğin, yerinden edilmiş fiducial belirteçlerin referans konumlarını elde etmek için hücreleri gevşetme veya kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır). Bu sistemi tasarlamaktaki temel hedefimiz buydu, çünkü yıkıcı son nokta TFM yaklaşımları ile zor olabilecek Diğer aşağı analitik yöntemleri TFM ile birlikte dahil etmeyi amaçladık. İkinci olarak, ızgaralı dizilere dayalı zımni bir referans kullanmak, yer değiştirme analizinin neredeyse tam otomasyonuna olanak sağlar. Dizilerin düzenliliği, olağanüstü durumların (örneğin, suboptimal işaretçi aralığı veya kayıt uyuşmazlıkları gibi beklenmeyen yapıları içeren örnek hücre verilerinin) en az tutulabileceği öngörülebilir bir iş akışı oluşturur. Üçüncü olarak, bir referans görüntü elde etme ihtiyacının aşması, uzun bir süre boyunca tek bir örneküzerinde birçok hücreyi izleme özgürlüğü sağlar. Bu, mikroskobun otomatik sahne hareketlerinin doğruluğuna bağlı olarak konumlandırmadaki hataların birikebileceği ve referans görüntülerin hücre gerilimine düzgün bir şekilde kaydedilmesinin zorluğunu artırabildiği geleneksel boncuk tabanlı yaklaşımlarla tezat oluşturuyor. Görüntü. Genel olarak, bu platform hücresel gerilim verilerinin toplanmasında daha yüksek iş verisi kolaylaştırır.

Bu protokolle okuyucuları, tohumlu hücreler tarafından oluşturulan düzlem içi ve düzlem dışı çekiş bileşenlerini ölçmek için bu referanssız TFM platformünü oluşturmak için uyguladığımız iki fotonlu lazer tarama litografi tekniğini tanımayı umuyoruz. yüzeyinde. Bu protokolde yer almayan bazı monomerik bileşenlerin sentezidir. Genel olarak, bu reaksiyonlar daha önce açıklanan hemen hemen aynı "tek pot" sentez reaksiyon şemaları içerir²¹, ve bu ürünlere alternatifler de satın alınabilir. Ayrıca, ticari olarak kullanılabilen lazer taramalı mikroskopların 3D baskı araçları olarak kullanımını teşvik etmek ve güvenilir işaretli yer değiştirmelerin analizini kolaylaştırmak için oluşturduğumuz yazılım tabanlı araçlarla okuyucuları bilgilendirmeyi amaçlıyoruz.

Protocol

1. BIR PEGDA baz hidrojel fotopolimerizasyonu

1. Toplama Reaktifleri
   1. Collect lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoillphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli (etilen) glikol diacryat (PEGDA), n-vinil pyrrolidone (NVP), AlexaFluor 488 PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiketli PEGDA (PEG-633) ve PEGYlated RGİD peptid ( PEG-RGDS) kendi dondurucularından ve her biri oda sıcaklığına getirmek.
   2. Ayrı kehribar mikrosantrifüj tüplerinde 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 ve 6 mg RGDS peptid ölçün.
2. Ön Polimer Çözeltisinin Hazırlanması
   1. LAP'i 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) olarak çözün. PEGDA'yı eritmek için çözünmüş LAP çözeltisinin 200 μL'sini kullanın. Daha sonra PEG-RGDS'yi eritmek için PEGDA çözeltisinin 200 μL'sini kullanın.
      NOT: Hücre şeklinin kontrolü isteniyorsa, iki foton, lazer tarama litografisi ile ekleneceği için, temel hidrojel ön polimer çözeltisinde PEG-RGDS'nin eritilmesi protokole eklenecektir.
   2. PEG-488'i eritmek için 80 μL PBS kullanın. Bu çözeltinin 2,5 μL'sini ön polimer çözeltisine ekleyin.
      NOT: PEG-488 son hidrojel desenleme sırasında gezinmek için kullanılabilecek bir floresan sinyal verecektir ve konsantrasyon sinyal yoğunluğunu değiştirmek için değiştirilebilir.
   3. Çözeltide bulunabilecek partikülleri gidermek için tam ön polimer çözeltisini 0,2 μm politetrafloroetilen (PTFE) filtreden filtreleyin. Reaktanlar düzgün şekilde sentezlenirse, filtre tıkanmamalıdır.
3. Baz hidrojelfotopolimerizasyon
   1. Pre-polimer çözeltisinin 3 μL'sini ince düz bir perfloroalkoksi alkan (PFA) levhasına yerleştirin. Düz 150 μm kalınlığında polidimethylsiloxane (PDMS) şeritler çevreleyen yerleştirin, ancak temas değil, ön polimer çözelti damla. Bir akrilat-silanized coverslip^{yerleştirin 21,22,23,24} PDMS üzerinde—coverslip altında merkezli ön polimer damlacık ile— kalınlığı na ön polimer damlacık düzleştirmek için PDMS boşluk.
   2. Bir hidrojel tam olarak oluşana kadar sandviç ön polimer solüsyonu UV ışığına maruz bırakın (yaklaşık 1 dk 14 mW/cm² 370-400nm ışık).
   3. Coverslip'i PDMS boşluklarından dikkatlice ayırın ve yüksek performanslı, çift taraflı akrilik yapıştırıcı kullanarak açık alt petri kabına takın. Coverslip, yapıştırıcı ve Petri kabı arasında tam bir mühür oluşturmak için yapışkan temas yüzeyine basınç uygulayın ve camı kırmamaya özen ile uygulayın.
   4. Biyolojik ve partikül kirleticileri en aza indirmek için steril filtreli PBS kullanarak Petri kabındaki hidrojeli durulayın.
   5. İstenilen sayıda hidrojel oluşturmak için gerekli adımları 1.3.1-1.3.4'ü tekrarlayın.
   6. Kalan 800 μL LAP çözeltisine 8 μL NVP ekleyin ve bu çözeltiyi ve çözülmemiş PEG-633'ü desenlenmeye hazır olana kadar saklayın.
      NOT: NVP ile LAP çözeltisi ışığa karşı çok hassastır ve karanlıkta tutulmadığı takdirde polimerleşir. Boruyu alüminyum folyoya sarmak raf ömrünü iyileştirmeye yardımcı olabilir.

2. Desenleme yönergeleri oluşturma

1. İkili görüntü tasarlama
   1. Güvenilir işaretleme dizileri reçete etmek için sanal bir maske oluşturmak için, 100:1 en boy oranına (örneğin, 2000 piksel uzunluğunda x 20 piksel genişliğinde) bir görüntü oluşturmak için görüntü işleme veya çizim yazılımı kullanın.
   2. Görüntünün uzun ekseni boyunca ortalanmış siyah bir arka plan üzerinde 100 eşit aralıklı beyaz pikselden oluşan bir satır oluşturun.
   3. Bu resmi *.tif dosya türü olarak kaydedin.
      NOT: Hücre şekli kontrolü isteniyorsa^{21,25,26,27,28}, ek bir sanal maske oluşturun. Kare şeklinde bir görüntü tuvali kullanın ve siyah bir arka plan üzerinde pozitif beyaz özellikler oluşturun. Beyaz özellikler için uygun bir boyuta yakın olmak için (ki bu da hücre yapışmasını destekleyecektir) görüntünün toplam boyutunun lazer tarama litografisi için kullanılan mikroskobun görüş alanının boyutuna eşdeğer olduğunu varsayalım.
2. İkili görüntüyü dijital maskeye dönüştürme
   1. Yazılım deposu²⁹ücretsiz olarak kullanılabilir LSM-ROI-Generator işlevlerini indirin.
   2. Matlab'ı açın ve indirilen işlev dosyalarının dizinini bulun. Dizine girdiğinde, run_script.m Matlab komut dosyasını açın ve komut dosyasını çalıştırın.
   3. Dönüştürme için ikili *.tif dosyasını seçin. Ardından, bölge dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin.
   4. Seçilen görüntünün istenilen son boyutunu mikronlara girdi. Giriş görüntüsü bu parametrelere uyacak şekilde ölçeklendirilir ve boyutlandırılır. Görüntünün tamamının mikroskobun görüş alanına sığabilmesi için görüntünün toplam boyutu mikroskop görüş alanının boyutundan daha az veya eşit olmalıdır.
   5. YG-Generator Seçenekleri'nde tek bir piksel dizisi oluşturuyorsanız, Küçük Bölgeler/Tek Pikselleraltında Kaldır onay kutusunun işaretini kaldır' dan emin olun, Kareleretiketli onay kutusunu işaretleyin ve Kullanım'ın işaretini kaldırın Yatay Kesme Çizgileri. Ardından Tamam'ıtıklatın.
      NOT: Tek hücre desenleri oluşturmak için bir bölge dosyası oluşturuyorsanız varsayılan seçenekler uygundur.
   6. Daha önce belirtilen klasörde ortaya çıkan *.ovl dosyasını bulun. Bu dosya, iki foton lazer tarama litografisi sırasında lazer panjur kontrol istenen bölgeleri yüklemek için mikroskop getirilmelidir.

3. Fiducial marker dizilerinin imalatı

1. Baz hidrojel ıslatma
   1. Düşük ışık koşullarında, AF633'e (her ikisi de adım 1'de hazırlanır) LAP/NVP çözeltisinin 200 μL'sini ekleyin. Işıktan korurken iyice karıştırın.
   2. Pegda hidrojeliçeren Petri kabından tüm PBS çözeltisini adım 1'den çıkarın.
   3. Çözünmüş PEG-633'ün hidrojeli tamamen temel hidrojeli kapsayan bir damlacık oluşturması için hidrojele ekleyin.
      NOT: Petri kabındaki delik hidrojelden sadece biraz daha büyükse, desenleme çözeltisini tutmak için iyi bir şey yapabilir. Aksi takdirde, desenleme çözeltisi eklemeden önce coverslip tamamen kuru olduğundan emin olun ya da desenleme sırasında susuz hidrojel neden hidrojel kapalı çalıştırabilir.
   4. Petri kabını mikroskop aşamasındaki numune tutucuya yükleyin ve kapağı Petri kabının üzerine yerleştirin. Desenleme çözeltisinin karanlıkta en az 30 dakika hidrojelin içine girmesine izin verin.
      NOT: Mikroskop bu süre zarfında açılabilir ve yapılandırılabilir. Islatma sırasında hidrojel görüntü için 488 nm lazer kullanarak iyidir.
2. Mikroskobun yapılandırılması
   1. 488 nm lazer hattı ve görüntü AlexaFluor 488 için uygun filtreler kullanarak, PEG-488 sinyalini kullanarak hidrojel i bulun. Dedektörden daha uzun emisyon dalga boylarının blok toplanması, peg-633'ün sinyali ile doygunluğa uyacaktır.
   2. Dikey ve yatay karo taramaları kullanarak XY düzleminde hidrojel in merkezini bulun ve sahne konumunu sıfırla.
   3. Hat taramaları ve z-stack işlevini kullanarak hidrojel yüzeyini bulun. Odak pozisyonunu sıfırla. Yüzey konumunu belirlemek ve mikroskop aşaması için ayarlanan vidaları ayarlamak için bu hat taramalarını XY merkezinden uzaklaştırarak hidrojeli seviyelayın.
   4. Mikroskop yazılımı çalışma alanı içinde, fotodesen için ayrı bir deneme dosyası oluşturun. Multifoton gücünü hedefin arka diyafram ında ölçülen 740 nm'de %1,8 (15,5 mW) ve tarama hızını 6'ya (0,1 μm/μs) ayarlayın. Piksel başına 0,1 μm piksel boyutuna ve 100:1 en boy oranına ulaşmak için görüntü çerçevesinin piksel boyutunu ayarlayın.
   5. 2.2. adımda oluşturulan bölgeler dosyasını (*.ovl) bölgeler sekmesine yükleyin. Tüm bölgeleri edinmeye ayarlamak için makro kullanın.
   6. Z-stack işlevini açın ve toplam 28 m derinlik ve toplam 9 z dilimi sayısı için aralığı 3,5 m'ye ayarlayın.
   7. Fiducial marker dizilerinin fotodesenli olacağı hidrojel üzerinde belirli konumları ayarlamak için konumlar işlevini kullanın.
      NOT: Bu pozisyonların z konumu her z yığınının merkez konumunu belirleyecektir; pozisyonları yerleştirirken, her pozisyonun desenli hacmin tüm yüzey konumlarında hidrojelle çakışacağını garanti ettiğinden emin olun.
   8. Her pozisyonda ek satır lar ve sütunlar belirtmek için döşeme işlevini kullanın. Çakışan desenli bölgeleri önlemek için dikkatli olun. İdeal olarak, desenli alanların konumlar arasındaki boş ve kullanılamaz konumları kaldıracak kadar yakın olduğundan emin olun.
3. Fiducial işaretleme dizilerini fotodesenleme
   1. Bekletme süresi 30 dk işaretine yaklaştıkça, sıfırlanmış odak pozisyonuna göre yüzeyin konumundaki değişikliklere bağlı olarak şişme olup olmadığını kontrol etmek için her 5 dakikada bir hidrojel yüzeyinin ardışık z-stack hattı taramalarını yapın.
   2. Yüzey konumunda 5 dakika aralıkta herhangi bir değişiklik meydana gelmezse, adım 3.2.4'te oluşturulan desen ayarlarını yükleyin ve çalıştırın
   3. Desenleme deneyi çalışma tamamlandıktan sonra, hidrojel yüzeyinin desenleme sırasında hareket etmediğini doğrulamak için 488 nm lazeri kullanın.
      NOT: Hidrojelin yüzeyi desenlemeden önceki yle aynı konumda değilse, çeşitli senaryolar vardır. Hidrojel desenleme önce şişme dengesi ulaşmamıştı, hidrojel desenleme sırasında kurumaya başladı, ya da mikroskop z-drift deneyimli. Bu yüzey çevirisinin kaynağı, sonraki desenleme çalıştırmalarında tanımlanmalı ve düzeltilmelidir.
   4. Hidrojeli mikroskoptan çıkarın ve PEG-633 çözeltisini Petri kabından aspire edin.
      NOT: Hidrojel ışığa karşı hala son derece hassastır. Tüm durulama tamamlanana kadar hidrojeli karanlıkta tutmak çok önemlidir.
   5. Hidrojeli steril filtreli PBS ile 3 kez durulayın ve birbirini izleyen her durulama arasında tamamen durulamanın giderilmesini önleyin. Bu üçlü durulayın her 15 dakika 1 saat.
   6. Hidrojelin bir gecede PBS'de durulamasını bekleyin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   7. Hidrojeli PBS ile üç kez durula. Daha sonra hidrojeli 200-proof etanol çözeltisi ile hızlı bir şekilde üç kez durulayın ve ardından PBS ile başka bir üçlü durulama. Hidrojeluzun süre boyunca 200 kanıtı etanol oturup izin vermez.
      NOT: Desenleme çözeltisinin bazı bileşenleri çözeltiden çıkıp hidrojel yüzeyine çökebilir ve 633 nm aydınlatma altında katı bir floresan tabakası (~1-5 mikron kalınlığında) olarak görünebilir. 200 prova etanol ile durulama bu istenmeyen bileşenleri kaldırmak gerekir.
4. Tek hücre desenleri oluşturmak için ardışık fotodesen kullanma (İsteğe bağlı)
   NOT: Hücre yayılma alanı ve şekli üzerinde kontrol isteniyorsa, birden fazla desenleme turu yapılabilir. Baz jel, peg-RGDS'nin ilk formülasyonundan çıkarılmış olmalıdır. Floresan fiduyal belirteçlerin beyazlatma önlemek için fiducial marker dizilerinin desenleme son yapılması tavsiye edilir.
   1. Adım 1'de hazırlanan LAP/NVP çözeltisinde 20 mg PEG-RGDS çözün.
   2. PEG-633 çözümü yerine PEG-RGDS çözeltisini kullanarak 3.1 – 3.3 adımlarını tekrarlayın. Tek hücre desenlerini tanımlayan uygun bölgeler dosyasını kullanın (yönergeler için adım 2'ye bakın).
      NOT: PEG-RGDS desen dizilerini görselleştirmek için çeşitli seçenekler vardır. PEG-RGDS'nin floresan bir varyantı^21,30 veya PEG-RGDS floresan PEG ile kullanılabilir. Önerilen: Alternatif olarak, 488 nm lazer hattı, taban hidrojelinde PEG-488 sinyalini ağartmak için çok foton desenli lazer ile birlikte çalıştırılabilir ve RGDS'nin birleşmesiyle çakışan floresan olmayan bölgeler oluşturulabilir.

4. Fiducial işaretdizilerini görselleştirme

1. Fabrikasyon dizinin z-stack görüntüsünü alma
   1. Petri kabındaki PBS'yi hücre kültürü için kullanılan hücre ortamıyla değiştirin.
      NOT: Fenol kırmızısı serbest ortam fototoksisiteyi önlemek için görüntü edinimi sırasında kullanılması önerilir.
   2. 1 saat ıslatma süresinden sonra, floresan fiduyal belirteçlere uygun bir filtre seti kullanarak hidrojelleri görselleştirmek için yapılandırılmış bir aydınlatma modülü ve yüksek büyütmeli su daldırma objektif lensi ile donatılmış geniş alan floresan mikroskobu kullanın.
   3. Hidrojelin yüzeyinden desenli alanda hidrojele en az 20 μm derinliği kapsayan yüksek çözünürlüklü bir z-im görüntü yığını (Z aralıklı 0,4 m) toplayarak, z yığınının üst limitinin fiziksel olarak en az 1-2 görüntü içerdiğinden emin olun. desenli alan (örneğin, floresan fiducial belirteçlerin artık görünür olmadığı ve sadece gürültünün mevcut olduğu).
      NOT: Bu görüntü yığınının edinimi, tüm desenleme parametrelerinin doğru olduğunu doğrulamak için gereklidir ve adım 5.3'te hücre verileriyle birlikte analiz edilebilir.

5. Fotodesenli hidrojeller kullanarak TFM yapma

1. Tohumlama Hücreleri
   NOT: Kısırlığı korumak için tüm standart doku kültürü uygulamalarını uygulayın.
   1. Hücre tohumlamadan önce, hücre kültürü ve bakımı için ilgili hücre hattı için standart protokolleri izleyin.
   2. (İsteğe bağlı) Hidrojel in sterilitesi bir sorun ise, normal ortam ile durulama ardından antibiyotik içeren medya 24 saat için hidrojel kuluçka.
   3. Tohum hücreleri için, ilk hidrojel Petri kabında kullanılmak üzere medyanın son hacminde trypsed hücreleri yeniden askıya.
   4. Hidrojel çanaktan tüm çözeltiyi çıkarın ve hücre yüklü ortamla değiştirin.
   5. Hidrojel 10 dakika boyunca hücre yüklü ortamda rahatsız edilmeden oturup izin verin.
   6. Petri kabını dikkatlice kuvöze taşıyın. 4 saat veya hücreler gözle görülür bir şekilde yapışAna kadar kuvözdeki hücreleri koruyun.
   7. Bağlı olmayan hücreleri kaldırmak için hücre yüklü ortamı hücre içermeyen ortamla değiştirin.
2. Hücrelerin ve fiducial belirteçlerin görüntülerini edinme
   1. Mikroskoptaki kuluçka odasının sıcaklığını 37 °C ve CO₂ ile %5 arasında ayarlayın ve haznenin belirlenen noktalara ulaşmasını bekleyin.
   2. Petri kabını numune tutucunun üzerine yerleştirin ve desenli alanları bulun.
   3. İlgi çekici bir hücre (COI) bulun ve COI'nin iletilen veya floresan bir görüntüsünü elde edin.
      NOT: Bu görüntü, çözümleme sırasında hücre sınırını segmente etmek için kullanılacaktır, bu nedenle görüntü hücre kartiyalarını açıkça görselleştirmelidir.
   4. Adım 4.1.4'te olduğu gibi COI'nin altındaki desenli diziden bir z yığını edinin.
   5. Hücrenin ikinci bir iletilen veya floresan görüntülerini elde edin.
      NOT: Fototoksisite nedeniyle hücre hasarı nın gözlemlenip gözlenmediğini ve görüntü edinme ayarlarının ayarlanması gerekip gerekmediğini belirlemek için ikinci görüntü kümesini ilk ayarla karşılaştırın. Maruz kaldıktan sonra küçülen hücreler büyük olasılıkla sonuçları etkileyebilecek önemli fototoksik etkilere maruz kalmıştır.
   6. Her COI için 5.2.3-5.2.5 adımlarını tekrarlayın.

6. Görüntülerin Analizi

1. Görüntü dosyalarının analiz için hazırlanması
   1. Adım 5.2'de toplanan verileri kullanarak, bir COI'nin etrafındaki alanın kırpılmış görüntü yığınını, yığının alt görüntüsünün (ilk görüntü) ilk kareyi temsil ettiği şekilde hazırlayın: (1) >Desenli işaretsütunlarının %80'i görünür, (2) en üstteki görüntü (son görüntü) yığında artık görünür fiducial belirteçler (örneğin, hidrojel yüzeyinin üzerinde) içermez ve (3) COI'yi çevreleyen en az 20 μm vurgusuz fiducial belirteç vardır.
      NOT: Görüntüleri kırpma, analiz sırasında hesaplama süresini büyük ölçüde azaltır. Daha sonraki adımlardaki çözümleme kodu görüntüleri kırpmadan çalıştırılabilir, ancak bu önerilmez.
   2. Bir önceki adımda yığının XY kırpma eşleşecek şekilde iletilen ve / veya floresan görüntü kırpılmış bir görüntü oluşturun.
   3. Görüntüyü elle (hücre kenarlığı izleme) veya görüntü işleme araçları yla segmente etmek için kırpılmış iletilen veya floresan görüntüyü kullanın-hangisi hücre şeklini daha fazla temsil ediyorsa).
   4. Bu görüntüyü, hücrenin iç kısmı siyah (yani yoğunluk = 0) ve hücreyi çevreleyen alanın beyaz olduğu (yani yoğunluk - 0) ikili bir görüntüye dönüştürün. Bu görüntüyü İkili Maske.tifolarak kaydedin.
   5. Her COI için, görüntü yığını dosyasını, iletilen resim dosyasını ve ikili maske dosyasını tek bir klasörde toplayın.
2. Görüntülerüzerinde analiz komut dosyaları çalıştırma
   1. ²⁹numaralı yazılım deposunda ücretsiz olarak kullanılabilen TFM analiz fonksiyonlarını klonla veya indirin. Alt klasörlerde önemli sayıda bağımlılık olduğundan, deponun tamamı indirilmelidir.
   2. Matlab'ı açın ve kod deposunun yerel klonunun dizinini ve tüm alt klasörlerini yola ekleyin.
   3. Matlab çalışma alanı içindeki dizini, adım 6.1'de hazırlanan görüntülerin depolandığı klasör konumuna ayarlayın.
   4. Tracking.m komut dosyasını açın ve çalıştırın. İstendiğinde, uygun görüntüleri yüklemek, ilk ön işleme adımlarını gerçekleştirmek ve nesne izleme algoritmasını hata denetimine almak için yönergeleri izleyin.
   5. Komut dosyası tamamlandıktan sonra dispShear.m işlevini açın ve çalıştırın. Bu komut dosyası kullanıcıdan giriş gerektirmemelidir.
   6. DispShear.m komut dosyası tamamlandıktan sonra, disp3D.m'yiaçın ve çalıştırın. Herhangi bir görüntü nün açılması istenirse, yönergeleri izleyin.
      NOT: Çalışma sırasında komut dosyası, kullanıcıdan desenli dizinin görüntüsüne bir çizgi çizmesini isteyebilir. Bu çizgi desenleme sırasında tarama lazerbirincil hareket ekseni temsil etmeli ve desenli fiducial belirteçleri bir satır ile line-up gerekir. Bu işlem, kodu, büyük olasılıkla en hizalanmış fiducial işaretçiler satırlarını hangi yönde (yani, satır veya fiducial işaretçilerin sütunları) vereceğine göre bildirir.
   7. DispShear.m kodu tamamlandıktan sonra, interpFinal3D_2.m kodunu takip dispSurface.m kodunu çalıştırın. Bu komut dosyaları kullanıcıdan giriş gerektirmemelidir.
      NOT: InterpFinal3D_2.m komut dosyası, daha önce³¹olarak tanımlanan harici olarak elde edilen yazılımı kullanarak yer değiştirme verilerini yüzey çekişlerine dönüştürür. Bu dış işlevleri uygulamak için interpFinal3D_2.m, dönüştürme işlevleri için giriş olarak hizmet vermek üzere yer değiştirme verilerini tek düzen ızgaralarına enterpolasyona eder. Farklı bir dönüştürme yöntemi kullanıyorsanız veya çekiş ler gerekli değilse, bu adım atlanabilir.
   8. Tüm komut dosyaları çalıştırıldıktan sonra, tüm verilerin ve çıktıların ilk dizinde bulunabilmesini sağlayın.
   9. Her COI için 6.2.3 – 6.2.8 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Kod deposuiçinde, dizinler listesindeki komut dosyalarının her birinin otomatik toplu olarak çalıştırılabilmesine izin veren komut dosyaları içeren bir klasör bulunur. Otomasyon komut dosyalarının kendileri (yani kod içindeki yorumlar) nasıl kullanılacağına ilişkin talimatlara bakın.

Representative Results

Protokol boyunca, desenleme yordamının kalitesini değerlendirmek için geribildirim sağlayan bir dizi denetim noktası vardır. Bu denetim noktalarının her birinde ilerlemenin nasıl değerlendirilene ne kadar iyi değerlendirildiği hakkında bazı bilgiler sağlamak için, gerçek bir deneyin temsili sonuçlarını sağlarız. Sonuçlar, insan göbek ven endotel hücrelerinin (HUVECs) TFM analizi için hazırlanan fotopatlanmış hidrojel üzerinde yapılan bu protokolün uygulanmasını vurgulamaktadır. Sonuçlar, her kritik adımda ham görüntü verilerinin yanı sıra işlenmiş veri çıktılarını da içerir.

İlk kontrol noktası, fiducial marker dizisi hidrojelde fotodesenlendikten sonra, adım 4'te gerçekleşir. Bir görüntü yığını toplarken, ortaya çıkan görüntüler, görüntü yığını içindeki z konumunun bir fonksiyonu olarak yoğunlukta salınım yapan düzenli bir desenli özellik dizisi(Şekil 1A-C)göstermelidir. Desenli yüzey mükemmel düzeyde değilse, her görüntü diliminin farklı bölgeleri bu salınımlar açısından birbirleri ile faz dışı görünebilir; bu beklenir ve aşırı durumlar dışında analizi etkilememelidir.

Kalan denetim noktaları, belirli bir COI'nin analizi sırasında çalıştırılankomut dosyalarının her birinden çıkan çıktıları kullanır. Tracking.m komut dosyası, ön işleme kalitesini değerlendirmek için floresan fiducial belirteçlerin(Şekil 2A)z-projeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli tanısal görüntüler sağlar, z-pozisyonunun bir fonksiyonu olarak kodlanmış tespit edilen centroids renk bir arsa ( Şekil 2B) nesne algılama kalitesini değerlendirmek için ve nesne izleme kalitesini değerlendirmek için z yönünde(Şekil 2C)sütunlara bağlanan tespit işaretçi santiroidlerini temsil eden bir parça çizimi.

Referans koordinatlarını ve yer değiştirmelerini hesaplamak için gerekli olan doğru 3D santrifüj tespiti için floresan fiduyal belirteçler merkezden radyal olarak azalan yoğunluklu elipsoidal şekillere benzemelidir. Disp3D.m komut dosyası, fiducial marker yoğunluk profillerinin kalitesini değerlendirmek için belirli bir görüntü yığınında(Şekil 3A,B)algılanan özelliklerin her sütunu için z konumunun bir fonksiyonu olarak bir yoğunluk çizimi sağlar. Hem disp3D.m hem de dispShear.m birlikte Kartezyen koordinat boyutlarının her birinde ölçülen yer değiştirme gürültüsünün histogramlarını(Şekil 4A-C)ve yer değiştirmenin enterpolasyonlu ısı haritalarını sağlar (Şekil 4 E,F). Son olarak, interpFinal3D_2.m dış kaynaklı kod kullanılarak hesaplanan yüzey çekişısı haritaları sağlar (Şekil 5)³¹.

Şekil 1: Tipik desenleme sonuçları.
(A) Hidrojel yüzeyinden hidrojel yüzeyinden 12,4 μm'ye kadar Z boyutu nda yoğunluk dalgalanmaları gösteren fiduyal belirteçlerin floresan görüntüleri. (B) İşlenmiş hacimsel bir işleme, fidusikal belirteçlerin elipsoidal şeklini ortaya çıkarır. (C) Hacimsel görüntülemenin kesitli profil görünümleri ham işaret verilerini görüntüler. A,C: Ölçek çubuğu =5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Parçacık izleme algoritmasından tanılama çıktıları.
Nesne algılama ve izleme yazılımı,(A) floresan fiduyal işaretçilerin Z ağırlıklı projeksiyonu ve (B) renk kodlu Z-pozisyonu olan işaretpozisyonlarının dağılım çizimi dahil olmak üzere çeşitli tanısal görüntüler çıkar. (C) Ek bir çıkış,(A)gibi z ağırlıklı bir projeksiyon görüntüler ve her kareden sütunlara bağlı 2B algılamalar bulunur. (D) Daha yakından bakıldığında (B) z-pozisyonuna göre kodlanmış tek tek 2B algılamaları gösterir. C: Ölçek çubuğu =20 μm. C: Ölçek çubuğu =5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 3B yer değiştirme algoritmasından tanılama çıktıları.
(A, B) Çerçeve konumu işlevi olarak işaretyoğunluğundaki çizgi çizimleri, dikey yönde gruplandırılmış işaretçiler arasındaki salınımları görüntüler. Bu çizgi çizimleri, ızgara hizalamanın görüntüleme düzlemi ile nitel olarak değerlendirilmesinin yanı sıra desenli fiduyal belirteçlerin genel kalitesini sağlar. (A) Marker yoğunluğundaki çakışan salınımlar, görüntüleme düzleminin desenli fiducial marker dizileriyle kabul edilebilir hizalamasını onaylar. Z yığınının üst kısmında boş çerçeveler dahil işlem yazılımında bir gürültü eşiği otomatik hesaplama sağlar. (B) Salınımlar arasındaki zayıf çakışma genellikle desenli ızgaraların görüntüleme düzlemi ile kötü hizalanmasının göstergesidir, ancak Aynı zamanda ızgaranın kendilerinin yanlış hizalanmış olduğunu ve kötü sonuçlar verdiğini de gösterebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 2B ve 3B yer değiştirme algoritmalarından tanılama çıktıları.
(A-C) 'Deforme olmayan' (yani yer değiştirme gürültüsü) olarak kabul edilen bölgelerde ölçülen yer değiştirmelerin histogramları, işaretleyici referans konumlarına yakın olmak için hesaplanan referans satırlarının doğruluğunun nicel bir değerlendirmesini sağlar. Yer değiştirme alanları, her ikisinin de(D) düzlem içi (makas) ve(E)düzlem dışı (normal) ölçülen yer değiştirmelerinin görsel bir temsilini sağlar. D: Ölçek çubuğu =20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Çekiş Dönüştürme Algoritmasından Tanılama Çıktıları.
(A-C) Çekiş gerilimleri , (B) toplam çekiş, (C) kesme çekişve (D) normal çekiş belirlemek için enterpolasyonlu deplasman alanları dayalı hesaplanabilir. C: Ölçek çubuğu =20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokolün amacı, TFM verilerinin üretimi ve analizi ile ilgili zorlukların çoğunu hafifleten bir iş akışı sağlamaktır. Bir kez hazırlanan, fotodesenli hidrojeller kullanımı basit, standart doku kültürü uygulamaları ve floresan mikroskopi sadece bilgi gerektiren. Referanssız yönü hücre yüklü hidrojeller üzerinde kaygısız navigasyon sağlar ve referans ve deforme görüntüler arasında görüntü kaydı gibi hantal görüntü işleme adımları ortadan kaldırır. Elde edilen analiz neredeyse tamamen otomatiktir ve tek tek COI'lerden elde edilen veriler 10 dakikadan daha kısa bir sürede baştan sona analiz edilebilir.

Bu protokoldeki başlıca zorluklar fotodesenli hidrojelin imalatından kaynaklanmaktadır. Protokolde kullanılan reaktiflerin çoğu şirket içinde sentezlediğimiz için, sentetik hidrojel malzemeler kullanma konusunda çok az deneyimi olan kullanıcıların bu protokolü denemekten biraz caydırıcı olmalarını bekliyoruz. Bununla, bu protokolde kullanılan PEGylated bileşenlerinin tamamı tek pot reaksiyonları kullanılarak neredeyse aynı protokollerden sentezlenir ve bileşenlerin çoğu ticari satıcılardan satın alınabilir.

Bu protokol aynı zamanda lazer taramalı mikroskopların kullanımı konusunda da biraz ustalık gerektirir. Lazer tarama parametreleri her farklı mikroskop için optimize edilmelidir, lazer yoğunlukları, objektif lensler ve diğer mikroskop bileşenleri, aynı modelin mikroskoplar arasında bile değişir. Fotoğraf desenleme için en iyi mikroskop ayarlarını belirlemek için basit bir yaklaşım çeşitli ayarları ile taramaları bir panel gerçekleştirmektir. Numunenin aldığı toplam lazer maruziyetini etkileyen herhangi bir ayar desenli işaretçilerin boyutunu ve kalitesini etkileyecektir. Bu içerir: tcan hızı, piksel boyutu, ortalama sayı, lazer güç / yoğunluk / fluence, büyütme ve sayısal diyafram^32,33. Genellikle lazer gücü ve taramalar hızını ayarlamak için en kolay ve bu yüzden bu iki parametre ile başlamak için tavsiye edilir. Ayrıca bölge dosyaları oluşturmak için kullanılan yazılım kullandığımız mikroskoplar markası için özel olarak tasarlanmış ve diğer mikroskop yapar ve modelleri karşılamak için artırılmış gerekebilir unutulmamalıdır. Protokolde sağlanan ayarlarla, kullanıcı XY'de 0,84 ± 0,11 μm ve Z'de 3,73 ± 0,30 m tam genişlikte yarım max boyutlarda 3D gaussian benzeri yoğunluk profillerine sahip elipsoidal belirteçler üretmeyi beklemelidir. Nesne algılama algoritması, marker centroids tanımlamak için yoğunluk merkezi-of-kütle kullanır ve belirteçleri yoğunluk belirli bir degrade mevcut en iyi performans gösterecektir.

Hidrojeli düzgün bir şekilde durulamak ve ışıktan ve kirleticimaddelerden korumak hücre kültürü için kritik öneme uygundur. Protokolde belirtildiği gibi, bazı desenbileşenleri çözelti den çökebilir ve hidrojel yüzeyinde birikebilir. Bu bileşenler yüzeyden tamamen durulanmazsa, hücre yapışması tahmin edilemez şekilde etkilenebilir. UV spektrum ışığına maruz kalırsa, küçük dozlarda bile, hidrojel desenleme çözeltisi içinde sırılsıklam iken, desenleme çözeltisi polimerize başlayacak ve kötü sonuçlar verecektir. Son olarak, havadaki partiküller veya filtresiz partiküller, özellikle floresan ise, analizi zorlaştıracaktır. Bu kirleticilerin protokoldeki tüm adımlarda numuneye girmesini önlemek için özel özen gerekir.

Çözümleme kodu, deforme olmuş işaretçiyle aynı satır veya sütundaki deforme olmayan işaretçilerden gelen orijinal diziyi tahmin ederek deforme olmuş fiducial işaretçilerin referans konumlarını tahmin eder. Bu, çözümlemesi büyük ölçüde basitleştirirken, analiz edilebilen veya analiz edilemeyen lere de bazı kısıtlamalar getirse de. En azından, analiz edilen her deforme edilmiş işaretleyici, doğru bir tahmin yapilebilsin diye deforme olmayan sütunve işaretleyici satırının 2 veya daha fazla üyesi olmalıdır. Bir satır, mikroskop üzerinde tek bir satır tarak yazdırılan nokta grubu tarafından tanımlanır ve bir sütun z-stack işlevi kullanılarak tek bir dikey eksen üzerinde desenli işaretler tarafından tanımlanır. Bu, çözümlemesi, desenli her alanın uzunluğuna ve derinliğine göre tek hücre veya küçük hücre kümeleri ile sınırlar. Bu iki desenli bölgeleri mükemmel bir şekilde yan yana koyarak giderilmemektedir dikkat etmek önemlidir. Bunun nedeni, XY bileşenleri nin hizaya girebilse de, numune yüzeyi hem odak düzlemi hem de sahne alanı yla mükemmel bir düzeyde olmadığı sürece dizilerin Z konumsal bileşenlerini mükemmel bir şekilde hizalamak mümkün değildir. Bu sınırlamayı önlemenin en iyi yolu, özellikle yapışma ligand yerleşimini belirleyen ek desenleme turları kullanmaktır. Düzgün hizalanırsa, hücre yapışması desenlerüzerindeki kullanılabilir alanla sınırlandırılabilir.

Analiz kodu, işaretçilerin Z'de yaklaşık 3,5 μm, X ve Y'de 2,1 m aralıklı olduğu kare diziler için optimize edilmiştir. Son boşluk, desenleme doğruluğuna ve şişmeye bağlı olarak değişir, ancak satır içi aralık tutarlıysa bu performansı büyük ölçüde etkilememelidir (satırlar arası boşluk değişkenliği izlemeyi etkilemez). Kod, farklı olarak reçete edilen dizilerde tamamlanmak üzere çalışabilir, ancak diziler burada listelenen parametrelerle eşleşmezse, geçerli durumu kötü sonuçlar verebilir. Analiz kodu için mevcut hedeflerimiz, çekiş yeniden yapılandırma doğruluğunu geliştirebilecek ve kare dizilere kıyasla bölgesel önyargıyı azaltabilecek değişken aralıkların yanı sıra üçgen diziler için destek de eklemektir.

Sonuç olarak, TFM'ye hücresel işlevi bozmadan TFM verilerinin kolay bir şekilde toplanması ve analiz inmesine olanak tanıyan bir yaklaşım salıyoruz. Bu yaklaşımla amacımız, TFM verilerinin çözünürlüğünden ve kalitesinden ödün vermeden daha erişilebilir ve müdahaleci olmayan bir TFM yaklaşımı sunmaktır. Bu metodolojinin hücresel fenotiplerin biyokimyasal bilgisinin hücrelerin gözlenen fiziksel özellikleriyle yakınsamasını teşvik etmesini bekliyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips	in-house	in-house	Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil	3M		Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880	Zeiss		Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter	USCutter	SC631E	Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA	in-house	in-house	Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes	CELLTREAT	229638	8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097358-1004	For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.