Summary
Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.
Abstract
Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.
Introduction
Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar1, mide2, pankreas3,4, karaciğer5, ve beyin6 başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültürsistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır8,9,10,11,12. Şimdiye kadar bildirilen yöntemlerin çoğunluğu karmaşık, non-yüksek iş10 ve ECM proteinleri8,10eklenmesini gerektirir. Bu karmaşıklık aynı zamanda tekrarlanabilirlik ile ilgili sorunlara yol açar. Testis in vivo gibi hücre çağrışımları olan testis organoidlerinin oluşumuna olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir.
Biz son zamanlarda bu gereksinimleri12adresine bir sistem bildirdiniz. Domuzu model olarak kullanarak microwell sisteminde santrifüj zorunlu toplama yaklaşımını kullandık. Microwell sisteminde, her kuyu aynı küçük microwells13çok sayıda içerir. Bu üniforma boyutu çok sayıda küresel nesil sağlar. Microwell sistemi, testislere özgü bir mimariye sahip çok sayıda tek tip organoidin üretilebini sağladı. Sistem basittir ve ECM proteinlerinin eklenmesini gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: 1 haftalık domuz yavrularından alınan testisler, ticari domuzların hadım edilmesinden elde edilen yan ürün olarak ticari bir domuz çiftliğinden elde edilebildi. Testislerin kaynak Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku sindirimi için enzim çözeltilerinin hazırlanması
NOT: İki farklı kollajenaz IV çözeltisi (A, B çözeltisi) ve deoksiribonükle I (DNase I) çözeltisi içeren üç farklı enzimatik çözüm gereklidir.
- A çözeltisi hazırlamak için, 20 mg kollajenaz IV S(Malzeme Tablosu)ve 40 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)25 mL yüksek glikozLu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) olarak çözünür. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre. Trypsin aktivitesini inhibe etmek için A solüsyonuna 0,4 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
- B çözeltisini hazırlamak için, DMEM'in 40 mL'sinde 80 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre.
- DNase I çözeltisi (7 mg/mL) hazırlamak için, 70 mg DNase I'i 10 mL DMEM'de çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre.
NOT: Burada özetlenen kollajenaz IV çözeltilerinin enzim konsantrasyonu, orijinal madde14'tebelirtilen konsantrasyonlara (2 mg/mL) göre değişir. Geçerli protokol, biraz daha yüksek canlılığa sahip hücreler verir. Ancak, her iki protokol tarafından izole hücreler aynı doku mimarisi ile organoidler üretirler.
2. Testis doku enzimatik sindirim
- Testisleri steril bir kabın içine toplayın ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testisleri %1 P/S içeren PBS içeren 100 mm'lik doku kültür kabına aktarın ve otoklavlı makas ve forseps kullanarak tunica vaginalis ve epididimleri çıkarın. İzole testislerini yeni bir 100 mm'lik tabağa aktarın ve %1 P/S içeren PBS ile iyice yıkayın.
- Kısırlığı korumak için, tunica albuginea testis parenkim soymak için steril makas ve forseps başka bir dizi kullanın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testisler kesin. Daha sonra iki forsep sinerek testisleri tunicadan soyun ve %1 P/S ile 1 mL DMEM içeren 100 mm'lik yeni bir tabağa yerleştirin.
- 1-2 mm doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testisler kıyma. Doğrama sonra, bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.
- Kolajenaz IV S(Malzeme Tablosu)için 0,4 mg/mL konsantrasyon ve kollajenaz IV W (Malzeme Tablosu)için 0,8 mg/mL konsantrasyon elde etmek için kıymalı doku parçalarını A solüsyonuna aktarın ve DMEM ile 50 mL'ye kadar yükseltin. ÇözeltiSi Doku parçalarını içeren 37 °C'lik su banyosuna 30 dakika yerleştirin, tüpleri her 5 dakikada bir hafifçe ters çevirin ve DNA salınımını görsel olarak kontrol edin.
- Serbest yüzen DNA gözlenirse 500 μL DNase I ekleyin. 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk frenle santrifüj edin ve süpernatantatın.
NOT: DNA bulutlu bir madde olarak görünür. Tüpler sarsıldığında doku parçaları durulunca DNA su üstünde kalır.
- Serbest yüzen DNA gözlenirse 500 μL DNase I ekleyin. 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk frenle santrifüj edin ve süpernatantatın.
- 1.2 mg/mL kollajenaz IV W konsantrasyonu elde etmek için tüpe B çözeltisi ekleyin ve DMEM ile 50 mL'ye kadar kontör ekleyin (Malzeme Tablosu). Tüpü 30 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir tüpü hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA gözlemlenirse 500 μL DNase I ekleyin.
- 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk santrifüj edin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 P / S ile PBS ile bir kez yıkayın.
NOT: Hem A hem de B çözeltisinden atılan süpernatantlar öncelikle interstisyel hücreler içerir. - 50 mL'ye kadar PBS ile tüpü toplayın. Tübülleri üstten dikkatlice toplayın ve yeni bir 50 mL tüpe yerleştirin.
NOT: Sindirilmemiş büyük doku parçaları hızla alt yerleşmek, sindirilmiş seminiferous tübüller süspansiyon kalır. Büyük doku parçaları toplanmamalıdır. Bu işlem, orijinal tüpteki çözelti neredeyse net olana ve sadece sindirilmemiş doku parçaları kalana kadar birkaç kez tekrarlanabilir. - 25 °C'de 90 x g'de tübülleri 1,5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantatın. Taze PBS ve santrifüj tekrar ekleyin. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın.
- Son PBS yıkadıktan sonra, supernatant çıkarın ve PBS 5 mL seminiferous tübüller resuspend. Daha sonra tübüllere %0,25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 15 mL ekleyin. Tüpü 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 2 dakikada bir hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA çok gözlenirse, 5 mL DMEM ile 500 μL DNase I ekleyin.
- Mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim ini değerlendirin (önce 5 dk sonra, sonra her 2 dakika). Çoğunlukla tek bir hücre tespit edilebiliyorsa, reaksiyonu 5 mL FBS ile durdurun ve 70 m'lik bir kafesten ve ardından 40 μm'lik bir kafesten filtreleyin.
NOT: Sindirim için kullanılan 50 mL tüplerin kapaklarının (A, B ve %0,25 tripsin-EDTA) düzgün bir şekilde sıkılmasına dikkat edilmelidir. Su banyosunda kontaminasyon bir sorun ise, parafin film sterilite sağlamak için kapak etrafında sarılmış olabilir. - 55 °C'de frenli 500 x g'deki tek hücreleri 5 dakika süreyle santrifüj edin, zenginleştirme ortamında (Dulbecco Modifiye Kartal Orta F/12 (DMEM/F12) %5 FBS ve %1 P/S içeren yeniden askıya alın ve canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre popülasyonu. Fix 100 x 103 hücreleri ve germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya gerçekleştirmek (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) olarak açıklanan12 ve bu başlangıç hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirlemek.
NOT: Germ hücre belirteci Promielositik lösemi çinko parmak proteini (PLZF)15 de UCHL1 için uygun bir alternatif olarak kullanılabilir. Başlangıç hücre popülasyonunda beklenen hücre verimi 700-800 x 109/g civarındadır. Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi %4-5 olmalıdır. - Bu başlangıç hücre popülasyonunun yaklaşık 20 x 106'sını iki ultra düşük ek 100 mm Petri kapasine (10 x 106 hücre dmem/F12'nin 10 mL'sinde her bir kapta %1 P/S içeren) doku kültürü kuluçka makinesinde 2 gün boyunca (37 °C) yerleştirin , 5% CO2,21% oksijen). Kalan hücrelerle germ hücre zenginleştirme gerçekleştirin.
NOT: Optimum canlılık ve hücre kalitesini sağlamak için germ hücre zenginleştirme ve müteakip nicelik gerçekleşirken, başlangıç hücre popülasyonu 2 gün boyunca ultra düşük ek doku kültürü yemeklerinde kültüre yerleştirilir.
3. Germ hücre zenginleştirme
NOT: Yukarıda açıklanan işlem öncelikle Sertoli hücreleri ve mikrop hücrelerini verir. Farklı yapışma özellikleri, Sertoli hücrelerinin ve mikrop hücrelerinin diferansiyel kaplama ile ayrılmasını sağlar.
- Tohum 20-25 x 1010 10 10 00 mm doku kültürü çanak başına başlangıç hücre nüfusunun 6 hücre zenginleştirme orta toplam hacmi (DMEM/ F12 ile% 5 FBS ve% 1 P / S) diferansiyel kaplama için. Hücreleri bir kuvöze yerleştirin (37 °C, %5 CO2,%21 O2) ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunun tabağa bağlanmasını sağlayın.
- 2 plakadan oluşan süpernatant'ı (çoğunlukla mikrop hücreleri içeren) bir 100 mm'lik yeni bir plakayla toplayın ve birleştirin ve kuvöze geri yerleştirin. 1 saat sonra, 2 plakanın supernatantını yeni bir 100 mm plakayla birleştirin. Plakaları bir gece için kuvöze geri yerleştirin.
NOT: Supernatants kombine öncelikle mikrop hücreleri içerecektir. Plakalar ile birlikte atılır yapışmış hücreler sertoli ve peritubüler miyoid hücreler gibi öncelikle testis somatik hücrelerdir. - Aşağıdaki gibi iki kesirler halinde zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak.
NOT: Zenginleştirilmiş mikrop hücreleri farklı, yapışmaz fraksiyonve hafif yapışmış fraksiyona yapışır. Bu fraksiyonların her ikisi de zenginleştirilmiş germ hücre popülasyonu oluşturur.- Non adherent fraksiyonu: supernatant toplamak.
- Hafif yapışma fraksiyonu: PBS ile yavaşça plakaları yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika için % 0,25 tripsin-EDTA% 0,25 seyreltme 2 mL ile tedavi, zenginleştirme orta 2 mL ile reaksiyonu durdurmak ve yapışmaz fraksiyonu olarak aynı tüp içinde toplamak.
NOT: 0.25% Trypsin-EDTA 1:20 trypsin çözeltisi üretmek için PBS ile seyreltilmiş olması gerekir.
- Hücre sayacı nı kullanan toplam hücre sayısını sayın, 100 x 103 hücreyi sabitleyin ve12'de açıklandığı gibi germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya yapın ve bu zenginleştirilmiş hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
NOT: Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi en az %60-70 olmalıdır. Sayısallaştırma için immünositokimya 1 gün gerektirdiğinden, zenginleştirilmiş hücreler optimum hücre kalitesi ve canlılığını sağlamak için süre boyunca %1 P/S ile takviye edilmiş DMEM/F12 ile ultra düşük bir eki 100 mm Petri kabına yerleştirilmelidir.
4. Tohumlama için hücrelerin hazırlanması
- Başlangıç hücresi preparatını hasat etmek için, süpernatantı ultra düşük eki 100 mm'lik tabaklardan 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Yapışan hücreleri toplamak için plakaları PBS ile şiddetle yıkayın. Enzimatik sindirime gerek yoktur.
NOT: Bazı testis hücreleri, öncelikle Sertoli hücreleri, biraz ultra düşük eki plakaları yapışabilir. - Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini birleştirerek %25'lik mikrop hücrelerini içeren çalışan bir hücre preparatını elde edin. 500 x g'de frenli 500 x g 5 dk, süpernatant atın ve organoid oluşum ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (DMEM/F12 insülin 10 μg/mL, transferrin 5.5 μg/mL, selenyum 6.7 ng/mL, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü , %1 P/S). Hücre yoğunluğunu mL başına 2,4 x 106 olarak ayarlayın.
NOT: Buprotokolde kullanılan mikrokuyu plakalarda her kuyu1.200 mikrokuyu içeriyordu. - Aşağıda açıklandığı gibi başına düşen hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
Kuyu başına düşen hücre sayısı = her organoid için kümelenecek mikrokuyu sayısı x hücre sayısı. - Her biri 1,000 hücreden organoid ler üretmek için her biri 1.200 x 1.000 hücreye sahip tohumlar=) 1.2 x 106 hücre. Hücre süspansiyonundaki hücre yoğunluğunu, hücrelerin 0,5 mL orta hacimde tohumlanmış bir şekilde ayarlayın. Her biri 1.000 hücreden oluşan organoidler için mL başına 2,4 x 106 hücre (0,5 mL'de 1,2 x 106 hücre) yoğunluğu kullanılır.
5. Hücre almak için mikrokuyuların hazırlanması
NOT: Hücrelerin mikrokuyu yüzeyine yapışmadığından emin olmak için, üretici tarafından satın alınabilecek bir yüzey aktif durulama çözeltisi ile tedavi edin.
- Her kuyuya 0,5 mL durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun. Hava kabarcıklarını temizlemek için, varsa, 25 °C'de 2 5 dakika frenlerle plakayı 2.000 x g'de santrifüj edin.
- Kabarcıkların mikrokuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için, düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.
- Kapağı kapağı ile kapak ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Durulama çözeltisi ile tedaviden sonra plakanın kurumaması için.
6. Testis organoidlerinin üretimi
- Her kuyuya 0,5 mL organoid oluşum ortamı (herhangi bir hücre olmadan) ekleyin ve 2.000 x g'de 25 °C'de frenlerle 2 dk.'lık bir hava baloncuklarını temizleyin. Hava kabarcıklarının kaldırıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında kuyuyu gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.
- Çalışma hücresi süspansiyonunun 0,5 mL'sini ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. 55 °C'de 500 x g'de 5 dakika frenli santrifüj.
- Plakayı 5 gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin.
- Herhangi bir organoid kaybetmeden orta değiştirmek için, menisküs dokunmak ve yavaş yavaş orta çizmek için yavaşça kuyu nun duvarına pipet ucu dokunun ve düşük. Aşağı düşerken menisküs takip emin olun. Taze ortam eklemek için, boru ucunu kuyunun aynı tarafındaki duvara orta çekme ile aynı tarafta takın ve kuyu duvarına hafifçe taze orta ekleyin ve yavaşça duvardan aşağı akmasını bekleyin.
- Organoidleri kurtarmak için, geniş bir ağız pipeti kullanarak orta yı hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Bu, organoidlerin mikrokuyulardan çıkmasını sağlar.
- Organoidleri toplamak, PBS ile yıkamak, germ hücre belirteci (UCH-L1), Sertoli hücre belirteci (GATA Bağlayıcı Protein 4-GATA4), peritübüler miyoid hücre belirteci (α-Smooth Muscle Actin-αSMA) ve Leydig hücre belirteci (Sitokrom) için immünositokimyayı düzeltmek ve gerçekleştirmek P450-CYP450) açıklandığı gibi12 ve bir konfokal mikroskop altında görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrowelllerde kendi kendine organize edilen 1 haftalık domuz testlerinden izole hücreler(Şekil 1A, Şekil 2), belirgin dış (seminifer epitel) ve iç bölmeler ( interstitium) (Şekil 1B, Şekil 2). İki bölme kollajen IV+ve bazmembran ile ayrılmıştır. UCH-L1+ve mikrop hücreleri ve GATA4+ve Sertoli hücreleri bodrum zarının dış bölmesinde ydi (Şekil 1B, Şekil 2). α-SMA+ve peritubüler miyoid hücreler bodrum zarının iç boyunca lokalize edildi, Sitokrom P450+ve Leydig hücreleri interstitiumun merkezinde idi(Şekil 1B, Şekil 2). Bu yapı (Şekil 2) yerinde koşullarda benzer (Şekil 1C), Leydig hücreleri, peritubüler miyoid hücreler interstisyel bölmede interstitium bulunmaktadır; ve mikrop hücreleri, Sertoli hücreleri seminiferous epitel bulunur.
Şekil 1: Mikroiyiztli testis organoidleri ters topografya ile testis-spesifik doku mimarisi sergilerler. (A) Mikrokuyu kültüründe 0, 3 ve 5 günlük domuz testis hücreleri. (B) Belirli hücre tiplerini tanımlayan testis organoidlerinin immünororesans görüntüleri: Sertoli hücreleri (GATA4), bazal membran (Kollajen IV); mikrop hücreleri (UCH-L1); peritubüler mioid hücreler (α-SMA); Leydig hücreleri (CYP450). (C) Histolojik görünüm (H&E) ve 1 haftalık domuz testislerinin şematik gösterimi. Belirli hücre türleri karşılık gelen oklarla gösterilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakam Sakib ve ark.12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Organoid oluşumun şematik gösterimi. İzole tek testis hücreleri, testis organoidleri üretmek için 5 gün boyunca mikrowelllerde tohumlanır ve kültürlenir. Bu rakam Sakib ve ark.12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz in vivo12testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis12için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,9,10,11 üretmek için farklı yöntemlerbildirilmiştir. Baert ve ark. yetişkin insan testislerinin desellizasyonu ile elde edilen ekstra hücresel matriks (ECM) ile testis hücrelerinin kültürlenmesi ile yetişkin ve ergenlik öncesi örneklerden insan testis organoidleri11. Bu model farklı testis morfolojisi olmamasına rağmen, organoidler testosteron ve sitokinler salgılayabilir11. Başka bir insan organoid modeli Pendergraft ve ark. tarafından solubilize testis ECM proteinleri ve organoidler testosteron üretebilir kullanılan bir asılı damla kültür yöntemi kullanılarak bildirilmiştir8. Alves-Lopes ve ark. sıçanlardan testis organoidleri oluşturmak için benzersiz bir üç katmanlı bazik membran matris (örneğin, Matrigel) gradyan sistemi kullanılır10. Bu sistemdeki hücreler kan testisleri bariyeri olan tübüler yapılar oluşturdular. Bu tübül benzeri yapılardaki mikrop hücreleri de retinoik asit stimülasyonuna duyarlı ydı10. Tüm bu yöntemler biraz karmaşık ve yüksek iş elde etme tahlilleri için kullanmak zor. Buna karşılık, mikrowell sistemi basit, tekrarlanabilir, organotipik testis organoidler üretebilir ve yüksek iş artışı ilaç ve toksisite tahlilleri için kullanılabilir.
Burada özetlenen yöntemde bir hücre yoğunluğu 1.000 hücre/ microwell (1.000 hücre/ organoid) kullanmış olsa da, bu yöntem 125 hücre/microwell12gibi az organoidler oluşturmak için kullanılabilir. Bu, sınırlı numunelerle denemeler yaparken özellikle kullanılabilir.
Eğer santrifüj sırasında plaka doğru şekilde dengelenmemişse, hücrelerin düzensiz dağılımı değişken boyut ve şekle sahip organoidlerin oluşumuna neden olabilir. Microwell plakasını düzgün bir şekilde dengelemeye özen verilmelidir. Hücreler tohumlandıktan sonra, ortam değişiklikleri sırasında plakanın işlenmesine dikkat edilmelidir. Kuvözden çıkarırken plakayı çok fazla sallamak veya ortam değişiklikleri sırasında türbülans yaratmak bazı organoidlerin mikrowelllerden çıkmasına ve diğerleriyle kaynaştırmaya neden olabilir13.
Memeli germ hücre niş karmaşık ve çok hücreli. Sertoli hücreleri, peritubüler miyoid hücreler, Leydig hücreleri gibi testis farklı hücreler tüm germ hücre bakımı ve kaderkatkıda 16,17. Organoid sistemimiz belirli hücre tiplerinde farklı sinyal yollarını manipüle etmek için kullanılabilir. Bir gen yukarı veya aşağı germ hücreleri veya peritübüler miyoid hücreler, Sertoli hücreleri gibi diğer testis somatik hücrelerde denetlenebilir. Bu modifiye hücreler daha sonra modifiye testis organoidler oluşturmak için diğer testis hücreleri ile kombine edilebilir, daha sonra ECM birikimi üzerinde düzenleme etkilerini incelemek için kullanılabilir, morfogenez, hücre-hücre sinyalizasyonu, ve spermatogenez. Bu tür değişiklikler de ilaç taramaları için özel hastalık fenotipleri oluşturmak için yapılabilir. Asma damla veya ultra düşük eki U-alt plakaları 8 kültür gibi küresel organoidlerin üretimi için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında,microwell sistemi kullanarak daha erişilebilir ve izin veren bir testis organoid modeli için izin verdi Değişiklik. Örneğin, mikrop hücreleri genetik olarak değiştirilebilir veya deneysel faktörlerle tedavi edilebilir ve basit santrifüj ile önceden yapılmış vahşi tip organoid üzerine yerleştirilir ve downstream etkileri için gözlenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Ungrin'in bir mucit olarak AggreWell teknolojisine finansal bir ilgisi var.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH/NICHD HD091068-01 tarafından Dr. Ina Dobrinski tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
