Summary
En protokoll for å generere menneskelige primære livmor organoids som består av epitel og stromal celler og beholde egenskapene til de innfødte livmor vevet er presentert. Denne protokollen beskriver metoder fra livmor vev oppkjøpet til histologic behandling av livmor organoids.
Abstract
Den menneskelige endometrium er en av de mest hormonally responsive vev i kroppen og er avgjørende for etableringen av svangerskapet. Dette vevet kan også bli sykt og forårsake sykelighet og til og med død. Modellsystemer for å studere menneskets livmor biologi har vært begrenset til in vitro kultur systemer av enkelt celletyper. I tillegg epitelceller, en av de store celletyper av endometrium, ikke overføres godt eller beholde sine fysiologiske trekk i kultur, og dermed vår forståelse av livmor biologi fortsatt begrenset. Vi har generert, for første gang, livmor organoids som består av både epitel og stromal celler av den menneskelige endometrium. Disse organoids ikke krever noen eksogene stillas materialer og spesielt organisere slik at epitelceller omfatte spheroid struktur og bli polarisert med stromal celler i sentrum som produserer og skiller ut kollagen. Østrogen, progesteron og androgen reseptorer uttrykkes i epitel og stromal celler og behandling med fysiologiske nivåer av østrogen og testosteron fremme organiseringen av organoids. Denne nye modellen systemet kan brukes til å studere normal livmor biologi og sykdom på måter som ikke var mulig før.
Introduction
Den menneskelige endometrium linjene livmorhulen og fungerer som den første kontakten for fosteret under implantation. Endometrium består av luminal og kjertel epitelceller, støttende stromal fibroblaster, endothelial celler og immunceller. Sammen, disse celletyper utgjør livmor vevet som er en av de mest responsive vev til sex steroid hormoner1. Endringene som skjer under hver menstruasjonssyklus er slående. Hensiktsmessig vekst og ombygging av endometrium er nødvendig for å muliggjøre embryo implantation å forekomme. Avvikende respons på østrogen og progesteron kan resultere i en ildfast endometrium som ikke tillater for vellykket etablering av graviditet og kan også føre til sykdommer, inkludert livmor neoplasi.
For å studere hormon responsen og vesentlige endringer som oppstår i endometrium, celler fra livmor vev excised fra pasienter under kirurgi eller livmor biopsi har blitt spredd i cellekultur. Livmor stromal celler fortrinnsvis sprer og spres lett, og prosessen med differensiering indusert av progesteron kan være sammenfattet in vitro. Som et resultat, har mye blitt lært i løpet av denne differensiering prosessen, kalt decidualization2,3. Den andre store celletypen i endometrium, luminal og kjertel epitelceller, men ikke vokser vel som tradisjonelle monolagere, mister polaritet, blir senescent, og har begrenset proliferativ potensial. Som et resultat, er mindre kjent av deres biologi og deres rolle i den menneskelige endometrium. Ettersom mange neoplasi stammer fra epitelcellene, er mekanismer forbundet med prostatahyperplasi eller transformasjon til kreftceller fortsatt å være fullt definert. Videre har studier fastslått at hormon responsen innebærer intime paracrine handlinger mellom epitel og stromal celler i endometrium4,5.
Nylig, en tredimensjonal (3D) organoid kultur av livmor epitelceller ble etablert av to uavhengige grupper6,7, som er de første rapportene av organoids dannet av livmor vev. Disse organoids var sammensatt av livmor epitelceller innebygd i et protein matrise (tabell over materialer) og ikke inkludere en viktig hormonally responsive kupé av livmor endometrium, den stromal fibroblaster. Som matrisen proteiner kan variere fra mye til mye og kan utløse signalering trasé som ikke nødvendigvis forekommer i vevet, ville det være ideelt å erstatte matrisen proteiner med komponenter av endometrium. I dagens studie, en protokoll for å generere stillas frie menneskelige livmor organoids av epitel og stromal celler av den menneskelige endometrium presenteres. Tilstedeværelsen av stromal celler ikke bare gir støtte for epitelceller, men gir også de nødvendige paracrine handlinger som er etablert for å være viktig for livmor hormon respons4,8,9 .
Den nye flercellede livmor organoid tilbyr en modell system av endometrium som er enkel å generere og som inkorporerer både epitel og stromal celler. Disse organoids kan brukes til å studere langsiktige hormonelle forandringer og tidlige hendelser av sykdom som tumorigenesis på grunn av hormonell ubalanse eller eksogene fornærmelser. Kompleksiteten i disse organoids kan etterhvert utvides til å omfatte andre celletyper, inkludert endothelial og immunceller med muligens myometrielle celler for å virkelig etterligne menneskelig vev fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Livmor prøvene ble samlet inn fra premenopausale kvinner under rutinemessig hysterektomi for godartet livmor forhold ved Northwestern University Prentice Women ' s Hospital, ifølge en institusjonell gjennomgang Board-godkjent protokoll. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle kvinner inkludert i studien.
1. utarbeidelse av Agarose muggsopp
- Før begynnelsen celle isolasjon, støpt og likevekt 1,5% agarose mikro muggsopp (tabell av materialer) for å huse organoids i henhold til produsentens instruksjoner.
2. generering av livmor Organoids
- Harvest primære stromal og epitelceller
- I et biosafety kabinett ved hjelp av aseptisk teknikk, klargjør enzym løsning (2,5 mg/mL kollagenase type I + 0,1 mg/mL DNase i 10 mL dispase [500 enheter]) ved 37 ° c, og steril filter løsningen ved hjelp av et sprøyte filter med 0,2 μm i et 15 mL konisk rør.
- I en biosafety kabinett ved hjelp av aseptisk teknikk, skrape av endometrium fra livmor biopsier og hakke vev under panseret i svært små biter med en skalpell.
Merk: Livmor vev som er minst 20 mm x 10 mm x 1 mm er nødvendig for å generere tilstrekkelig antall organoids. - Sett ferskt hakket vev inn i enzymet løsningen i en 15 mL konisk rør. Lukk hetten og pakk toppen med en voks film (tabell av materialer) for å hindre forurensning.
- Sett røret med vev i et vannbad eller en inkubator ved 37 ° c i 30 minutter med lett risting (80 − 100 RPM).
- Stable et 100 μm celle sil på toppen av et 20 μm celle sil på en 50 mL konisk rør. Filtrer løsningen gjennom de to siler, og skyll deretter 15 mL konisk slange med 10 mL av Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS; Tabell med materialer) og sette vask gjennom sil for å sikre at alle cellene er samlet.
Merk: Flyt-gjennom væsken inneholder stromal celler og røde blodlegemer (~ 20 mL totalt). Epitelceller er samlet på 20 μm sil. Biter av ufordøyd vev forbli på toppen av 100 μm sil. Kast ufordøyd vev i en avfallsbeholder for farlig biologisk avfall. - Inverter celle sil 20 μm fra trinn 2.1.5 til en ny 50 mL konisk slange og vask epitelcellene av sil med 20 mL organoid Media (tabell over materialer) supplert med 1% penn/strep.
- Sentrifuger de koniske rørene fra trinn 2.1.5 og 2.1.6 ved 500 x g i 5 min.
- Med de innsamlede stromal cellene fjerner du supernatanten og resuspend pellet med 10 mL rød blod cellelyse buffer. Ruge ved 37 ° c i 10 − 15 min. sentrifuger det koniske røret ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend pellet med 200 − 300 μL av organoid medier (se trinn 2.2.2 for videre instruksjoner).
- Med de innsamlede epitelcellene, Fjern supernatanten og re-suspendere med 100 μL av organoid medier (se trinn 2.2.2 for videre instruksjoner).
- Seeding celler
- Etter equilibrating den 1,5% agarose muggsopp i brønner (1 mold per brønn) av en 24-brønn plate, fjerne organoid medier på utsiden av agarose formene og vippe vevet kultur platen slik at mediet fra cellen seeding kammer av agarose retter kan også være forsiktig fjernet.
- Se epitel (fra trinn 2.1.9) og stromal (fra trinn 2.1.8) celle suspensjoner under mikroskopet. Legg til flere organoid medier til enten epitel eller stromal celle suspensjoner 100 μL om gangen, slik at suspensjoner er omtrent like i tetthet.
Merk: Epitelceller vil klump sammen, og det er ikke tilrådelig å fordøye/trypsinize epitelceller til enkelt celle suspensjoner. - Kombiner 1 del av stromal celler med 3 deler av epitelceller etter volum.
- Pipetter 50 μL (60 000 celler) av den kombinerte celle fjæringen inn i celle seeding kammeret i agarose mold.
- Når agarose formene er fylt med celler, forsiktig tilsett 400 μL av fersk organoid Media i brønnen av 24-brønn plate.
Merk: Mediet når like under overflaten av agarose retter og vil ikke føre til at cellene flyte ut av formene. Etter 2 − 3 dager vil celler utligne og begynne å danne organoids. - Bytt medium annenhver dag med 500 μL av organoid medier.
- Etter 2-3 dager, endre medium til en som er supplert med 0,1 nM østradiol (E) og 0,8 nM testosteron (T) for å fremme organisering av epitel og stromal celler.
Merk: Selv om organiseringen av epitel og stromal celler kan oppstå med eller uten hormoner, mer organoids vil organisere i nærvær av hormoner.
3. høsting av livmor Organoids for eksperimenter
Merk: Etter at eksperimentet er gjort, kan livmor organoids behandles for histologi eller RNA analyse. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du behandler organoids.
-
Histologi
- Løs opp 1,5% agarose i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved koking. La væske agarose avkjøles til ca. 50 ° c.
- Under en dissekere mikroskop, vippe 24-brønn plate og nøye pipette ut mediet fra utsiden av agarose mold. Forsiktig pipette ut mediet fra det indre av agarose mold for å unngå å forstyrre organoids.
- Under et dissekere mikroskop kan du nøye Pipetter 70-75 μL av varm (50 ° c) 1,5% agarose inn i kammeret til agarose parabolen. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer organoids.
- Avkjøl ved 4 ° c i 5 min.
- Tilsett 4% paraformaldehyde (PFA) i hver brønn av 24 brønn platen og fest hele den forseglede agarose formen som inneholder organoids over natten ved 4 ° c. Deretter lagres det i 70% etanol ved 4 ° c til den er klar til prosess for å bygge parafin.
-
RNA-isolasjon
- Under en dissekere mikroskop, vippe 24-brønn plate og nøye pipette ut mediet fra kammeret i agarose mold.
- Kraftig pipette 1 mL fersk organoid medium direkte inn i agarose mold slik at organoids spyles ut av microwells. Vær forsiktig så du ikke lage for mange bobler.
- Gjenta pipettering igjen med samme medium fra trinn 3.2.2.
- Samle alt mediet som inneholder organoids. Sentrifuger med maks hastighet for å samle inn organoids og Fortsett til RNA-ekstraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk av protokollen er avbildet i figur 1. Livmor vev ble innhentet fra kirurgi etter at det ble undersøkt av patologer. Den livmor fôr ble skilt fra myometriet ved skraping og livmor vevet ble enzymatisk fordøyd til celler som beskrevet i protokollen. Epitel og stromal celler ble tilsatt i microwells i agarose formene. Etter 7 dager i kulturen ble organoids behandlet med E og T i ytterligere 7 − 14 dager.
For histologiske behandling, agarose muggsopp som inneholder livmor organoids ble beseglet med agarose etterfulgt av fiksering med 4% PFA over natten. Disse formene ble behandlet for standard para fin innebygging, delt og beiset for histologi, immunofluorescence eller immunhistokjemi. Hematoksylin og eosin (H & E) farging (figur 2A) avdekket en spheroid-lignende struktur med et enkelt lag av celler lining utsiden og cellene i midten. Cell-spesifikke markører for livmor epitel (E-cadherin) og stromal celler (vimentin) avslørte epitelceller rundt organoid med stromal celler i sentrum (figur 2B).
Markører av livmor fysiologi bekreftet at livmor organoids beholdt visse egenskaper av det innfødte vevet. Trichrome farging, som flekker kollagen blå og celler rød, viste tilstedeværelsen av kollagen i sentrum der stromal celler bodde, demonstrere aktiv produksjon og sekresjon av kollagen ved stromal celler som ligner på det innfødte vevet (Figur 3 A). I tillegg, immunhistokjemiske farging avslørte tilstedeværelsen av østrogen-reseptorer (ER), androgen reseptorer (AR), og progesteron reseptorer (PR) i både epitel og stromal celler (Figur 3B).
Figur 1: generering av stillas fri 3D livmor organoids fra humant primære livmor celler. Livmor vev ble innhentet fra premenopausale livmor vev med godartet patologi og livmor foring ble excised fra vevet stykke. Ved enzymatisk fordøyelse, livmor epitel og stromal celler ble sådd i 1,5% agarose muggsopp på en 3:1 ratio av volum og vedlikeholdes i kjønnshormonet-fri medium for opptil 7 dager. Østradiol (E) og testosteron (T) ble lagt til 3D-kulturer å etterligne nivåene av E og T under den follikulær fasen av en menstruasjonssyklus10 og å fremme organisering av organoids. Tilpasset fra Teerawat et al., JCEM, (2019)11.
Figur 2: histologi og immunofluorescent farging av celle spesifikke markører på livmor organoids. Organoids ble observert etter 14 dager med trinnvis Hormone behandling etterligne den follikulær fasen av en normal menstruasjonssyklus (0,1 nM E og 0,8 nM T for 7 dager, 1 nM E og 0,8 nM T for ytterligere 6 dager, etterfulgt av 1 nM E og 1,25 nM T for 1 dag). (A) H & E farging ble gjort på parafin embedded organoids. (B) celle spesifikke markører ble vurdert av immunofluorescent farging av E-cadherin (epitel, rød), vimentin (stromal, grønn) og 4 ', 6-diamidino-2-PHENYLINDOLE (DAPI; nucleus, blå) som avslørte strukturell organisering av cellene i organoids. Scale bar = 20 μm. tilpasset fra Teerawat et al., JCEM, (2019) <11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: livmor organoids utstillingen egenskaper innfødte vev etter 14 dager follikulær fase Hormone behandling. (A) Trichrome farging ble gjort for å visualisere kollagen (blå) og celler (rød). Trichrome flekken ble utført på livmor vev (venstre panel) og livmor organoids (skala bars = 20 μm, høyre panel). (B) immunhistokjemiske FARGING for er, AR og PR ble gjort i livmor vev (Scale bar = 100 μm bunn paneler) og livmor Organoids (Scale bar = 20 μm, topp paneler). Positiv flekk er vist i brunt og hematoksylin flekken løsning ble tilsatt som telleren flekken vist i blått. Tilpasset fra Teerawat et al., JCEM, (2019)11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har generert menneskelige livmor organoids består av epitel og stromal celler i endometrium uten bruk av eksogene stillas materialer. Mens det allerede er vist at primære livmor epitelceller kandanne organoids,var disse cellene innebygd i en geléaktige matrise av proteiner utskilles av mus sarkom celler (se tabell over materialer) for å hjelpe form spheroid strukturer. I tillegg var livmor stromal celler fraværende. Vi spekulerer i at de stromal cellene i vårt system, som er en viktig støttende komponent i livmor vevet, forutsatt at stillaset for epitelceller å følge og paracrine signalering skjedde mellom celletyper. Organiseringen av epitelceller rundt stromal cellene indikerte en aktiv interaksjon mellom de to celletyper som ga fysiologiske signaler. Som hormonell respons av endometrium er avhengig av paracrine interaksjoner mellom epitel og stromal celler4,8,9, våre flercellede organoids gi en alternativ, mer kompleks etterligne av de innfødte Vev.
Organoids som ble generert her var for det meste somatiske celler, selv om en liten prosent av cellene var stilk-like. Vi har ennå ikke passert disse organoids for flere generasjoner, og vet ikke om de ville overleve og spredd. I tillegg er livmor organoids er heterogen i naturen i at ikke alle organoids inneholdt samme antall epitel, stromal eller stamceller, selv de som stammer fra samme vev. Størrelser av organoids også forskjellig og mens de fleste celler dannet spheroid som strukturer, løse celler i hver mikrotiterplateleser ble observert. Tilstedeværelsen av E og T syntes å fremme organoid formasjon med den spesifikke organiseringen av epitelceller lining utsiden og stromal celler i sentrum. Vi har ikke testet om E eller T alene ville fremme organoid formasjon og hva den optimale lengden på behandlingen ville være. Ytterligere testing av parametre og forhold vil være fordelaktig å generere den ideelle livmor organoids egnet for eksperimentet planlagt.
Medium er en viktig komponent i dyrking organoids for å fremme vekst og overlevelse. Fra vår erfaring i å arbeide med livmor celler, vekst av epitelceller i kulturen er den mest utfordrende i motsetning til stromal celler som overføres godt. Ulike medier ble testet, inkludert organoid Media av valget (tabell over materialer), som brukes til å generere mammospheres og tumorspheres av brystkreft, som er av epitel celle opprinnelse. Testene våre avslørte at dette mediet tillot organoids å opprettholde sin strukturelle integritet og levedyktighet i løpet av 14 − 28 dagers kulturer. Effekten av dette mediet på stromal celler, men trenger ytterligere etterforskning. Til tross for deres overlevelse og produksjon av kollagen i organoid Media, ble sprednings raten observert i 3D-kulturen mye mindre enn i monolagere. Den reduserte spredningen kan imidlertid være på grunn av 3D-strukturen også. Gitt at de organoid mediene som brukes er kommersielt tilgjengelig, medium komponenter er fortsatt uklart på grunn av sin proprietære natur.
I fremtidige studier, vi ser for oss å øke kompleksiteten i disse livmor organoids å innlemme andre celletyper funnet i endometrium, inkludert endothelial og immunceller. Dette er bare begynnelsen på engineering en komplett livmor etterligne som kan brukes til å studere biologi, funksjon, sykdom, og for å teste narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) og Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi ønsker å anerkjenne den nordvestlige patologi kjerne anlegg for behandling av faste organoids for para fin innebygging. Vi vil gjerne erkjenne hele UG3 team inkludert Woodruff, Burdette, og Urbanek Labs for innsiktsfulle diskusjoner og samarbeid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
