Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للجيل القابل للاستنساخ من الخصية الوركية مع بنيه نسيجيه خاصه بالخصية باستخدام نظام الاستزراع المجهري المتوفر تجاريا.
Abstract
Organoids هي ثلاثه هياكل الابعاد تتالف من أنواع الخلايا المتعددة التي هي قادره علي تلخيص هندسه الانسجه ووظائف الأعضاء في الجسم المجري. وقد فتحت تشكيل الهيكل التنظيمي سبلا مختلفه للبحوث الاساسيه والانتقالية. في السنوات الاخيره ، وقد حصلت organoids الخصية الاهتمام في مجال البيولوجيا الانجابيه الذكور. الخصية العضوية تسمح للدراسة من التفاعلات خليه الخلية ، وتطوير الانسجه ، والخلية الجرثومية البيئة الدقيقة المتخصصة وتسهيل الانتاجيه العالية المخدرات والسمية الفرز. وهناك حاجه إلى طريقه موثوق بها والتكرار توليد العضوية الخصية مع الهيكل الانسجه المحددة الخصية. يحتوي نظام الثقافة microwell علي مجموعه كثيفه من ميكروويلس علي شكل هرم. خلايا الخصية المستمدة من الخصيتين قبل البلوغ طرد في هذه الميكروويلس ومثقف لتوليد organoids الخصية مع البنية الانسجه الخاصة بالخصية والجمعيات الخلية. يمكن توليد آلاف من العضويات المتجانسة عبر هذه العملية. سيكون البروتوكول المذكور هنا موضع اهتمام واسع للباحثين الذين يدرسون تكاثر الذكور.
Introduction
في السنوات الاخيره ، كان هناك تجدد الاهتمام في ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي. وقد تم اشتقاق أجهزه مختلفه مثل الأمعاء1، المعدة2، البنكرياس3،4، الكبد5، والدماغ6 بنجاح إلى أنظمه organoid 3d. هذه العضوية لديها أوجه التشابه المعمارية والوظيفية للأعضاء في الجسم الحيوي وأكثر اهميه بيولوجيا لدراسة البيئة المجهرية الانسجه من النظم الثقافية أحاديه الطبقة7. ونتيجة لذلك ، وقد بدات organoids الخصية لكسب الفائدة كذلك8،9،10،11،12. معظم الطرق المبلغ عنها حتى الآن هي معقده, غير عاليه الانتاجيه10 وتتطلب أضافه البروتينات ECM8,10. هذا التعقيد يؤدي أيضا إلى مشاكل مع استنساخ. وهناك حاجه إلى طريقه بسيطه وقابله للاستنساخ التي تسمح للجيل من الخصية العضوية مع الجمعيات الخلية التي هي مثل الخصية في الجسم الفيفو.
وقد أبلغنا مؤخرا عن نظام لمعالجه هذه المتطلبات12. باستخدام خنزير كنموذج ، استخدمنا الطرد المركزي القسري نهج التجميع في نظام microwell. في ال [ميكروسس] نظامه, يحتوي كل بئر [ا لرج نومبر] من متماثلة صغيره ميكروويلس13. هذا يسمح للجيل من يتعدد خزان من حجم متسقة. وقد مكن نظام microwell من توليد اعداد كبيره من الهيكل التنظيمي الموحد مع بنيه خاصه بالخصية. النظام بسيط ولا يتطلب أضافه بروتينات ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: تم الحصول علي الخصيتين من الخنازير التي تبلغ من العمر أسبوعا واحدا من مزرعة خنازير تجاريه كمنتج ثانوي من خصاء الخنازير التجارية. تمت الموافقة علي مصادر الخصيتين من قبل لجنه الرعاية الحيوانية في جامعه كالغاري.
1. اعداد حلول الانزيم لهضم الانسجه
ملاحظه: هناك حاجه إلى ثلاثه حلول الانزيميه المختلفة ، والتي تشمل اثنين من الحلول الرابعة كولاجيناز مختلفه (الحل A ، B) والحل deoxyribonbenase i (dnase 1).
- لاعداد الحل A ، حل 20 ملغ من كولاجيناز IV S (جدول المواد) و 40 ملغ من كولاجيناز iv W (جدول المواد) في 25 مل من الجلوكوز العالي دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem). ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm. أضافه 0.4 مل من مصل الأبقار الجنينية (الدم) للحل A لمنع النشاط التريبسين.
- لاعداد الحل ب ، حل 80 ملغ من كولاجيناز IV W (جدول المواد) في 40 ML من dmem. ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm.
- لاعداد DNase انا الحل (7 ملغ/مل) ، حل 70 ملغ من DNase انا في 10 مل من DMEM. ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm.
ملاحظه: تركيز الانزيم للحلول الرابعة كولاجيناز المبينة هنا ، يختلف من تركيزات (2 مغ/مل) المذكورة في المادة14الاصليه. وينتج البروتوكول الحالي خلايا ذات قدره اعلي قليلا علي البقاء. ومع ذلك ، فان الخلايا المعزولة بواسطة كلا البروتوكولين تنتج organoids ذات بنيه نسيجيه متطابقة.
2. الخصية الهضم الانزيمي الانسجه
- جمع الخصيتين في كوب معقمه ويغسل مع الفوسفات مخزنه المالحة (برنامج تلفزيوني) التي تحتوي علي 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (P/S). بعد الغسيل ، نقل الخصيتين إلى صحن ثقافة الانسجه مم 100 مع برنامج تلفزيوني يحتوي علي 1 ٪ P/S وأزاله غلاله المهبل والبربخ باستخدام مقص الاوتوكلاف وملقط. نقل الخصيتين معزولة إلى طبق جديد 100 مم ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني يحتوي علي 1% P/S.
- للمحافظة علي العقم ، استخدمي مجموعه أخرى من المقصات المعقمة والملقط لتقشير الخصيتين للخروج من البوغينيا التونيكا. قطع الخصيتين علي طول المحور الطولي مباشره تحت tunica. ثم قشر الخصيتين من غلاله باستخدام اثنين من ملقط ومكان في صحن جديد 100 مم يحتوي علي 1 مل dmem مع 1% P/S.
- المفروم الخصيتين مقشر مع مقص العقيمة في قطع الانسجه مم 1-2. بعد التقطيع ، استخدم ملقط معقم لأزاله الشظايا البيضاء من النسيج الضام.
- نقل قطع الانسجه المفرومة إلى الحل a واعليه يصل إلى 50 mL مع dmem للحصول علي تركيز 0.4 ملغ/مل ل كولاجيناز iv S (جدول المواد) وتركيز 0.8 ملغ/مل ل كولاجيناز iv W (جدول المواد). مكان الحل A تحتوي علي قطع الانسجه في حمام ماء 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، وعكس بلطف أنابيب كل 5 دقائق والتحقق بصريا للإفراج عن الحمض النووي.
- أضافه 500 μL من DNase انا إذا لوحظ الحرة الحمض النووي العائمة. بعد 30 دقيقه ، الطرد المركزي أنبوب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant.
ملاحظه: الحمض النووي سيظهر كماده غائمة. عندما تهتز الأنابيب ، تستقر قطع الانسجه في حين ان الحمض النووي سيبقي واقفا علي قدميه.
- أضافه 500 μL من DNase انا إذا لوحظ الحرة الحمض النووي العائمة. بعد 30 دقيقه ، الطرد المركزي أنبوب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant.
- أضافه الحل B إلى أنبوب واعلي تصل إلى 50 mL مع DMEM للحصول علي تركيز 1.2 ملغ/مل من كولاجيناز IV W (جدول المواد). وضع أنبوب في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده 30 دقيقه وعكس بلطف أنبوب كل 5 دقائق. أضافه 500 μL من DNase انا إذا لوحظ الحرة الحمض النووي العائم.
- بعد 30 دقيقه ، الطرد المركزي أنبوب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه. بعد ذلك تجاهل ماده طافي ويغسل مره واحده مع برنامج تلفزيوني مع 1 ٪ P/S.
ملاحظه: ستحتوي المواد الفائقة المهملة من كلا الحلين A و B علي خلايا بينيه في المقام الأول. - اعلي الأنبوب مع تلفزيوني يصل إلى 50 mL. جمع بعناية الأنابيب من اعلي ومكان في أنبوب 50 mL جديده.
ملاحظه: الأجزاء الكبيرة من الانسجه غير المهضومة تستقر بسرعة في الجزء السفلي ، في حين ان الأنابيب المنوية المهضومة ستبقي في التعليق. لا ينبغي جمع شظايا الانسجه الكبيرة. ويمكن تكرار هذا الاجراء عده مرات حتى الحل في الأنبوب الأصلي هو واضح تقريبا وفقط شظايا الانسجه غير المهضومة المتبقية ، والتي يمكن التخلص منها. - الطرد المركزي الأنابيب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant. أضافه تلفزيونيه جديده والطرد المركزي مره أخرى. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
- بعد غسل تلفزيوني الماضي ، وأزاله ماده طافي وأعاده تعليق الأنابيب المنوية في 5 مل من تلفزيوني. ثم أضافه 15 مل من 0.25 ٪ التريبسين-ايثيلنديدياتيتاياستيك حمض (أدتا) إلى الأنابيب. وضع أنبوب في 37 درجه مئوية حمام المياه وعكس بلطف كل 2 دقيقه. إذا لوحظ الكثير من الحمض النووي العائمة الحرة ، أضافه 500 μL من DNase I مع 5 مل من DMEM.
- تقييم الهضم الانزيمي من الأنابيب إلى خلايا واحده تحت المجهر (الأول بعد 5 دقائق ، ثم كل 2 دقيقه). إذا كان يمكن الكشف عن خلايا واحده في الغالب ، ووقف رد فعل مع 5 مل من وفلتر من خلال شبكه 70 μm ومن ثم من خلال شبكه 40 μm.
ملاحظه: ينبغي الحرص علي ان القبعات علي أنابيب 50 mL المستخدمة لهضم (الحل A ، B و 0.25 ٪ تريبسين-أدتا) يتم تشديد بشكل صحيح. إذا كان التلوث في حمام المياه هو مصدر قلق ، قد تكون ملفوفه فيلم البارافين حول الغطاء لضمان العقم. - الطرد المركزي الخلايا الواحدة في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في وسط الإثراء (دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة F/12 (Dmem/F12) التي تحتوي علي 5 ٪ من الطراز الأول و 1 ٪ P/S) وحساب عدد الخلايا قابله للحياة. هذه هي الخلية البداية السكان. إصلاح 100 x 103 خلايا وأداء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية UCHL1 (اوبيكويتين C-الطرفية Hydrolase L1) كما هو موضح12 وتحديد النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذه الخلايا البداية السكان.
ملاحظه: يمكن أيضا استخدام علامة الخلية الجرثومية برويلتيتيك ابيضاض الدم الزنك البروتين الاصبع (PLZF)15 كبديل مناسب ل UCHL1. في الخلية البداية السكان ، والعائد الخلية المتوقعة حول 700-800 x 109/g من الانسجه. وينبغي ان تكون النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذا العدد من الخلايا 4-5 في المائة. - وضع حوالي 20 × 106 من هذا السكان خليه البداية في اثنين من المرفقات منخفضه جدا 100 mm الاطباق بيتري (10 × 106 الخلايا المعلقة في 10 مل من dmem/F12 التي تحتوي علي 1% P/S في كل طبق) لمده 2 أيام في حاضنه الانسجه ثقافة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، 21 ٪ الأكسجين). اجراء تخصيب الخلايا الجرثومية مع الخلايا المتبقية.
ملاحظه: لضمان السلامة المثلي ونوعيه الخلية ، في حين ان تخصيب الخلايا الجرثومية والكمية اللاحقة يحدث ، يتم وضع السكان خليه البداية في الثقافة في الاطباق المنخفضة جدا المرفقات ثقافة الانسجه لمده 2 أيام.
3-إثراء الخلايا الجرثومية
ملاحظه: الاجراء الموصوف أعلاه ينتج في المقام الأول خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية. خصائص التصاق مختلفه تسمح للفصل بين خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية عن طريق الطلاء التفاضلي.
- البذور 20-25 x 106 خلايا من السكان خليه البداية لكل 100 ملم الانسجه ثقافة الطبق في الحجم الإجمالي لل 8 مل من الإثراء المتوسطة (Dmem/F12 مع 5% المدفع و 1% P/S) للطلاء التفاضلي. وضع الخلايا في حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، 21 ٪ O2) وبعد 1.5 h ، وضمان ان معظم الخلايا سيرتولي نعلق علي لوحه.
- جمع والجمع بين ماده طافي (التي تحتوي أساسا علي الخلايا الجرثومية) من 2 لوحات للوحه واحده جديده 100 مم ووضعه مره أخرى في الحاضنة. بعد 1 ح ، مره أخرى الجمع بين ماده طافي من 2 لوحات إلى لوحه جديده مم 100. وضع لوحات مره أخرى في الحاضنة لليله وضحيها.
ملاحظه: ستحتوي المواد الفائقة مجتمعه في المقام الأول علي خلايا جرثوميه. الخلايا الملتصقة التي يتم تجاهلها مع لوحات هي في المقام الأول خلايا جسديه الخصية مثل سيرتولي و بيريتوبولار myoid الخلايا. - جمع الخلايا الجرثومية المخصب في اثنين من الكسور علي النحو التالي.
ملاحظه: الخلايا الجرثومية المخصبة تلتزم بشكل مختلف ، وكسر غير ملتصقة وجزء التمسك قليلا. كلا هذه الكسور تشكل معا سكان الخلايا الجرثومية المخصب- كسر غير ملتصقة: جمع سوبرناتنت.
- كسر ملتصقة قليلا: غسل لوحات برفق مع تلفزيوني ، وعلاج مع 2 مل من 1:20 التخفيف من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة ، ووقف رد الفعل مع 2 مل من الإثراء المتوسطة وجمع في نفس الأنبوب كجزء غير ملتصقة.
ملاحظه: 0.25 ٪ تريبسين-أدتا يحتاج إلى ان تضعف مع تلفزيوني لإنتاج حل التريبسين 1:20.
- حساب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام عداد خليه ، وإصلاح 100 x 103 خلايا وتنفيذ المناعية لعلامة الخلية الجرثومية UCHL1 كما هو موضح12 وتحديد النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذه الخلايا المخصب السكان.
ملاحظه: يجب ان تكون النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذا العدد من الخلايا 60-70% علي الأقل. منذ المناعية للقياس الكمي سوف تتطلب 1 يوم ، يجب وضع الخلايا المخصب في المرفق منخفضه جدا 100 mm طبق بيتري مع DMEM/F12 تستكمل مع 1 ٪ P/S لمده لضمان جوده الخلية الأمثل والقدرة علي البقاء.
4. اعداد الخلايا لبذر
- لحصاد اعداد خليه البداية ، وجمع ماده طافي في أنبوب 50 mL من المرفقات منخفضه جدا 100 mm الاطباق. غسل لوحات بقوة مع تلفزيوني لجمع الخلايا الملتزم بها. لا حاجه إلى الهضم الانزيمي.
ملاحظه: بعض خلايا الخصية ، في المقام الأول خلايا سيرتولي ، يمكن ان تلتزم قليلا إلى لوحات المرفقات منخفضه جدا. - الجمع بين اعداد خليه البداية والخلايا الجرثومية المخصب للحصول علي اعداد خليه العمل التي تحتوي علي 25 ٪ من الخلايا الجرثومية. أجهزه الطرد المركزي في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في تشكيل المتوسطة (dmem/F12 تستكمل مع الانسولين 10 ميكروغرام/مل ، ترانسفيرين 5.5 ميكروغرام/مل ، السيلينيوم 6.7 ng/ml ، 20 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة ، 1 ٪ P/S). ضبط كثافة الخلية إلى 2.4 x 106 لكل مل.
ملاحظه: كل بئر في لوحات microwell المستخدمة13 في هذا البروتوكول الواردة 1,200 ميكروويلس. - استخدم الصيغة أدناه لحساب عدد الخلايا في البئر كما هو موضح أدناه.
عدد الخلايا لكل بئر = عدد ميكروويلس x عدد الخلايا التي سيتم تجميعها لكل organoid. - لتوليد العضوية من 1000 خليه لكل منهما ، البذور مع كل (1,200 x 1,000 خلايا كل =) 1.2 × 106 خلايا. اضبط كثافة الخلايا في تعليق الخلية بطريقه يتم فيها بذر الخلايا في حجم 0.5 مل من المتوسط. ل organoids شكلت من 1,000 خلايا كل ، استخدام كثافة 2.4 x 106 خلايا لكل مل (1.2 × 106 خلايا في 0.5 مل).
5-اعداد ميكروويلس لاستقبال الخلايا
ملاحظه: للتاكد من ان الخلايا لا تلتزم سطح microwell ، وعلاج مع محلول الشطف السطحي الذي هو متاح للشراء من قبل الشركة المصنعة.
- أضافه 0.5 mL من محلول الشطف لكل بئر. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين في البئر. لأزاله فقاعات الهواء ، ان وجدت ، الطرد المركزي لوحه في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
- مراقبه لوحه تحت التكبير المنخفض المجهر المقلوب ، للتحقق من ان الفقاعات قد أزيلت من ميكروويلس. إذا لوحظت فقاعات المحاصرين ، الطرد المركزي مره أخرى في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات المتبقية.
- غطي الصفيحة بالغطاء والحضن لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. بعد العلاج كامله ، وأزاله محلول الشطف ويغسل علي الفور لوحه مع الماء المعقم أو تلفزيوني. تاكد من ان لوحه لا تجف بعد العلاج مع محلول الشطف.
6. جيل من الخصية العضوي
- أضافه 0.5 mL من التشكيل العضوي المتوسطة (بدون اي خلايا) لكل بئر والطرد المركزي في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات الهواء المحاصرين. لاحظ البئر تحت المجهر المقلوب منخفض التكبير للتحقق من ان فقاعات الهواء قد أزيلت. إذا لوحظت فقاعات المحاصرين ، الطرد المركزي مره أخرى في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات المتبقية.
- أضافه 0.5 mL من تعليق الخلية العاملة وتخلط بلطف عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا. أجهزه الطرد المركزي في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. استخدم المجهر المقلوب للتحقق من ان الخلايا تتجمع داخل الميكروويلس.
- نقل لوحه إلى حاضنه ثقافة الخلية والثقافة لمده 5 أيام. تغيير نصف المتوسطة كل يوم.
- لتغيير المتوسطة دون فقدان اي organoids ، لمس طرف الماصة إلى جدار البئر واقل برفق للمس الغضروف المفصلي ورسم الوسط ببطء. تاكد من اتباع الغضروف المفصلي لأنه يسقط. لأضافه المتوسطة الطازجة ، لمس طرف الماصة إلى جدار البئر علي نفس الجانب مثل السحب المتوسط وأضافه المتوسطة الطازجة بلطف ضد جدار البئر ، مما يسمح لها بالتدفق ببطء إلى أسفل الجدار.
- لاستعاده الهيكل العضوي ، ماصه برفق المتوسطة صعودا وهبوطا باستخدام ماصه الفم واسعه. هذا من شانه ان يسمح لل organoids للخروج من الميكروويلس.
- جمع organoids ، وغسل مع تلفزيوني ، وإصلاح وأداء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية (ش-L1) ، سيرتولي علامة الخلية (غاتا البروتين ملزمه 4-GATA4) ، بيريتوبولار myoid علامة الخلية (α السلس العضلات Actin-αSMA) وعلامة خليه Leydig (سيتوكروم P450-CYP450) كما هو موضح12 وتصور تحت المجهر البؤري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا المعزولة من الخصيتين الخنازير القديمة التي تم استزراعها في الميكروويلس المنظم ذاتيا في خزان (الشكل 1ا، الشكل 2) ، مع الخارجية المحددة والمتميزة (ظهاره اللاهوتية) والمقصورات الداخلية ( انترستيتيوم) (الشكل 1(ب) ، الشكل 2). تم فصل المقصورات اثنين من قبل الكولاجينIV + ve غشاء الطابق السفلي. وكانت الخلايا الجرثومية-L1 + ve وGATA4 + ve سيرتولي الخلايا في المقصورة الخارجية علي غشاء الطابق السفلي (الشكل 1ب، الشكل 2). α-SMA + ve بيريتوبولار وكانت الخلايا myoid المترجمة علي طول الداخل من غشاء الطابق السفلي في حين سيتوكرومP450 + ve leydig الخلايا كانت في وسط الانترستيتيوم (الشكل 1ب، الشكل 2). ويشبه هذا الهيكل (الشكل 2) الظروف الموجودة في الموقع (الشكل 1ج) ، حيث توجد خلايا leydig ، بيريتوبولار myoid الخلايا في الانترستيتيوم في المقصورة الخلالي ؛ والخلايا الجرثومية ، وتقع خلايا سيرتولي في ظهاره اللاهوتية.
الشكل 1: المجهرية المشتقة من الخصيتين تظهر البنية النسيجية الخاصة بالانسجه ذات التضاريس المقلوبة. (ا) خلايا الخصية الخنازير في 0, 3, و 5 أيام من الثقافة ميكروحسن. (ب) الصور المناعية لاشكال الخصية التي تحدد أنواع خلايا محدده: خلايا سيرتولي (GATA4) ، غشاء الطابق السفلي (الكولاجين الرابع) ؛ الخلايا الجرثومية (أوش-L1) ؛ بيريتوبولار myoid الخلايا (α-SMA); خلايا leydig (CYP450). (ج) المظهر النسيجي (H & E) والتمثيل التخطيطي لخصيه الخنزير التي تبلغ من العمر أسبوعا واحدا. يتم الاشاره إلى أنواع الخلايا المحددة بالأسهم المناظرة. قضبان المقياس = 50 μm. وقد عدل هذا الرقم من ساكيب وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للتكوين العضوي. خلايا الخصية الوحيدة المعزولة يتم بذرها واستزراعها في ميكروويلس لمده 5 أيام لإنتاج اورجانويدات الخصية. وقد عدل هذا الرقم من ساكيب وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد انشانا طريقه بسيطه تسمح للجيل متسقة وقابله للتكرار من اعداد كبيره من organoids الخصية مع الهندسة المعمارية الانسجه التي تشبه الخصية في الجسم المجري12. في حين تم تطوير النهج باستخدام خلايا الخصية الخنازير ، فانه ينطبق علي نطاق أوسع أيضا علي الماوس ، الرئيسيات غير البشرية والخصية البشرية12. وقد تم الإبلاغ عن عدد من الطرق المختلفة لإنتاج الخصية العضوي8,9,10,11. ولدت baert وآخرون organoids الخصية البشرية من عينات الكبار وقبل بلوغ عن طريق زراعه خلايا الخصية مع مصفوفة الخلوية اضافيه (ECM) التي تم الحصول عليها من قبل التقطير من الخصيتين البشرية الكبار11. علي الرغم من ان هذا النموذج لم يكن المورفولوجية الخصية متميزة ، يمكن ان تفرز organoids التستوستيرون و السايتوكينات11. وابلغ عن نموذج آخر من الهيكل العضوي البشري من قبل الطعم وآخرون. باستخدام أسلوب الثقافة قطره شنقا التي استخدمت البروتينات ECM الخصية القشرية ويمكن ان تنتج العضوي التستوستيرون8. استخدم ألفيس لوبيز وآخرون مصفوفة غشاء القبو ثلاثية الطبقات الفريدة (علي سبيل المثال ، نظام التدرج) لتوليد organoids الخصية من الفئران10. الخلايا في هذا النظام ولدت هياكل أنبوبيه التي كان لها حاجز الخصيتين الدم. وكانت الخلايا الجرثومية في هذه الهياكل مثل توبولي تستجيب أيضا لتحفيز حمض الريتينويك10. كل هذه الطرق معقده نوعا ما وصعبه الاستخدام لاختبارات الانتاجيه العالية. وعلي النقيض من ذلك ، فان نظام microwell بسيطه ، قابله للتكرار ، يمكن ان تولد organoid الخصية العضوية ويمكن استخدامها لارتفاع الانتاجيه المخدرات واختبارات السمية.
علي الرغم من ان في الطريقة المبينة هنا استخدمنا خليه كثافة الخلايا 1,000/microwell (1,000 الخلايا/organoid) ، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتوليد organoid مع اقل من 125 الخلايا/microwell12. ويمكن ان يكون هذا استخداما خاصا عند تجريب عينات محدوده.
إذا لم يتم موازنة اللوحة بشكل صحيح اثناء طرد ، فقد يتسبب التوزيع غير المتساوي للخلايا في توليد الخلايا العضوية ذات الحجم والشكل المتغيرين. وينبغي توخي الحذر لتحقيق التوازن بين لوحه microwell بشكل صحيح. وبمجرد ان يتم بذر الخلايا ، ينبغي إيلاء الاهتمام للتعامل مع لوحه خلال التغييرات الاعلاميه. هز لوحه كثيرا عند إخراجه من الحاضنة أو خلق الاضطراب خلال التغييرات وسائل الاعلام يمكن ان يسبب بعض من الأعضاء العضويين للخروج من ميكروويلس والصمامات مع الآخرين13.
محراب الخلايا الجرثومية الثدييات معقده ومتعددة الخلايا. الخلايا المختلفة في الخصية مثل خلايا سيرتولي ، بيريتوبولار myoid الخلايا ، خلايا leydig تسهم جميعا في صيانة الخلايا الجرثومية ومصير16،17. يمكن استخدام نظامنا العضوي للتعامل مع مسارات الإشارات المختلفة في أنواع خلايا محدده. يمكن ان يكون الجين من الفائدة حتى أو خفضت تنظيمها في الخلايا الجرثومية أو غيرها من الخلايا الجسدية الخصية مثل خلايا بيريتوبولار myoid ، خلايا سيرتولي. هذه الخلايا المعدلة يمكن بعد ذلك ان يتم الجمع بينها وبين خلايا الخصية الأخرى لتوليد العضوية الخصية المعدلة ، والتي يمكن بعد ذلك ان تستخدم لدراسة اثار التحرير علي ترسب ECM ، والتكوين ، والخلايا خليه الإشارات ، والنطاف. ويمكن أيضا اجراء مثل هذه التعديلات لتوليد الأنماط الظاهرية للامراض محدده لفحوص المخدرات. بالمقارنة مع غيرها من الطرق لتوليد كروي organoids مثل الثقافة في قطرات معلقه أو الترا منخفضه المرفقات U-أسفل لوحات8، وذلك باستخدام نظام microwell سمحت لنموذج organoids الخصية التي هي أكثر سهوله الوصول اليها ويسمح لل التعديلات. علي سبيل المثال ، قد تكون الخلايا الجرثومية المعدلة وراثيا أو التعامل مع العوامل التجريبية ووضعها علي نوع البرية المسبقة الصنع من قبل طرد بسيطه ولوحظ للآثار المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور اونغرين لديه مصلحه مالية في التكنولوجيا AggreWell كمخترع.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة/NICHD HD091068 إلى الدكتورة أينا Dobrinski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
