Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour la génération reproductible des organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de tissu de testicule utilisant le système commercial disponible de culture de microwell.

Abstract

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles composées de plusieurs types de cellules qui sont capables de récapituler l'architecture tissulaire et les fonctions des organes in vivo. La formation d'organoïdes a ouvert différentes voies de recherche fondamentale et translationnelle. Ces dernières années, les organoïdes testiculaires ont suscité l'intérêt dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine. Les organoïdes testiculaires permettent l'étude des interactions cellules-cellules, du développement des tissus et du microenvironnement de niche des cellules germinales et facilitent le dépistage des médicaments à haut débit et de la toxicité. Une méthode est nécessaire pour générer de façon fiable et reproductible des organoïdes testiculaires avec l'architecture spécifique de tissu de testicule. Le système de culture des micropuits contient un réseau dense de micropuits en forme de pyramide. Les cellules testiculaires dérivées des testicules pré-puberté sont centrifugeuses dans ces micropuits et cultivées pour produire des organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu testis-spécifique et les associations cellulaires. Des milliers d'organoïdes homogènes peuvent être générés par ce processus. Le protocole rapporté ici sera d'un grand intérêt pour les chercheurs qui étudient la reproduction masculine.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ces dernières années, il y a eu un regain d'intérêt pour les organoïdes tridimensionnels (3D). Différents organes tels que l'intestin1, estomac2, pancréas3,4, foie5, et le cerveau6 ont été avec succès dérivés dans les systèmes organoïdes 3D. Ces organoïdes ont des similitudes architecturales et fonctionnelles avec les organes in vivo et sont plus biologiquement pertinents pour l'étude du microenvironnement tissulaire que les systèmes de culture monocouches7. En conséquence, organoïdes testiculaires ont commencé à susciter l'intérêt ainsi8,9,10,11,12. La majorité des méthodes signalées jusqu'à présent sont complexes, sans haut débit10 et nécessitent l'ajout de protéines ECM8,10. Cette complexité entraîne également des problèmes de reproductibilité. Une méthode simple et reproductible est nécessaire qui permet la génération d'organoïdes testiculaires avec des cellules-associations qui sont comme le testicule in vivo.

Nous avons récemment signalé un système pour répondre à ces exigences12. En utilisant le porc comme modèle, nous avons utilisé une approche centrifuge d'agrégation forcée dans le système de micropuits. Dans le système de micropuits, chaque puits contient un grand nombre de micropuits identiques plus petits13. Cela permet la génération de nombreux sphéroïdes de taille uniforme. Le système de micropuits a permis la génération d'un grand nombre d'organoïdes uniformes avec une architecture spécifique aux testis. Le système est simple et ne nécessite pas l'ajout de protéines ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

REMARQUE : Les testicules des porcelets d'une semaine ont été obtenus à partir d'une ferme porcine commerciale comme sous-produit de la castration de porcs commerciaux. L'approvisionnement en testicules a été approuvé par le Comité des soins aux animaux de l'Université de Calgary.

1. Préparation de solutions enzymatiques pour la digestion des tissus

REMARQUE : Trois solutions enzymatiques différentes sont nécessaires, qui comprennent deux solutions différentes de collagène IV (solution A, B) et une solution de désoxyribonuclease I (DNase I).

  1. Pour préparer la solution A, dissoudre 20 mg de collagène IV S(Tableau des matériaux) et 40 mg de collagène IV W (Tableau des matériaux) dans 25 mL de moyenne d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m. Ajouter 0,4 ml de sérum bovin fœtal (SF) à la solution A pour inhiber l'activité de la trypsine.
  2. Pour préparer la solution B, dissoudre 80 mg de collagène IV W (Table of Materials) en 40 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m.
  3. Pour préparer la solution DNase I (7 mg/mL), dissoudre 70 mg de DNase I dans 10 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m.
    REMARQUE: La concentration enzymatique pour les solutions de collagène IV décrites ici, varie des concentrations (2 mg/mL) énoncées dans l'articleoriginal 14. Le protocole actuel donne des cellules avec une viabilité légèrement plus élevée. Cependant, les cellules isolées par les deux protocoles produisent des organoïdes avec l'architecture de tissu identique.

2. Digestion enzymatique de tissu de testis

  1. Recueillir les testicules dans un bécher stérile et laver avec du phosphate tamponné salin (PBS) contenant 1% de pénicilline/streptomycine (P/S). Après le lavage, transférer les testicules dans un plat de culture tissulaire de 100 mm avec PBS contenant 1% P/S et enlever la tunica vaginalis et l'épididyme à l'aide de ciseaux et de forceps autoclaved. Transférer les testicules isolés dans un nouveau plat de 100 mm et laver soigneusement avec du PBS contenant 1 % de P/S.
  2. Pour maintenir la stérilité, utilisez un autre ensemble de ciseaux et de forceps stériles pour éplucher le parenchyme testiculaire de la tunica albuginea. Couper les testicules le long de l'axe longitudinal directement sous la tunica. Ensuite, épluchez les testicules hors de la tunica à l'aide de deux forceps et placez-les dans un nouveau plat de 100 mm contenant 1 ml de DMEM avec 1% P/S.
  3. Émincer les testicules pelés avec des ciseaux stériles en morceaux de tissu de 1 à 2 mm. Après le hachage, utilisez des forceps stériles pour enlever les fragments blancs de tissu conjonctif.
  4. Transférer les morceaux de tissu haché dans la solution A et le garnir jusqu'à 50 ml avec dMEM pour obtenir une concentration de 0,4 mg/mL pour la collagène IV S (Tableau des matériaux) et une concentration de 0,8 mg/mL pour la collagène IV W (Tableau des matériaux). Placez la solution A contenant les morceaux de tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min, inversez délicatement les tubes toutes les 5 min et vérifiez visuellement la libération d'ADN.
    1. Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre. Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant.
      REMARQUE : L'ADN apparaîtrait comme une substance trouble. Lorsque les tubes sont secoués, les morceaux de tissu s'installent alors que l'ADN resterait à flot.
  5. Ajouter la solution B au tube et recharger jusqu'à 50 ml avec DMEM pour obtenir une concentration de 1,2 mg/ml de collagène IV W(tableau des matériaux). Placez le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min et inversez doucement le tube toutes les 5 min. Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre.
  6. Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min. Après que jeter le supernatant et laver une fois avec PBS avec 1% P / S.
    REMARQUE : Les supernatants jetés des deux solutions A et B contiendront principalement des cellules interstitielles.
  7. Rehaussez le tube avec pbS jusqu'à 50 ml. Recueillir soigneusement les tubules du haut et les placer dans un nouveau tube de 50 ml.
    REMARQUE : Les gros fragments de tissus non digérés se déposent rapidement au fond, tandis que les tubules séminifères digérés resteront en suspension. Aucun gros fragment de tissu ne doit être recueilli. Cette procédure peut être répétée plusieurs fois jusqu'à ce que la solution dans le tube d'origine soit presque claire et que des fragments de tissu non digérés restent, ce qui peut être éliminé.
  8. Centrifuger les tubules à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant. Ajouter à nouveau le PBS frais et la centrifugeuse. Répétez cette étape de lavage deux fois.
  9. Après le dernier lavage PBS, retirer le supernatant et resuspendre les tubules séminiferous dans 5 ml de PBS. Ajouter ensuite 15 ml d'acide trypsin-éthylèneetélènetetraacetic (EDTA) aux tubules. Placer le tube dans un bain d'eau de 37 oC et inverser délicatement toutes les 2 minutes. Si beaucoup d'ADN flottant est observé, ajoutez 500 l de DNase I avec 5 mL de DMEM.
  10. Évaluer la digestion enzymatique des tubules en cellules individuelles au microscope (d'abord après 5 min, puis toutes les 2 min). Si la plupart du temps des cellules simples peuvent être détectées, arrêtez la réaction avec 5 ml de FBS et filtrez à travers un maillage de 70 m, puis à travers un maillage de 40 m.
    REMARQUE : Il faut prendre soin de serrer correctement les bouchons des tubes de 50 ml utilisés pour la digestion (Solution A, B et 0,25 % trypsine-EDTA). Si la contamination dans le bain d'eau est un problème, film de paraffine peut être enroulé autour du bouchon pour assurer la stérilité.
  11. Centrifuger les cellules individuelles à 500 x g avec des freins à 25 oC pendant 5 min, resuspendre dans le milieu d'enrichissement (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contenant 5 % de FBS et 1 % de P/S) et compter le nombre de cellules viables. C'est la population de cellules de départ. Fixer 100 x 103 cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) comme décrit12 et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population de cellules de départ.
    REMARQUE : Le marqueur de cellules germinales Promyelocytic le virus de la leucémie à zinc (PLZF)15 pourrait également être utilisé comme alternative appropriée pour UCHL1. Dans la population de cellules de départ, le rendement cellulaire prévu est d'environ 700-800 x 109/g de tissu. Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être de 4-5%.
  12. Placer environ 20 x 106 de cette population de cellules de départ dans deux plats Petri ultra faiblement en attachement 100 mm (10 x 106 cellules suspendues dans 10 ml de DMEM/F12 contenant 1% de P/S dans chaque plat) pendant 2 jours dans un incubateur de culture tissulaire (37 oC , 5% CO2, 21% d'oxygène). Effectuer l'enrichissement des cellules germinales avec les cellules restantes.
    REMARQUE : Pour assurer la viabilité optimale et la qualité cellulaire, tandis que l'enrichissement des cellules germinales et la quantification subséquente ont lieu, la population de cellules de départ est placée en culture dans des plats de culture de tissus ultra faiblement attachés pendant 2 jours.

3. L'enrichissement des cellules germinales

REMARQUE : La procédure décrite ci-dessus donne principalement des cellules de Sertoli et des cellules germinales. Différentes propriétés d'adhérence permettent la séparation des cellules de Sertoli et des cellules germinales par placage différentiel.

  1. Graines 20-25 x 106 cellules de la population de cellules de départ par plat de culture tissulaire de 100 mm dans un volume total de 8 ml de milieu d'enrichissement (DMEM/F12 avec 5% FBS et 1% P/S) pour le placage différentiel. Placer les cellules dans un incubateur (37 oC, 5 % CO2, 21 % O2) et après 1,5 h, s'assurer que la majorité des cellules Sertoli se fixent à la plaque.
  2. Recueillir et combiner le supernatant (contenant principalement des cellules germinales) de 2 plaques à une nouvelle plaque de 100 mm et le remettre dans l'incubateur. Après 1 h, regroupez à nouveau le supernatant de 2 plaques dans une nouvelle plaque de 100 mm. Remettre les assiettes dans l'incubateur pour la nuit.
    REMARQUE : Les supernatants combinés contiendront principalement des cellules germinales. Les cellules adhérentes qui sont jetées avec les plaques sont principalement des cellules somatiques testiculaires telles que Sertoli et les cellules myoïdes périurtiques.
  3. Recueillir les cellules germinales enrichies en deux fractions comme suit.
    REMARQUE : Les cellules germinales enrichies adhèrent différemment, fraction non adhérente et fraction légèrement adhérente. Ces deux fractions forment ensemble la population de cellules germinales enrichies
    1. Fraction non adhérente : collectez le supernatant.
    2. Fraction légèrement adhérente : lavez les assiettes doucement avec du PBS, traitez avec 2 ml de dilution de 1:20 de 0,25 % trypsine-EDTA pendant 5 min à température ambiante, arrêtez la réaction avec 2 ml de milieu d'enrichissement et collectez dans le même tube que la fraction non adhérente.
      REMARQUE: 0,25% Trypsin-EDTA doit être dilué avec PBS pour produire une solution 1:20 trypsin.
  4. Compter le nombre total de cellules à l'aide d'un compteur cellulaire, fixer 100 x 103 cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 comme décrit12 et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire enrichie.
    REMARQUE : Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être d'au moins 60-70%. Puisque l'immunocytochimie pour la quantification exigerait 1 jour, les cellules enrichies devraient être placées dans un plat de Petri ultra bas d'attachement 100 mm avec DMEM/F12 complété avec 1% P/S pour la durée pour assurer la qualité et la viabilité optimales de cellules.

4. Préparation des cellules pour l'ensemencement

  1. Pour récolter la préparation de la cellule de départ, recueillir le supernatant dans un tube de 50 ml de la vaisselle ultra faible de 100 mm. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour recueillir les cellules adhérentes. Aucune digestion enzymatique n'est nécessaire.
    REMARQUE : Certaines cellules testiculaires, principalement des cellules de Sertoli, peuvent légèrement adhérer aux plaques d'attachement ultra basses.
  2. Combinez la préparation des cellules de départ et les cellules germinales enrichies pour obtenir une préparation de cellules de travail contenant 25 % de cellules germinales. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min, jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans le milieu de formation organoïde (DMEM/F12 complété par de l'insuline 10 g/mL, transferin 5,5 g/mL, sélénium 6,7 ng/mL, 20 ng/mL de croissance du facteur épidermique , 1 % P/S). Ajuster la densité cellulaire à 2,4 x 106 par ml.
    REMARQUE : Chaque puits dans les plaques de micropuits utilisés13 dans ce protocole contenait 1 200 micropuits.
  3. Utilisez la formule ci-dessous pour calculer le nombre de cellules par puits comme décrit ci-dessous.
    Nombre de cellules par puits - nombre de micropuits x nombre de cellules à regrouper pour chaque organoïde.
  4. Pour générer des organoïdes à partir de 1 000 cellules chacune, ensemencez chacune avec (1 200 x 1 000 cellules chacune) 1,2 x 106 cellules. Ajuster la densité cellulaire dans la suspension cellulaire de manière à ce que les cellules soient ensemies dans un volume de 0,5 ml de milieu. Pour les organoïdes formés à partir de 1 000 cellules chacune, utilisez une densité de 2,4 x 106 cellules par mL (1,2 x 106 cellules en 0,5 ml).

5. Préparation des micropuits pour recevoir les cellules

REMARQUE : Pour s'assurer que les cellules n'adhèrent pas à la surface du micropuits, traitez-les avec une solution de rinçant de surfactant qui est disponible à l'achat par le fabricant.

  1. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçant à chaque puits. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée dans le puits. Pour enlever les bulles d'air, le cas échéant, centrifuger la plaque à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min.
  2. Observez la plaque sous un microscope inversé à faible grossissement, pour vérifier que les bulles ont été retirées des micropuits. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.
  3. Couvrir la plaque avec le couvercle et couver pendant 30 min à température ambiante. Une fois le traitement terminé, retirer la solution de rinçant et laver immédiatement la plaque avec de l'eau stérile ou du PBS. Assurez-vous que la plaque ne se dessèche pas après le traitement avec la solution de rinçant.

6. Génération d'organoïdes testiculaires

  1. Ajouter 0,5 ml de milieu de formation d'organoïdes (sans cellules) à chaque puits et centrifugeuse à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min pour éliminer les bulles d'air emprisonnées. Observez le puits sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles d'air ont été enlevées. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.
  2. Ajouter 0,5 ml de suspension de la cellule de travail et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min. Utilisez un microscope inversé pour vérifier que les cellules se sont regroupées dans les micropuits.
  3. Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et la culture pendant 5 jours. Changer la moitié du support tous les deux jours.
    1. Pour changer de milieu sans perdre d'organoïdes, touchez la pointe de la pipette à la paroi du puits et baissez doucement pour toucher le ménisque et dessinez lentement le milieu. Assurez-vous de suivre le ménisque au fur et à mesure qu'il tombe. Pour ajouter le milieu frais, touchez la pointe de pipette au mur du puits sur le même côté que le retrait moyen et ajoutez le milieu frais doucement contre le mur de puits, lui permettant de couler lentement en bas du mur.
  4. Pour récupérer les organoïdes, pipette doucement le milieu de haut en bas à l'aide d'une pipette à large bouche. Cela permettrait aux organoïdes de sortir des micropuits.
  5. Recueillir les organoïdes, laver avec du PBS, fixer et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales (UCH-L1), marqueur cellulaire Sertoli (GATA Binding Protein 4-GATA4), marqueur de cellules myoïdes périubulaires (Actin-SMA muscle lisse) et marqueur cellulaire Leydig (Cytochrome P450-CYP450) comme décrit12 et visualiser sous un microscope confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellules isolées de testicules porcins d'une semaine qui ont été cultivés dans les micropuits auto-organisés en sphéroïdes (Figure 1A, Figure 2), avec un extérieur délimité et distinct (épithélium séminifère) et des compartiments intérieurs ( interstitium) (Figure 1B, Figure 2). Les deux compartiments ont été séparés par une membrane de sous-sol de collagèneIV-ve. Les cellules germinales UCH-L1et les cellules GATA4et Ve Sertoli se trouvaient dans le compartiment extérieur de la membrane du sous-sol(figure 1B, figure 2). Les cellules myoïdes périituques de l'AMS ont été localisées le long de l'intérieur de la membrane du sous-sol, tandis que les cellules Cytochrome P450et Ve Leydig se trouvaient au centre de l'interstitium (Figure 1B, Figure 2). Cette structure (figure 2) est semblable aux conditions in situ (figure 1C), où les cellules de Leydig, les cellules myodoïdes périubulaires sont situées dans l'interstitium dans le compartiment interstitiel ; et les cellules germinales, les cellules de Sertoli sont situées à l'épithélium séminifère.

Figure 1
Figure 1 : Les organoïdes testiculaires dérivés de Microwell présentent une architecture tissulaire spécifique au testis avec une topographie inversée. (A) Cellules testiculaires porcines à 0, 3 et 5 jours de culture de micropuits. (B) Images immunofluorescences d'organoïdes testiculaires identifiant des types de cellules spécifiques : cellules Sertoli (GATA4), membrane du sous-sol (Collagen IV); cellules germinales (UCH-L1); cellules myoïdes périlogulaires (-SMA); Cellules de Leydig (CYP450). (C) Apparence histologique (H et E) et représentation schématique des testicules de porc d'une semaine. Des types de cellules spécifiques sont indiqués avec des flèches correspondantes. Barres d'échelle de 50 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Sakib et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la formation organoïde. Des cellules testiculaires uniques isolées sont enseissées et cultivées dans les micropuits pendant 5 jours pour produire des organoïdes testiculaires. Ce chiffre a été modifié à partir de Sakib et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nous avons établi une méthode simple qui permet la génération cohérente et reproductible d'un grand nombre d'organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu qui est semblable au testicule in vivo12. Bien que l'approche ait été développée à l'aide de cellules de testicules porcines, elle s'applique plus largement aussi aux testicules de souris, de primates non humains et de testicules humains12. Un certain nombre de méthodes différentes ont été rapportées pour produire des organoïdes testiculaires8,9,10,11. Baert et coll. ont produit des organoïdes testiculaires humains à partir d'échantillons adultes et pré-pubères en creurbant des cellules testiculaires avec une matrice cellulaire supplémentaire (ECM) obtenue par décellularisation des testicules humains adultes11. Bien que ce modèle n'ait pas eu la morphologie testiculaire distincte, les organoïdes pourraient sécrétiser la testostérone et les cytokines11. Un autre modèle organoïde humain a été rapporté par Pendergraft et autres utilisant une méthode de culture de chute pendante qui a utilisé les protéines testiculaires solubilized d'ECM et les organoïdes pourraient produire la testostérone8. Alves-Lopes et coll. ont utilisé un système unique de gradient de membrane de sous-sol à trois couches (p. ex. Matrigel) pour générer des organoïdes testiculaires à partir de rats10. Les cellules de ce système ont généré des structures tubulaires qui avaient une barrière de testicules sanguins. Les cellules germinales dans ces structures tubule-like étaient également sensibles à la stimulation d'acide rétinoïque10. Toutes ces méthodes sont quelque peu complexes et difficiles à utiliser pour les tests de débit élevé. En revanche, le système de micropuits est simple, reproductible, peut générer des organoïdes testiculaires organotypiques et peut être utilisé pour les médicaments à haut débit et les tests de toxicité.

Bien que dans la méthode décrite ici, nous avons utilisé une densité cellulaire 1000 cellules / micropuits (1000 cellules / organoïde), cette méthode peut être utilisée pour générer des organoïdes avec aussi peu que 125 cellules / micropuits12. Cela peut être d'une utilité particulière lors de l'expérimentation avec des échantillons limités.

Si la plaque n'est pas correctement équilibrée pendant la centrifugation, une distribution inégale des cellules peut provoquer la génération d'organoïdes de taille et de forme variables. Il faut prendre soin d'équilibrer correctement la plaque du micropuits. Une fois que les cellules ont été ensemencées, l'attention devrait être accordée à la manipulation de la plaque pendant les changements de médias. Secouer la plaque trop lors de sa sortie de l'incubateur ou de créer de la turbulence pendant les changements médiatiques peut provoquer certains des organoïdes de sortir des micropuits et fusionner avec d'autres13.

La niche des cellules germinales des mammifères est complexe et multicellulaire. Les différentes cellules dans les testicules telles que les cellules Sertoli, les cellules myodoïdes périubulaires, les cellules de Leydig contribuent toutes à l'entretien des cellules germinales et le destin16,17. Notre système organoïde peut être utilisé pour manipuler différentes voies de signalisation dans des types de cellules spécifiques. Un gène d'intérêt peut être régulé vers le haut ou vers le bas dans les cellules germinales ou d'autres cellules somatiques testiculaires telles que les cellules myodoïdes périubulaires, les cellules Desertoli. Ces cellules modifiées peuvent ensuite être combinées avec d'autres cellules testiculaires pour générer des organoïdes testiculaires modifiés, qui peuvent ensuite être utilisés pour étudier les effets de l'édition sur le dépôt d'ECM, la morphogénèse, la signalisation cellulaire et la spermatogénèse. De telles modifications peuvent également être effectuées pour générer des phénotypes spécifiques de la maladie pour le dépistage des médicaments. Comparé à d'autres méthodes pour la génération d'organoïdes sphéroïdes tels que la culture dans les gouttes suspendues ou ultra faible attachement U-bottom plaques8, en utilisant le système de micropuits a permis un modèle organoïde testiculaire qui est plus accessible et permet de modifications. Par exemple, les cellules germinales peuvent être génétiquement modifiées ou traitées avec des facteurs expérimentaux et placées sur un organoïde de type sauvage préfabriqué par simple centrifugation et observée s'il y a des effets en aval.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M. Ungrin a un intérêt financier dans la technologie AggreWell en tant qu'inventeur.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NIH/NICHD HD091068-01 à la Dre Ina Dobrinski.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32, (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545, (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96, (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7, (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8, (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100, (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56, (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92, (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113, (7), 1829-1834 (2016).
Génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter