Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a geração reprodutível de organóides testicular suínos com a arquitetura específica do tecido do testis usando o sistema comercialmente disponível da cultura do de micropoços.
Abstract
Os organóides são estruturas tridimensionais compostas de múltiplos tipos de células capazes de recapitular a arquitetura do tecido e as funções dos órgãos in vivo. A formação de organóides abriu diferentes avenidas de pesquisa básica e translacional. Nos últimos anos, os organóides testicular têm ganhou interesse no campo da biologia reprodutiva masculina. Os organóides testiculares permitem o estudo de interações célula-célula, desenvolvimento tecidual, e o microambiente de nicho de células germinativas e facilitam a triagem de drogas e toxicidade de alta taxa de transferência. Um método é necessário para gerar de forma confiável e regerível organóides testiculares com o testículo tecido específico arquitetura. O sistema da cultura do de micropoços contem uma disposição densa de micropoços pirâmide-dados forma. As pilhas testicular derivadas dos testículos pre-pubertal são centrifugadas nestes micropoços e cultivadas para gerar organóides testicular com a arquitetura testis-específica do tecido e as associações da pilha. Milhares de organóides homogêneos podem ser gerados através deste processo. O protocolo aqui relatado será de grande interesse para os pesquisadores que estudam a reprodução masculina.
Introduction
Nos últimos anos, houve um ressurgimento do interesse em três-dimensional (3D) organóides. Os órgãos diferentes tais como o intestine1, o estômago2, o pâncreas3,4, ofígado5, eo cérebro6 foram derivados com sucesso em sistemas organoid 3D. Estes organóides têm semelhanças arquitetônicas e funcionais com os órgãos in vivo e são mais biologicamente relevantes para o estudo do microambiente tecidual do que os sistemas de cultura monocamada7. Como resultado, os organóides testicular começaram a angariar juros, bem como8,9,10,11,12. A maioria dos métodos relatados até o momento são complexos, não-alta taxa de transferência10 e exigem a adição de proteínas ECM8,10. Essa complexidade também leva a problemas de reprodutibilidade. Um método simples e reprodutível é necessário que permite a geração de organóides testiculares com células-associações que são como testis in vivo.
Nós temos relatado recentemente um sistema para endereçar estas exigências12. Usando o porco como modelo, empregamos uma abordagem de agregação forçada centrífuga no sistema de micropoços. No sistema micropoços, cada poço contém um grande número de micropoços menores idênticos13. Isto permite a geração de esferoides numerosos do tamanho uniforme. O sistema de micropoços permitiu a geração de um grande número de organóides uniformes com uma arquitetura específica do testis. O sistema é simples e não requer adição de proteínas ECM.
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Protocol
Nota: os testículos de leitões de 1 semana de idade foram obtidos de uma fazenda de suínos comercial como subproduto da castração de suínos comerciais. O sourcing de testículos foi aprovado pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Calgary.
1. preparação de soluções enzimáticas para digestão tecidual
Nota: são necessárias três soluções enzimáticas diferentes, que incluem duas soluções diferentes de colagenase IV (solução A, B) e uma solução de desoxirribonuclease I (DNase I).
- Para preparar a solução a, dissolver 20 mg de colagenase IV S (tabela de materiais) e 40 mg de colagenase IV W (tabela de materiais) em 25 ml de alta glicose Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM). Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm. Adicionar 0,4 mL de soro fetal bovino (FBS) à solução a para inibir a atividade de tripsina.
- Para preparar a solução B, dissolver 80 mg de colagenase IV W (tabela de materiais) em 40 ml de DMEM. Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm.
- Para preparar a solução de DNase I (7 mg/mL), dissolver 70 mg de DNase I em 10 mL de DMEM. Em seguida, filtrar esterilizar com um filtro de 0,22 μm.
Nota: a concentração enzimática para as soluções de colagenase IV descritas aqui, varia entre as concentrações (2 mg/mL) indicadas no artigo14original. O protocolo atual rende pilhas com viabilidade ligeiramente mais elevada. Entretanto, as pilhas isoladas por ambos os protocolos produzem organóides com arquitetura idêntica do tecido.
2. digestão enzimática do tecido do testis
- Colete os testículos em uma taça estéril e lave com salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Após a lavagem, transfira os testículos para um prato de cultura de tecido de 100 mm com PBS contendo 1% P/S e remova a túnica vaginalis e epidídimo usando tesouras e fórceps autoclavados. Transfira os testículos isolados para um novo prato de 100 mm e Lave abundantemente com PBS contendo 1% P/S.
- Para manter a esterilidade, use outro conjunto de tesouras estéreis e fórceps para descascar o parênquima testicular para fora da túnica albuginea. Corte os testículos ao longo do eixo longitudinal diretamente o Tunica. Em seguida, descasque os testículos para fora da túnica usando dois fórceps e coloque em um novo prato de 100 mm contendo 1 mL DMEM com 1% P/S.
- Mince os testículos descascados com tesouras estéreis em partes do tecido de 1-2 milímetros. Depois de cortar, use fórceps estéril para remover fragmentos brancos do tecido conjuntivo.
- Transfira as peças do tecido picado para a solução A e, em cima, até 50 mL com DMEM para obter uma concentração de 0,4 mg/mL para colagenase IV S (tabela de materiais) e uma concentração de 0,8 mg/ml para colagenase IV W (tabela de materiais). Coloc a solução a que contem as partes do tecido em um banho de água do ° c 37 por 30 minutos, inverta delicadamente os tubos cada 5 minutos e verific visualmente para a liberação do ADN.
- Adicionar 500 μL de DNase I se o DNA flutuante livre for observado. Após 30 min, centrifugue o tubo a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min e elimine o sobrenadante.
Nota: o DNA apareceria como uma substância turva. Quando os tubos são abalados, as peças de tecido se acalmarem enquanto o DNA ficaria à tona.
- Adicionar 500 μL de DNase I se o DNA flutuante livre for observado. Após 30 min, centrifugue o tubo a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min e elimine o sobrenadante.
- Adicionar a solução B ao tubo e subir até 50 ml com DMEM para obter uma concentração de 1,2 mg/ml de colagenase IV W (tabela de materiais). Coloque o tubo no banho de água de 37 ° c por 30 min e inverta suavemente o tubo a cada 5 min. adicionar 500 μL de DNase I se o DNA flutuante livre for observado.
- Após 30 min, centrifugue o tubo a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min. Depois disso descarte o sobrenadante e lave uma vez com PBS com 1% P/S.
Nota: os sobrenadantes descartados da solução A e B conterá principalmente células intersticiais. - Top acima do tubo com PBS até 50 mL. Colete cuidadosamente os túbulos da parte superior e coloque em um novo tubo de 50 mL.
Nota: os grandes fragmentos de tecido não digeridos se instalam rapidamente na parte inferior, enquanto os túbulos seminiferosos digeridos permanecerão em suspensão. Nenhum fragmento de tecido grande deve ser coletado. Este procedimento pode ser repetido várias vezes até que a solução no tubo original é quase clara e apenas fragmentos de tecido não digeridos permanecem, o que pode ser Descartado. - Centrifugue os túbulos a 90 x g com travões a 25 ° c por 1,5 min e elimine o sobrenadante. Adicionar PBS fresco e centrifugar novamente. Repita este passo de lavagem duas vezes.
- Após a última lavagem de PBS, retire o sobrenadante e ressuscitem os túbulos seminíferos em 5 mL de PBS. Em seguida, adicione 15 mL de 0,25% de ácido tripsina-etilenodiaminetetraacético (EDTA) aos túbulos. Coloque o tubo no banho de água de 37 ° c e inverta suavemente a cada 2 min. Se for observado um monte de DNA de flutuação livre, adicione 500 μL de DNase I com 5 mL de DMEM.
- Avalie a digestão enzimática de túbulos para células únicas o microscópio (primeiro após 5 min, então a cada 2 min). Se a maioria das células individuais pode ser detectada, parar a reação com 5 mL de FBS e filtrar através de uma malha de 70 μm e, em seguida, através de uma malha de 40 μm.
Nota: deve-se tomar cuidado para que os tampões nos tubos de 50 mL utilizados para digestivos (solução A, B e 0,25% tripsina-EDTA) sejam apertados corretamente. Se a contaminação no banho de água é uma preocupação, a película de parafina pode ser envolvida em torno da tampa para assegurar a esterilidade. - Centrifugue as células individuais a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min, ressuscitem no meio de enriquecimento (Dulbecco modificado Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contendo 5% de FBS e 1% P/S) e conte o número de células viáveis. Esta é a população de células iniciais. Fixar 100 x 103 células e executar Immunocytochemistry para o marcador de célula germinal UCHL1 (ubiquitin C-terminal hydrolase L1) como descrito12 e determinar a percentagem de células germinativas nesta população de células iniciais.
Nota: a proteína do dedo do zinco da leucemia promyelocytic do marcador da célula germinal (PLZF)15 poderia igualmente ser usada como uma alternativa apropriada para UCHL1. Na população de células iniciais, o rendimento da célula esperada é de cerca de 700-800 x 109/g de tecido. A percentagem de células germinativas nesta população de células deve ser de 4-5%. - Coloque em torno de 20 x 106 desta população de células de partida em dois ultra baixo acessório 100 mm pratos de Petri (10 x 106 células suspensas em 10 ml de DMEM/F12 contendo 1% P/S em cada prato) por 2 dias em uma incubadora de cultura de tecidos (37 ° c , 5% CO2, 21% oxigênio). Realize o enriquecimento da célula germinativa com as células restantes.
Nota: para assegurar a viabilidade óptima e a qualidade da pilha, quando o enriquecimento da célula germinal e a quantificação subseqüente tiverem lugar, a população de pilha começar é coloc na cultura em pratos ultra baixos da cultura do tecido do acessório por 2 dias.
3. enriquecimento de células germinativas
Nota: o procedimento descrito acima produz principalmente células de Sertoli e células germinativas. As propriedades diferentes da adesão permitem a separação de pilhas de Sertoli e de pilhas de germe através do chapeamento diferencial.
- Semente 20-25 x 106 células da população de células iniciais por 100 mm de cultura de tecido prato em um volume total de 8 ml de enriquecimento médio (DMEM/F12 com 5% FBS e 1% P/S) para o revestimento diferencial. Coloque as células em uma incubadora (37 ° c, 5% CO2, 21% O2) e após 1,5 h, certifique-se de que a maioria das células de Sertoli anexar à placa.
- Colete e combine o sobrenadante (contendo principalmente células germinativas) de 2 placas para uma nova placa de 100 mm e coloque-a de volta na incubadora. Depois de 1 h, novamente Combine o sobrenadante de 2 placas para uma nova placa de 100 mm. Coloque as placas de volta na incubadora para a noite.
Nota: os sobrenadantes combinados irão conter principalmente células germinativas. As células aderiram que são descartadas junto com as placas são principalmente células somáticas testiculares, como Sertoli e células mióides peritubulares. - Colete as células germinativas enriquecidas em duas frações da seguinte maneira.
Nota: as células germinativas enriquecidas aderem de forma diferente, fração não aderente e fração levemente aderida. Ambas as frações formam juntos a população de células germinativas enriquecidas- Fração não aderente: colete o sobrenadante.
- Fração ligeiramente aderente: lave suavemente as placas com PBS, trate com 2 mL de 1:20 de diluição de 0,25% de tripsina-EDTA durante 5 min à temperatura ambiente, pare a reacção com 2 mL de meio de enriquecimento e colete no mesmo tubo que a fração não aderente.
Nota: 0,25% tripsina-EDTA precisa ser diluído com PBS para produzir uma solução de tripsina 1:20.
- Conte o número total de células usando um contador de células, corrija 100 x 103 células e execute Immunocytochemistry para o marcador de célula germinal UCHL1 como descrito12 e determine a porcentagem de células germinativas nesta população de células enriquecidas.
Nota: a percentagem de células germinativas nesta população de células deve ser de pelo menos 60-70%. Desde que o Immunocytochemistry para a quantificação exigiria 1 dia, as pilhas enriquecidas devem ser coloc em um prato de Petri ultra baixo do acessório 100 milímetro com DMEM/F12 suplementado com 1% P/S para a duração para assegurar a qualidade e a viabilidade óptimas da pilha.
4. preparação de células para semeadura
- Para colher a preparação da célula inicial, colete o sobrenadante em um tubo de 50 mL a partir do acessório ultra baixo 100 mm pratos. Lave as placas vigorosamente com PBS para recolher as células aderiram. Não é necessária digestão enzimática.
Nota: algumas das células testiculares, principalmente células de Sertoli, podem aderir ligeiramente às placas de fixação ultra baixas. - Combine a preparação da célula inicial e as células germinativas enriquecidas para obter uma preparação de células de trabalho contendo 25% de células germinativas. Centrifugar a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuscitará as células no meio de formação organoide (DMEM/F12 suplementado com insulina 10 μg/ml, transferrina 5,5 μg/ml, selênio 6,7 ng/ml, 20 ng/ml fator de crescimento epidérmico , 1% P/S). Ajuste a densidade da célula para 2,4 x 106 por ml.
Nota: cada poço nas placas de micropoços utilizados13 neste protocolo continha 1.200 micróbicos. - Use a fórmula abaixo para calcular o número de células por poço, conforme descrito abaixo.
Número de células por poço = número de micropoços x número de células a serem agrupadas para cada organóide. - Para gerar organóides de 1, 000 células cada, cada semente com (1.200 x 1.000 células cada =) 1,2 x 106 células. Ajuste a densidade celular na suspensão celular de forma que as células sejam semeadas em um volume de 0,5 mL de meio. Para organóides formados a partir de 1.000 células cada, use uma densidade de 2,4 x 106 células por ml (1,2 x 106 células em 0,5 ml).
5. preparação de micropoços para receber células
Nota: para garantir que as células não aderiram à superfície do micropoço, trate com uma solução de enxaguamento de surfactante que está disponível para compra pelo fabricante.
- Adicione 0,5 mL de solução de enxaguadela a cada poço. Assegure-se de que nenhuma bolha de ar esteja prendida no poço. Para remover as bolhas de ar, se houver, centrifugue a placa a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min.
- Observe a placa um microscópio invertido da baixo-ampliação, para verificar que as bolhas estiveram removidas dos micropoços. Se forem observadas bolhas presas, centrifugue novamente a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas restantes.
- Cubra a placa com a tampa e incubar por 30 min à temperatura ambiente. Após a conclusão do tratamento, retire a solução de enxaguadela e lave imediatamente a placa com água estéril ou PBS. Assegure-se de que a placa não seque após o tratamento com a solução de enxaguadela.
6. geração de organóides testiculares
- Adicione 0,5 mL de meio de formação organóide (sem células) a cada poço e Centrifugue a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas de ar presas. Observe o poço um microscópio invertido da baixo-ampliação para verificar que as bolhas de ar estiveram removidas. Se forem observadas bolhas presas, centrifugue novamente a 2.000 x g com travões a 25 ° c durante 2 min para remover quaisquer bolhas restantes.
- Adicionar 0,5 mL da suspensão da célula de trabalho e misturar suavemente introduzindo pipetagem para cima e para baixo. Centrifugador a 500 x g com travões a 25 ° c durante 5 min. Use um microscópio invertido para verificar se as células estão agrupadas dentro dos micropoços.
- Transfira a placa em uma incubadora e em uma cultura da cultura da pilha por 5 dias. Mude metade do meio a cada dois dias.
- Para mudar o meio sem perder nenhum organoids, toque a ponta da pipeta à parede do poço e abaixe-a delicadamente para tocar no menisco e para extrair lentamente o meio. Certifique-se de seguir o menisco como ele desce. Para adicionar um meio fresco, toque na ponta da pipeta na parede do poço do mesmo lado que a retirada média e adicione um meio fresco suavemente contra a parede do poço, permitindo que ele flua lentamente para baixo da parede.
- Para recuperar os organóides, gentilmente pipeta o meio para cima e para baixo usando uma pipeta boca larga. Isso permitiria que os organóides saiam dos micropoços.
- Colete os organóides, lave com PBS, corrija e execute Immunocytochemistry para o marcador da célula germinal (UCH-L1), o marcador da pilha de Sertoli (proteína obrigatória 4-GATA4 de GATA), o marcador myoid peritubular da pilha (α-músculo liso Actin-αSMA) e o marcador da pilha de Leydig (cytochrome P450-CYP450) como descrito12 e visualize um microscópio confocal.
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Representative Results
Células isoladas de 1 semana de testes porcina de idade que foram cultivadas nos micropoços autoorganizados em esferóides (Figura 1A, Figura 2), com exterior delineado e distinto (epitélio seminífero) e compartimentos interiores ( interstício) (Figura 1B, Figura 2). Os dois compartimentos foram separados por um colágeno IV+ ve membrana basal. Células germinativas UCH-L1+ ve e células GATA4+ ve Sertoli estavam no compartimento exterior na membrana basal (Figura 1B, Figura 2). as pilhas myoid de α-SMA+ ve peritubular foram localizadas ao longo do interior da membrana do porão quando as pilhas de Leydig do citocromo P450+ ve estivessem no centro do interstício (Figura 1B, Figura 2). Essa estrutura (Figura 2) é semelhante às condições in situ (Figura 1C), onde células de Leydig, células mióides peritubulares estão localizadas no interstício no compartimento intersticial; e células germinativas, as células de Sertoli estão localizadas no epitélio seminiferoso.
Figura 1: organóides testiculares micropoços exibem a arquitetura do tecido específico do testis com uma topografia invertida. (A) células testiculares porcinas em 0, 3 e 5 dias de cultura de micropoços. (B) imagens de imunofluorescência de organóides testiculares identificando tipos de células específicas: células de SERTOLI (GATA4), membrana basal (colágeno IV); células germinativas (UCH-L1); células mióides peritubulares (α-SMA); Células de Leydig (CYP450). (C) aparência histológica (H & e) e representação esquemática de testículos de suínos de 1 semana de idade. Tipos específicos de células são indicados com as setas correspondentes. Barras de escala = 50 μm. Este número foi modificado de Sakib et al.12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representação esquemática da formação organoide. As únicas pilhas testicular isoladas são semeadas e cultivadas nos micropoços por 5 dias para produzir organoids testicular. Este número foi modificado de Sakib et al.12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estabelecemos um método simples que permite a geração consistente e repetível de um grande número de organóides testiculares com arquitetura tecidual que é semelhante ao testis in vivo12. Quando a aproximação foi desenvolvida usando pilhas do testis suínos, é mais extensamente aplicável também ao rato, ao primata não-humano e ao testis humano12. Um número de métodos diferentes foi relatado para produzir organóides testicular8,9,10,11. Baert et al. geraram organóides testiculares humanos de amostras adultas e pré-púberes por meio da cultura de células testiculares com matriz celular extra (ECM) obtida por decelularização de testículos humanos adultos11. Embora este modelo não tenha a morfologia testicular distinta, os organóides podiam secretar a testosterona e os citocinas11. Outro modelo organoide humano foi relatado por Pendergraft et al. usando um método de cultura de gota suspensa que utilizou proteínas de ECM testicular solubilizadas e organóides poderiam produzir testosterona8. Alves-Lopes et al. utilizaram um sistema único de gradiente de três camadas da matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel) para gerar organoides testiculares de ratos10. As pilhas neste sistema geraram as estruturas tubulares que tiveram uma barreira dos testículos do sangue. As células germinativas nessas estruturas semelhantes ao túnico também foram responsivas à estimulação do ácido retinóico10. Todos esses métodos são um tanto complexos e desafiadores de usar para ensaios de alta taxa de transferência. Em contraste, o sistema de micropoços é simples, reprodutível, pode gerar organóides testicular organotípicos e pode ser usado para ensaios de drogas e toxicidade de alta taxa de transferência.
Embora no método descrito aqui nós usamos uma densidade celular 1.000 células/micropoços (1.000 células/organoides), este método pode ser usado para gerar organóides com tão pouco quanto 125 células/micropoços12. Isto pode ser de uso particular ao experimentar com amostras limitadas.
Se a placa não estiver corretamente balanceada durante a centrifugação, a distribuição desigual das células pode causar a geração de organóides com tamanho e forma variáveis. Deve-se tomar cuidado para equilibrar a placa de micropoços corretamente. Uma vez que as pilhas foram semeadas, a atenção deve ser pagada a segurar a placa durante mudanças dos meios. Sacudindo a placa muito quando tirá-lo da incubadora ou criando turbulência durante as mudanças de mídia pode causar alguns dos organóides para sair dos micropoços e fusível com outros13.
O nicho de células germinativas de mamíferos é complexo e multicelular. As pilhas diferentes no testis tais como pilhas de Sertoli, pilhas myoid peritubular, pilhas de Leydig todas contribuem à manutenção e ao Fate da pilha de germe16,17. Nosso sistema organoide pode ser usado para manipular diferentes vias de sinalização em tipos específicos de células. Um gene do interesse pode ser acima ou ser regulado em pilhas de germe ou em outras pilhas somáticas testicular tais como pilhas myoid peritubular, pilhas de Sertoli. Estas pilhas modificadas podem então ser combinadas com outras pilhas testicular para gerar organoids testicular modificados, que podem então ser usados para estudar os efeitos da edição no depósito do ECM, na morfogênese, na sinalização da pilha-pilha, e no spermatogenesis. Tais modificações também podem ser realizadas para gerar fenótipos específicos de doenças para exames de drogas. Comparado a outros métodos para a geração de organóides esferoidal tais como a cultura em gotas de suspensão ou as placas do U-fundo do acessório ultra baixo8, usando o sistema do de micropoços permitiram um modelo organoid testicular que fosse mais acessível e permitisse Modificações. Por exemplo, as células germinativas podem ser geneticamente modificadas ou tratadas com fatores experimentais e colocadas em um organoide tipo selvagem pré-fabricado por centrifugação simples e observadas para efeitos a jusante.
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Disclosures
Dr. Ungrin tem um interesse financeiro na tecnologia AggreWell como um inventor.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por NIH/NICHD HD091068-01 a Dr. ina Dobrinski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
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