Summary
Hier presenteren we een protocol voor de reproduceerbare generatie van varkens testiculaire organoïden met testis specifieke weefsel architectuur met behulp van het in de handel verkrijgbare micro well cultuur systeem.
Abstract
Organoïden zijn driedimensionale structuren bestaande uit meerdere celtypen die in staat zijn om weefsel architectuur en functies van organen in vivo te recapituleren. De vorming van organoïden heeft verschillende wegen van fundamenteel en translationeel onderzoek geopend. In de afgelopen jaren, testiculaire organoïden hebben vergaard belang op het gebied van de mannelijke reproductieve biologie. Testiculaire organoïden zorgen voor de studie van celcelinteracties, weefsel ontwikkeling en de niche microomgeving van de kiemcellen en vergemakkelijken de screening van geneesmiddelen en toxiciteit bij hoge doorvoer. Een methode is nodig om op betrouwbare en reproduceerbare wijze testiculaire organoïden te genereren met testis specifieke weefsel architectuur. Het micro well cultuur systeem bevat een dicht assortiment piramidevormige micro putten. Testiculaire cellen afgeleid van de pre-puberale teelballen worden gecentrifugeerd in deze micro putten en gekweekt om testiculaire organoïden te genereren met testis-specifieke weefsel architectuur en celassociaties. Via dit proces kunnen duizenden homogene organoïden worden gegenereerd. Het protocol dat hier wordt gerapporteerd zal van groot belang zijn voor onderzoekers die mannelijke reproductie bestuderen.
Introduction
De laatste jaren is er een opleving van interesse in driedimensionale (3D) organoïden. Verschillende organen zoals darm1, maag2, alvleesklier3,4, lever5en Brain6 zijn met succes afgeleid in 3D organoïde systemen. Deze organoïden hebben architecturale en functionele gelijkenissen met de organen in vivo en zijn meer biologisch relevant voor de studie van weefsel micro dan monolaag cultuur systemen7. Als gevolg daarvan, testiculaire organoïden begonnen te Garner belang als goed8,9,10,11,12. De meeste methoden die tot nu toe zijn gerapporteerd, zijn complex, niet-hoog doorvoer10 en vereisen de toevoeging van ECM-eiwitten8,10. Deze complexiteit leidt ook tot problemen met reproduceerbaarheid. Er is een eenvoudige en reproduceerbare methode nodig die het mogelijk maakt om testiculaire organoïden te genereren met celassociaties die als testis in vivo zijn.
We hebben onlangs een systeem gerapporteerd om deze vereisten op te lossen12. Met behulp van het varken als model, hebben we een centrifugale geforceerde aggregatie benadering in het titer-systeem gebruikt. In het titer-systeem bevat elk putje een groot aantal identieke kleinere microwells13. Dit maakt het mogelijk om talrijke spheroïden van uniforme grootte te genereren. Het titer-systeem heeft het genereren van grote aantallen uniforme organoïden mogelijk gemaakt met een testis-specifieke architectuur. Het systeem is eenvoudig en vereist geen toevoeging van ECM-eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: teelballen van 1-week-oude biggen werden verkregen van een commercieel varkenshouderij als bijproduct van castratie van commerciële varkens. De bevoorrading van de teelballen werd goedgekeurd door het Dierenzorg Comité van de Universiteit van Calgary.
1. bereiding van enzym oplossingen voor de spijsvertering van weefsels
Opmerking: er zijn drie verschillende enzymatische oplossingen nodig, waaronder twee verschillende Collagenase IV-oplossingen (oplossing A, B) en een deoxyribonuclease I-oplossing (DNase I).
- Om oplossing A te bereiden, los 20 mg Collagenase IV S (tabel van de materialen) en 40 mg Collagenase IV W (tabel van de materialen) op in 25 ml van hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde EAGLE'S medium (DMEM). Filter vervolgens steriliseren met een 0,22 μm filter. Voeg 0,4 mL foetaal runderserum (FBS) toe aan oplossing A om trypsine-activiteit te remmen.
- Om oplossing B voor te bereiden, los 80 mg Collagenase IV W (tabel met materialen) op in 40 ml DMEM. Filter vervolgens steriliseren met een 0,22 μm filter.
- Om DNase I-oplossing (7 mg/mL) voor te bereiden, los 70 mg DNase I op in 10 mL DMEM. Filter vervolgens steriliseren met een 0,22 μm filter.
Opmerking: de enzym concentratie voor Collagenase IV-oplossingen die hier wordt beschreven, varieert van de concentraties (2 mg/mL) die worden vermeld in het oorspronkelijke artikel14. Het huidige protocol levert cellen met een iets hogere levensvatbaarheid op. Echter, cellen geïsoleerd door beide protocollen produceren organoïden met identieke weefsel architectuur.
2. testisweefsel enzymatische spijsvertering
- Verzamel de teelballen in een steriel bekerglas en was met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicillaire/streptomycine (P/S). Na het wassen, breng de teelballen over naar een weefselkweek schotel van 100 mm met PBS met 1% P/S en verwijder de Tunica vaginalis en epididymis met behulp van geautoclaveerd schaar en Tang. Breng de geïsoleerde teelballen over naar een nieuwe 100 mm-schaal en was grondig met PBS met 1% P/S.
- Om steriliteit te handhaven, gebruik een andere set van steriele schaar en Tang om de testiculaire parenchym uit het tunica albuginea te schillen. Snijd de teelballen langs de lengteas direct onder de Tunica. Pel vervolgens de teelballen uit de Tunica met twee Tang en plaats in een nieuwe schaal van 100 mm met 1 mL DMEM met 1% P/S.
- Gehakt de geschilde teelballen met steriele schaar in 1-2 mm weefsel stukken. Na het hakken, gebruik steriele tang om witte fragmenten van bindweefsel te verwijderen.
- Breng de gehakt stukjes in oplossing A en top het tot 50 mL met DMEM om een concentratie van 0,4 mg/mL te verkrijgen voor Collagenase IV S (tabel met materialen) en een concentratie van 0,8 mg/ml voor Collagenase IV W (tabel met materialen). Plaats oplossing A die de weefsel stukken gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C bevat, keer de buizen om de 5 minuten zachtjes om en Controleer visueel op het vrijkomen van DNA.
- Voeg 500 μL DNase I toe als vrij zwevend DNA wordt waargenomen. Centrifugeer na 30 minuten de buis op 90 x g met remmen bij 25 °c gedurende 1,5 min en gooi het supernatant weg.
Opmerking: DNA wordt weergegeven als een troebele substantie. Wanneer de buizen worden geschud, de weefsel stukken neer te strijken terwijl het DNA zou blijven drijven.
- Voeg 500 μL DNase I toe als vrij zwevend DNA wordt waargenomen. Centrifugeer na 30 minuten de buis op 90 x g met remmen bij 25 °c gedurende 1,5 min en gooi het supernatant weg.
- Voeg oplossing B toe aan de buis en top tot 50 mL met DMEM om een concentratie van 1,2 mg/mL Collagenase IV W (tabel metmaterialen) te verkrijgen. Plaats de buis gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C en keer de buis om de 5 min zachtjes om. Voeg 500 μL DNase I toe als er een vrij zwevend DNA wordt waargenomen.
- Centrifugeer na 30 minuten de buis op 90 x g met remmen bij 25 °c gedurende 1,5 min. Gooi daarna de supernatant weg en was één keer met PBS met 1% P/S.
Opmerking: de afgedankte supernatanten van beide oplossingen A en B bevatten voornamelijk interstitiële cellen. - Top de buis met PBS tot 50 mL. Verzamel zorgvuldig de buisjes van boven en plaats in een nieuwe 50 mL Tube.
Let op: de grote onverteerde weefsel fragmenten vestigen zich snel aan de onderkant, terwijl verteerde seminifereuze tubuli in suspensie zullen blijven. Er mogen geen grote weefsel fragmenten worden verzameld. Deze procedure kan meerdere malen worden herhaald totdat de oplossing in de oorspronkelijke buis bijna helder is en alleen onverteerde weefsel fragmenten overgebleven zijn, die kunnen worden weggegooid. - Centrifugeer de buisjes bij 90 x g met remmen bij 25 °c gedurende 1,5 min en gooi het supernatant weg. Voeg verse PBS toe en centrifugeer opnieuw. Herhaal deze spoel stap twee keer.
- Na de laatste PBS Wash, verwijder de supernatant en rebreng de de tubuli in 5 ml PBS. Voeg vervolgens 15 mL 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe aan de tubuli. Plaats de buis in 37 °C waterbad en keer elke 2 min zachtjes om. Als er veel vrij zwevende DNA wordt waargenomen, voeg dan 500 μL DNase I toe met 5 mL DMEM.
- Evalueer de enzymatische vertering van tubuli tot enkelvoudige cellen onder de Microscoop (eerst na 5 min, dan elke 2 min). Als meestal enkelvoudige cellen kunnen worden gedetecteerd, stop dan de reactie met 5 mL FBS en filtreer door een 70 μm gaas en vervolgens door een gaas van 40 μm.
Opmerking: er dient op te worden gelet dat de doppen op de 50 mL buisjes die worden gebruikt voor digestonen (oplossing A, B en 0,25% trypsine-EDTA) goed worden aangescherpt. Als verontreiniging in het waterbad een probleem is, kan paraffine folie rond de dop worden gewikkeld om de steriliteit te garanderen. - Centrifugeer de enkelvoudige cellen bij 500 x g met remmen bij 25 °c gedurende 5 minuten, respendeer in het verrijkings medium (Dulbecco modified Eagle medium F/12 (DMEM/F12) met 5% FBS en 1% P/S) en Tel het aantal levensvatbare cellen. Dit is de startende celpopulatie. Repareer 100 x 103 cellen en voer immunocytochemie uit voor geslachtscellen marker UCHL1 (Ubiquitin C-terminale hydrolase L1) zoals beschreven12 en bepaal het percentage van de kiemen in deze startcel populatie.
Opmerking: geslachtscellen marker Promyelocytische leukemie zink Finger protein (PLZF)15 kan ook worden gebruikt als een geschikt alternatief voor UCHL1. In de startcel populatie is de verwachte celopbrengst rond 700-800 x 109/g weefsel. Het percentage kiemcellen in deze celpopulatie moet 4-5% zijn. - Plaats ongeveer 20 x 106 van deze startcel populatie in twee ultra-lage aanbouwdelen 100 mm Petri schalen (10 x 106 cellen opgeschort in 10 ml DMEM/F12 met 1% P/S in elk gerecht) gedurende 2 dagen in een incubator voor weefselkweek (37 °c , 5% CO2, 21% zuurstof). Voer de kiem celverrijking uit met de resterende cellen.
Opmerking: om een optimale levensvatbaarheid en celkwaliteit te garanderen, terwijl de kiem celverrijking en de daaropvolgende kwantificering plaatsvinden, wordt de startcel populatie in cultuur in ultra-lage hechting weefselcultuur gerechten voor 2 dagen geplaatst.
3. kiem celverrijking
Opmerking: de hierboven beschreven procedure levert voornamelijk Sertoli-cellen en kiemcellen. Verschillende adhesie-eigenschappen zorgen voor de scheiding van Sertoli-cellen en kiemcellen via differentieel beplating.
- Zaad 20-25 x 106 cellen van de startcel populatie per 100 mm weefselkweek schotel in een totaal volume van 8 ml verrijkings medium (DMEM/F12 met 5% FBS en 1% P/S) voor differentieel beplating. Plaats de cellen in een incubator (37 °C, 5% CO2, 21% O2) en na 1,5 h, zorg ervoor dat de meerderheid van de Sertoli-cellen aan de plaat hechten.
- Verzamel en combineer de supernatant (voornamelijk kiemcellen) van 2 platen tot een nieuwe 100 mm plaat en plaats deze terug in de incubator. Na 1 h, opnieuw combineren de supernatant van 2 platen aan een nieuwe 100 mm plaat. Plaats de platen 's nachts weer in de incubator.
NB: de supernatanten combineren zullen voornamelijk kiemcellen bevatten. De vastgehouden cellen die samen met de platen worden weggegooid, zijn voornamelijk testiculaire somatische cellen zoals Sertoli en peritubulaire myoïde cellen. - Verzamel de verrijkte kiemcellen in twee fracties als volgt.
Let op: verrijkte kiemcellen hechten zich anders, niet-aanhandig en licht vastgehouden breuk. Beide fracties vormen samen de verrijkte kiem celpopulatie- Niet-aanhandige Fractie: Verzamel het supernatant.
- Licht hecht deel: was de platen voorzichtig met PBS, behandel met 2 mL 1:20 verdunning van 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, stop de reactie met 2 mL verrijkings medium en verzamel in dezelfde buis als een niet-aanhechting Fractie.
Opmerking: 0,25% trypsine-EDTA moet worden verdund met PBS om een 1:20 trypsine-oplossing te produceren.
- Tel het totale aantal cellen met behulp van een celteller, Fix 100 x 103 -cellen en voer immunocytochemie uit voor geslachtscellen marker UCHL1 zoals beschreven12 en bepaal het percentage van de kiemen in deze verrijkte celpopulatie.
Opmerking: het percentage kiemcellen in deze celpopulatie moet ten minste 60-70% zijn. Aangezien de immunocytochemie voor kwantificering 1 dag zou vergen, moeten de verrijkte cellen worden geplaatst in een ultra-lage bijlage 100 mm Petri schaaltje met DMEM/F12 aangevuld met 1% P/S voor de duur om een optimale celkwaliteit en levensvatbaarheid te garanderen.
4. bereiding van de cellen voor het zaaien
- Om de startcel voorbereiding te oogsten, haalt u het supernatant op in een buis van 50 mL van de ultra lage bijlage 100 mm gerechten. Was de platen krachtig met PBS om de vastgehouden cellen te verzamelen. Er is geen enzymatische spijsvertering nodig.
Opmerking: sommige van de testiculaire cellen, voornamelijk Sertoli-cellen, kunnen zich enigszins houden aan de ultra lage bevestigings platen. - Combineer de startcel voorbereiding en verrijkt kiemcellen om een werkcel preparaat te verkrijgen dat 25% kiemcellen bevat. Centrifugeer bij 500 x g met remmen bij 25 °c gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en hervat de cellen in het medium voor organoïde vorming (DMEM/F12 aangevuld met insuline 10 μg/ml, transferrine 5,5 μg/ml, selenium 6,7 ng/ml, 20 ng/ml epidermale groeifactor , 1% P/S). Stel de celdichtheid in op 2,4 x 106 per ml.
Opmerking: elk putje in de micro well Plates gebruikt13 in dit protocol bevatte 1.200 micro Wells. - Gebruik de onderstaande formule om het aantal cellen per goed te berekenen, zoals hieronder wordt beschreven.
Aantal cellen per putje = aantal microwells x aantal cellen dat moet worden geclusterd voor elke organoid. - Voor het genereren van organoïden van 1, 000 cellen elk, zaad elk met (1.200 x 1.000 cellen elk =) 1,2 x 106 cellen. Pas de celdichtheid in de celsuspensie zodanig aan dat de cellen in een volume van 0,5 mL medium worden geseeid. Gebruik voor organoïden gevormd uit 1.000 cellen een dichtheid van 2,4 x 106 cellen per mL (1,2 x 106 cellen in 0,5 ml).
5. bereiding van micro putten om cellen te ontvangen
Opmerking: om ervoor te zorgen dat de cellen zich niet aan het micro well-oppervlak hechten, moet u een oppervlakteactieve spoeloplossing behandelen die door de fabrikant te koop wordt aangeboden.
- Voeg aan elke put 0,5 mL spoeloplossing toe. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de put zitten. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, centrifugeer de plaat bij 2.000 x g met remmen bij 25 °c gedurende 2 minuten.
- Observeer de plaat onder een omgekeerde Microscoop met een lage vergroting om te controleren of de bubbels uit de micro putten zijn verwijderd. Als er gevangen bubbels worden waargenomen, centrifugeer dan opnieuw op 2.000 x g met remmen bij 25 °c gedurende 2 minuten om eventuele resterende bubbels te verwijderen.
- Bedek de plaat met het deksel en incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na voltooiing van de behandeling de spoeloplossing en was de plaat onmiddellijk met steriel water of PBS. Zorg ervoor dat de plaat na de behandeling met de spoeloplossing niet uitdroogt.
6. generatie van testiculaire organoïden
- Voeg aan elke put 0,5 mL organoïd vorming medium (zonder cellen) toe en centrifu2.000 Geer gedurende 2 minuten bij 25 °C met een rem op een lucht ballon van maximaal 5 g . Observeer de put onder een omgekeerde Microscoop met een lage vergroting om te controleren of de luchtbellen zijn verwijderd. Als er gevangen bubbels worden waargenomen, centrifugeer dan opnieuw op 2.000 x g met remmen bij 25 °c gedurende 2 minuten om eventuele resterende bubbels te verwijderen.
- Voeg 0,5 mL van de werkcel suspensie toe en meng zachtjes door pipetteren op en neer. Centrifugeer bij 500 x g met remmen bij 25 °c gedurende 5 min. gebruik een omgekeerde Microscoop om te controleren of de cellen geclusterd zijn in de micro putjes.
- Breng de plaat 5 dagen in een kweek-incubator en cultuur. Verander de helft van het medium om de andere dag.
- Om het medium te veranderen zonder organoïden te verliezen, raak je de pipetpunt aan de wand van de put en verlaag je zachtjes om de meniscus aan te raken en langzaam het medium te tekenen. Zorg ervoor dat u de meniscus volgen als het daalt. Om een vers medium toe te voegen, raak je de pipetpunt aan de wand van de put aan dezelfde kant aan als de medium opname en voeg je zachtjes een fris medium toe tegen de muur, waardoor het langzaam door de muur stroomt.
- Om de organoïden te herstellen, Pipetteer het medium voorzichtig met een brede mond pipet. Hierdoor zouden de organoïden uit de micro putten kunnen komen.
- Verzamel de organoïden, was met PBS, repareer en voer immunocytochemie uit voor geslachtscellen marker (UCH-L1), Sertoli-celmarker (GATA binding Protein 4-GATA4), peritubulaire myoïde celmarker (α-gladde spier actin-αSMA) en Leydig-celmarker (cytochroom P450-CYP450) zoals beschreven12 en visualiseer onder een confocale Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geïsoleerde cellen van 1 weken oude varkens teelballen die werden gekweekt in de micro putten zelf ingedeeld in sferoïden (Figuur 1A, Figuur 2), met afgebakend en uitgesproken buitenkant (seminifere epitheel) en inwendige compartimenten ( Interstitium) (afbeelding 1B, Figuur 2). De twee compartimenten werden gescheiden door een collageen IV+ ve kelder membraan. UCH-L1+ ve kiemcellen en GATA4+ ve Sertoli cellen zaten in het buitenvak op het kelder membraan (Figuur 1B, Figuur 2). α-SMA+ ve -peritubulaire myoïde cellen waren gelokaliseerd langs de binnenkant van het kelder membraan terwijl cytochroom P450+ ve Leydig cellen zich in het midden van het interstitium bevonden (Figuur 1B, Figuur 2). Deze structuur (Figuur 2) is vergelijkbaar met in situ-omstandigheden (Figuur 1C), waar Leydig-cellen, peritubulaire myoïde cellen zich in het interstitium in het interstitiële compartiment bevinden; en kiemcellen, Sertoli cellen bevinden zich op het de epitheel.
Figuur 1: Microwell-afgeleide testiculaire organoïden vertonen testis-specifieke weefsel architectuur met een omgekeerde topografie. A) testiculaire cellen van varkens op 0, 3 en 5 dagen van de titer-cultuur. B) immunofluorescentie beelden van testiculaire organoïden die specifieke celtypen identificeren: Sertoli-cellen (GATA4), kelder membraan (collageen IV); kiemcellen (UCH-L1); -peritubulaire myoïde cellen (α-SMA); Leydig cellen (CYP450). C) histologisch uiterlijk (H & E) en schematische weergave van de 1-weekse varkens testis. Specifieke celtypen worden aangegeven met bijbehorende pijlen. Schaal staven = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Sakib et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische weergave van organoïde vorming. Geïsoleerde enkelvoudige testiculaire cellen worden gesekt en gekweekt in de micro putjes gedurende 5 dagen om testiculaire organoïden te produceren. Dit cijfer is gewijzigd van Sakib et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een eenvoudige methode opgezet waarmee de consistente, reproduceerbare generatie van grote aantallen testiculaire organoïden met weefsel architectuur, vergelijkbaar met testis in vivo12, mogelijk is. Hoewel de aanpak werd ontwikkeld met behulp van de cellen van varkens testis, is het breder toepasbaar ook op muis, niet-menselijke primaat en menselijke testis12. Er zijn een aantal verschillende methoden gerapporteerd voor de productie van testiculaire organoïden8,9,10,11. Baert et al. gegenereerde menselijke testiculaire organoïden van volwassen en pre-puberale monsters door het kweken van testiculaire cellen met extra cellulaire matrix (ECM) verkregen door decellularisatie van volwassen menselijke teelballen11. Hoewel dit model had geen verschillende testiculaire morfologie, organoïden kon afscheiden testosteron en cytokines11. Een ander humaan organoïde model werd gerapporteerd door Pendergraft et al. met behulp van een hangende drop cultuur methode die gebruikt ontbindend testiculaire ECM eiwitten en organoïden kan produceren testosteron8. Alves-Lopes et al. gebruikte een unieke drie-laags kelder membraan matrix (bv, Matrigel) gradiënt systeem voor het genereren van testiculaire organoïden van ratten10. De cellen in dit systeem gegenereerd buisvormige structuren die een bloed testes barrière. De kiemcellen in deze tubulusachtige structuren reageerden ook op de stimulatie van retinoïnezuur10. Al deze methoden zijn enigszins ingewikkeld en uitdagend om te gebruiken voor een hoge doorvoer-assays. Daarentegen is het titer-systeem eenvoudig, reproduceerbaar, kan organotypische testiculaire organoïden genereren en kan het worden gebruikt voor een hoge doorvoer van geneesmiddelen en toxiciteitstesten.
Hoewel in de hier beschreven methode hebben we een celdichtheid 1.000 cellen/microwell (1.000 cellen/organoid) gebruikt, deze methode kan worden gebruikt om organoïden met zo weinig als 125 cellen/microwell12te genereren. Dit kan met name worden gebruikt bij het experimenteren met beperkte monsters.
Als de plaat tijdens het centrifugeren niet correct wordt gebalanceerd, kan een ongelijke verdeling van de cellen leiden tot de aanmaak van organoïden met een variabele grootte en vorm. Zorg moet worden genomen om het evenwicht van de titer plaat goed. Zodra de cellen zijn geseeid, moet aandacht worden besteed aan het omgaan met de plaat tijdens de media veranderingen. Als u de plaat te veel schudt wanneer u deze uit de incubator neemt of turbulentie creëert tijdens de media, kunnen sommige organoïden uit de micro putten komen en samensmelten met anderen13.
De zoogdier kiemcellen niche is complex en multicellulair. De verschillende cellen in de testis zoals Sertoli cellen, peritubulaire myoïde cellen, Leydig cellen dragen allemaal bij aan het onderhoud van de kiemcellen en het lot16,17. Ons organoïde systeem kan worden gebruikt om verschillende signalering trajecten in specifieke celtypen te manipuleren. Een gen van belang kan worden omhoog of gedowngereguleerd in geslachtscellen of andere testiculaire somatische cellen zoals peritubulaire myoïde cellen, Sertoli-cellen. Deze gemodificeerde cellen kunnen vervolgens worden gecombineerd met andere testiculaire cellen om gemodificeerde testiculaire organoïden te genereren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de effecten van de bewerking op ECM-depositie, morfogenese, cel-cel signalering en spermatogenese te bestuderen. Dergelijke modificaties kunnen ook worden uitgevoerd voor het genereren van specifieke ziekte fenotypes voor drug screenings. Vergeleken met andere methoden voor het genereren van sferoïdale organoïden zoals cultuur in hangende druppels of ultra lage bijlage U-bodemplaten8, heeft het gebruik van het titer-systeem toegestaan voor een testiculaire organoïde model dat toegankelijker is en het mogelijk maakt voor Wijzigingen. Kiemcellen kunnen bijvoorbeeld genetisch gemodificeerd zijn of met experimentele factoren worden behandeld en op een premade wild type organoïde worden geplaatst door eenvoudige centrifugeren en geobserveerd voor downstream effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Ungrin heeft een financieel belang in de technologie van AggreWell als uitvinder.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH/NICHD HD091068-01 aan Dr. Ina Dobrinski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
