Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

माइक्रोवेल संस्कृति का उपयोग करके टेस्टिस विशिष्ट वास्तुकला के साथ पोरसिन वृषण ऑर्गनॉइड्स का उत्पादन

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387
Automatic Translation
1, 3,4, 2, 2,3,4, 1,2
1Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 2Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary, 3Biomedical Engineering Graduate Program, University of Calgary, 4Alberta Diabetes Institute, University of Alberta

Summary

यहाँ, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microwell संस्कृति प्रणाली का उपयोग वृषण विशिष्ट ऊतक वास्तुकला के साथ porcin वृषण organoids के reproduible पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

Organoids तीन आयामी कई प्रकार है कि ऊतक वास्तुकला और विवो में अंगों के कार्यों recapitulating करने में सक्षम हैं से बना संरचनाओं रहे हैं. ऑर्गेनोइड्स के गठन ने बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान के विभिन्न रास्ते खोल दिए हैं। हाल के वर्षों में, वृषण organoids पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में रुचि बढ़ी है. वृषण organoids सेल सेल बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं, ऊतक विकास, और रोगाणु सेल आला microenvironment और उच्च थ्रूपुट दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग की सुविधा. एक विधि मज़बूती से और reproducibly वृषण विशिष्ट ऊतक वास्तुकला के साथ वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. माइक्रोवेल संस्कृति प्रणाली पिरामिड के आकार microwells के एक घने सरणी शामिल हैं. पूर्व-पबरताल वृषण से प्राप्त वृषण कोशिकाओं को इन माइक्रोवेल्स में centrifuged और वृषण-विशिष्ट ऊतक वास्तुकला और सेल संघों के साथ वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं। सजातीय organoids के हजारों इस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है. यहाँ रिपोर्ट प्रोटोकॉल पुरुष प्रजनन का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए व्यापक हित का हो जाएगा.

Introduction

हाल के वर्षों में, वहाँ तीन आयामी (3 डी) organoids में ब्याज की एक पुनरुत्थान किया गया है. विभिन्न अंगों जैसे आंत1, पेट2, अग्न्याशय3,4,यकृत5, और मस्तिष्क6 को सफलतापूर्वक 3 डी ऑर्गनॉइड सिस्टम में प्राप्त किया गया है। इन organoids vivo में अंगों के लिए वास्तु और कार्यात्मक समानताएं हैं और मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली7की तुलना में ऊतक सूक्ष्म पर्यावरण के अध्ययन के लिए और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक हैं . इसके परिणामस्वरूप , वृषण अंगाभों ने भीरुचिजुटाना शुरू कर दिया है. अब तक सूचित अधिकांश विधियां जटिल, गैर उच्च थ्रूपुट10 हैं और इसके लिए ईसीएम प्रोटीन8,10के अलावा की आवश्यकता होती है . यह जटिलता भी reproducibility के साथ मुद्दों की ओर जाता है. एक सरल और reproduible विधि की जरूरत है कि सेल-एसोसिएशन कि विवो में वृषण की तरह हैं के साथ वृषण organoids की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.

हमने हाल ही में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक प्रणाली की सूचना दीहै. एक मॉडल के रूप में सुअर का उपयोग करना, हम microwell प्रणाली में एक केन्द्रापसारक मजबूर एकत्रीकरण दृष्टिकोण कार्यरत हैं. माइक्रोवेल प्रणाली में, प्रत्येक कुएं में बड़ी संख्या में समान छोटे माइक्रोवेल्स13होते हैं। यह एक समान आकार के कई गोलभों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. माइक्रोवेल प्रणाली एक वृषण-विशिष्ट वास्तुकला के साथ एक समान organoids की बड़ी संख्या के उत्पादन में सक्षम. प्रणाली सरल है और ECM प्रोटीन के अलावा की आवश्यकता नहीं है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: 1 सप्ताह पुराने piglets से टेस्ट वाणिज्यिक सूअरों के castration से उप-उत्पाद के रूप में एक वाणिज्यिक सुअर खेत से प्राप्त किए गए थे। परीक्षण ों की सोर्सिंग कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. ऊतक पाचन के लिए एंजाइम समाधान की तैयारी

नोट: तीन अलग एंजाइमी समाधान की जरूरत है, जो दो अलग collagenase चतुर्थ समाधान (समाधान ए, बी) और एक deoxyribonuclease मैं (DNase मैं) समाधान शामिल हैं.

  1. समाधान A तैयार करने के लिए, 20 मिलीग्राम कोलैजास IV S (सामग्री की तालिका) और 40 मिलीग्राम कोलैकेनेस IV W ( सामग्री कीतालिका) 25 एमएल में उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) भंग. फिर एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर. trypsin गतिविधि को बाधित करने के लिए समाधान ए के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 0.4 एमएल जोड़ें.
  2. घोल ख तैयार करने के लिए, डीएमईएम के 40 एमएल में कोलाजनेस IV ड (सामग्री की तालिका) की 80 मिलीग्राम भंग करें। फिर एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर.
  3. DNase I समाधान (7 mg/mL) तैयार करने के लिए, DMEM के 10 एमएल में DNase I की 70 मिलीग्राम भंग करें। फिर एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर.
    नोट: कोलैज़ानेस चतुर्थ समाधान के लिए एंजाइम एकाग्रता यहाँ उल्लिखित, सांद्रता से भिन्न होता है (2 mg/mL) मूल लेख14में कहा गया है. वर्तमान प्रोटोकॉल थोड़ा उच्च व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं पैदावार. हालांकि, दोनों प्रोटोकॉल द्वारा अलग कोशिकाओं समान ऊतक वास्तुकला के साथ organoids का उत्पादन.

2. टेस्टिस ऊतक एंजाइमी पाचन

  1. वृषणों को एक बाँझ बीकर में एकत्र करें और फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) से धोएं जिसमें 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) शामिल हैं। धोने के बाद, 1% पी एस युक्त पीबीएस के साथ एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान के लिए testes हस्तांतरण और autoclaved कैंची और forceps का उपयोग कर tunica योनि और epididymis हटा दें. अलग testes एक नया करने के लिए स्थानांतरण 100 मिमी पकवान और PBS युक्त 1% पी /
  2. बाँझपन बनाए रखने के लिए, बाँझ कैंची और forceps का एक और सेट का उपयोग करने के लिए वृषण पैरेन्काइमा tunica albuginea से बाहर छील. टेन्चों को अनुदैर्घ्य अक्ष के साथ सीधे ट्यूनिका के नीचे काटें। फिर दो forceps का उपयोग कर tunica से बाहर testes छील और 1% पी /
  3. 1-2 मिमी ऊतक के टुकड़ों में बाँझ कैंची के साथ खुली testes mince. काट के बाद, बाँझ बल्स का उपयोग करने के लिए संयोजी ऊतक के सफेद टुकड़े को दूर.
  4. कीमा बनाया हुआ ऊतक के टुकड़े समाधान ए में स्थानांतरित करें और इसे DMEM के साथ 50 एमएल तक ऊपर ले जाएं ताकि कोलैजा चतुर्थ एस (सामग्री की तालिका) के लिए 0.4 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता प्राप्त की जा सके और कोलाजनेस IV डब्ल्यू ( सामग्री की तालिका ) के लिए 0.8 मिलीग्राम/एमएलकीसांद्रता प्राप्त की जा सके . 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ऊतक के टुकड़े युक्त समाधान एक जगह है, धीरे ट्यूब हर 5 मिनट उलटा और डीएनए की रिहाई के लिए नेत्रहीन की जाँच करें।
    1. यदि मुक्त अस्थायी डीएनए मनाया जाता है तो DNase I का 500 $L जोड़ें। 30 मिनट के बाद, ट्यूब को 90 x ग्राम पर 1.5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ अपकेंद्रण करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
      नोट: डीएनए एक बादल पदार्थ के रूप में दिखाई देगा. जब ट्यूब हिल रहे हैं, ऊतक टुकड़े नीचे बसने जबकि डीएनए बचाए रहेंगे.
  5. ट्यूब में विलयन बी जोड़ें और DMEM के साथ 50 एमएल तक ऊपर की ओर कोलैजानेस IV (सामग्री कीतालिका)की सांद्रता प्राप्त करने के लिए। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखें और धीरे से ट्यूब हर 5 मिनट उलटें. यदि मुक्त चल डीएनए मनाया जाता है तो DNase I के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  6. 30 मिनट के बाद, ट्यूब को 90 x ग्राम पर 1.5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ अपकेंद्रण। उसके बाद supernatant त्याग और 1% पी /
    नोट: दोनों समाधान ए और बी से खारिज supernatants मुख्य रूप से अंतरालीय कोशिकाओं को शामिल किया जाएगा.
  7. पीबीएस के साथ ट्यूब को 50 एमएल तक ऊपर उठाएं। ध्यान से ऊपर से ट्यूबल इकट्ठा और एक नया 50 एमएल ट्यूब में जगह है.
    नोट: बड़े अपाच्य ऊतक टुकड़े जल्दी से तल पर व्यवस्थित होते हैं, जबकि पचाते हुए अर्धनी तरणीय नलिकाएं निलंबन में बनी रहेंगी। कोई बड़ा ऊतक टुकड़े एकत्र किया जाना चाहिए. इस प्रक्रिया को कई बार दोहराया जा सकता है जब तक मूल ट्यूब में समाधान लगभग स्पष्ट है और सिर्फ अपाच्य ऊतक टुकड़े शेष हैं, जो निपटा जा सकता है.
  8. 1.5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 90 x ग्राम पर ट्यूबल को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेट को त्याग दें। ताजा पीबीएस और अपकेंद्रित्र फिर से जोड़ें। इस धोने के कदम को दो बार दोहराएं।
  9. पिछले पीबीएस धोने के बाद, supernatant निकालें और पीबीएस के 5 एमएल में seminiferous ट्यूबल resuspend. फिर ट्यूब्यूल्स में 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडिएमिनटेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) के 15 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब प्लेस और धीरे हर 2 मिनट उलटा. मुक्त चल डीएनए का एक बहुत मनाया जाता है, DMEM के 5 एमएल के साथ DNase मैं के 500 $L जोड़ें.
  10. माइक्रोस्कोप के नीचे एकल कोशिकाओं के लिए ट्यूब्यूल के एंजाइमी पाचन का मूल्यांकन करें (पहले 5 मिनट के बाद, फिर हर 2 मिनट)। यदि ज्यादातर एकल कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है, FBS के 5 एमएल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो और एक 70 डिग्री मीटर जाल के माध्यम से फिल्टर और फिर एक 40 डिग्री मीटर जाल के माध्यम से.
    नोट: देखभाल की जानी चाहिए कि पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले 50 एमएल ट्यूबों पर कैप (समाधान ए, बी और 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA) को ठीक से कस दिया जाता है। यदि पानी के स्नान में संदूषण एक चिंता का विषय है, पैराफिन फिल्म क्षमता सुनिश्चित करने के लिए टोपी के चारों ओर लपेटा जा सकता है।
  11. 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 500 x ग्राम पर एकल कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज, संवर्धन माध्यम में फिर से शुरू (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम F/12 (DMEM/F12) जिसमें 5% FBS और 1% P/S) और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती. यह प्रारंभिक सेल जनसंख्या है। 100 x 103 कोशिकाओं को ठीक करें और रोगाणु सेल मार्कर UCHL1 (यूबिक्विटिन सी-टर्मिनल हाइड्रोलेस एल 1) के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करें जैसा कि12 वर्णित है और इस प्रारंभिक सेल आबादी में रोगाणु कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करता है।
    नोट: जर्म सेल मार्कर Promyelocytic ल्यूकेमिया जस्ता उंगली प्रोटीन (पीएलजेडएफ)15 भी UCHL1 के लिए एक उपयुक्त विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रारंभिक कोशिका जनसंख्या में, अपेक्षित कोशिका उपज ऊतक के लगभग 700-800 x 109/g है। इस कोशिका जनसंख्या में रोगाणु कोशिकाओं का प्रतिशत 4-5% होना चाहिए।
  12. दो अल्ट्रा कम लगाव 100 मिमी पेट्री व्यंजन में इस प्रारंभिक सेल आबादी के लगभग 20 x 106 जगह (10 x 106 कोशिकाओं DMEM/F12 के 10 एमएल में निलंबित कर दिया 1% पी / , 5% सीओ2, 21% ऑक्सीजन). शेष कोशिकाओं के साथ रोगाणु सेल संवर्धन प्रदर्शन.
    नोट: इष्टतम व्यवहार्यता और सेल की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, जबकि रोगाणु सेल संवर्धन और बाद परिमाणीकरण जगह लेता है, शुरू सेल आबादी 2 दिनों के लिए अल्ट्रा कम लगाव ऊतक संस्कृति व्यंजनों में संस्कृति में रखा गया है.

3. जर्म सेल संवर्धन

नोट: ऊपर वर्णित प्रक्रिया मुख्य रूप से Sertoli कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं पैदावार. विभिन्न आसंजन गुण अंतर चढ़ाना के माध्यम से Sertoli कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं की जुदाई के लिए अनुमति देते हैं।

  1. बीज 20-25 x 106 कोशिकाओं को प्रति 100 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान की कुल मात्रा में शुरू सेल जनसंख्या के 8 एमएल संवर्धन माध्यम की कुल मात्रा में (DMEM/F12 5% FBS और 1% P/S के साथ) अंतर चढ़ाना के लिए. कोशिकाओं को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2, 21% व्2) में रखें और 1.5 ज के बाद, यह सुनिश्चित करें कि अधिकांश सेरटोली कोशिकाएं प्लेट से संलग्न हों।
  2. एक नया 100 मिमी प्लेट के लिए 2 प्लेटों के supernatant (मुख्य रूप से युक्त रोगाणु कोशिकाओं) लीजिए और गठबंधन और इसे वापस इनक्यूबेटर में जगह है। 1 ज के बाद, फिर से एक नया 100 मिमी प्लेट के लिए 2 प्लेटों के supernatant गठबंधन. प्लेटों को रात भर के लिए इन्क्यूबेटर में वापस रखें।
    नोट: supernatants संयुक्त मुख्य रूप से रोगाणु कोशिकाओं को शामिल किया जाएगा. प्लेटों के साथ छोड़ दिया जाता है कि पालन कोशिकाओं मुख्य रूप से Sertoli और peritubular मायोइड कोशिकाओं के रूप में वृषण कायिक कोशिकाओं रहे हैं।
  3. समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को निम्नानुसार दो भागों में एकत्र करें।
    नोट: समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को अलग ढंग से पालन, गैर अनुलग्न अंश और थोड़ा पालन भिन्न. ये दोनों भिन्न एक साथ समृद्ध रोगाणु कोशिका जनसंख्या का निर्माण करते हैं।
    1. गैर अनुयायी अंश: supernatant इकट्ठा.
    2. थोड़ा अनुलग्न अंश: पीबीएस के साथ धीरे से प्लेटों को धोएं, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA के 2 एमएल के साथ इलाज करें, 2 एमएल संवर्धन माध्यम के साथ प्रतिक्रिया को रोकदें और गैर-अनुयायी अंश के रूप में एक ही ट्यूब में इकट्ठा करें।
      नोट: 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA PBS के साथ पतला करने के लिए एक 1:20 trypsin समाधान का उत्पादन करने की जरूरत है.
  4. एक सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना, 100 x 103 कोशिकाओं को ठीक करने और रोगाणु सेल मार्कर UCHL1 के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रदर्शन के रूप में वर्णित12 और इस समृद्ध सेल आबादी में रोगाणु कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित.
    नोट: इस कोशिका जनसंख्या में रोगाणु कोशिकाओं का प्रतिशत कम से कम 60-70% होना चाहिए। चूंकि परिमाणीकरण के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को 1 दिन की आवश्यकता होगी, समृद्ध कोशिकाओं को इष्टतम सेल गुणवत्ता और व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए अवधि के लिए 1% पी/एस के साथ पूरक DMEM/F12 के साथ एक अल्ट्रा कम लगाव 100 मिमी पेट्री डिश में रखा जाना चाहिए।

4. बोने के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. शुरू सेल तैयारी फसल के लिए, अल्ट्रा कम लगाव 100 मिमी व्यंजन से एक 50 एमएल ट्यूब में supernatant इकट्ठा. प्लेटों का पालन किया कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पीबीएस के साथ जोरदार धो लें। कोई एंजाइमी पाचन की जरूरत है.
    नोट: वृषण कोशिकाओं में से कुछ, मुख्य रूप से Sertoli कोशिकाओं, थोड़ा अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों का पालन कर सकते हैं.
  2. 25% रोगाणु कोशिकाओं वाले कार्य कोशिका तैयारी को प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सेल तैयारी और समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को संयोजित करें। 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट को त्यागें और ऑर्गनॉइड गठन माध्यम में कोशिकाओं को फिर से चालू करें (डीएमईएम/एफ 12 इंसुलिन के साथ पूरक 10 ग्राम/एमएल, ट्रांसफररिन 5.5 डिग्री ग्राम/एमएल, सेलेनियम 6.7 एनजी/एमएल, 20 एनजी/ , 1% P/ सेल घनत्व को 2.4 x 106 प्रति एमएल में समायोजित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में13 इस्तेमाल माइक्रोवेल प्लेटों में प्रत्येक अच्छी तरह से 1,200 microwells निहित.
  3. नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करने के लिए नीचे वर्णित के रूप में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना.
    प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या - प्रत्येक organoid के लिए संकुल किया जा करने के लिए कोशिकाओं की माइक्रोवेल्स x संख्या.
  4. 1, 000 कोशिकाओं से organoids उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक, बीज प्रत्येक के साथ (1,200 x 1,000 कोशिकाओं प्रत्येक $) 1.2 x 106 कोशिकाओं. सेल निलंबन में सेल घनत्व को इस प्रकार समायोजित करें कि कोशिकाओं को मध्यम के 0ण्5 एमएल की आयतन में वरीयता दी जाती है। प्रत्येक 1,000 कोशिकाओं से बने organoids के लिए, 2.4 x 106 कोशिकाओं प्रति एमएल (1.2 x 106 कोशिकाओं में 0.5 एमएल) का घनत्व का उपयोग करें।

5. कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए माइक्रोवेल्स की तैयारी

नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं microwell सतह का पालन नहीं करते, एक surfactant rinsing समाधान है कि निर्माता द्वारा खरीद के लिए उपलब्ध है के साथ इलाज.

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से rinsing समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें. सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले अच्छी तरह से फंस रहे हैं। हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए, यदि कोई हो, 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 2,000 x ग्राम पर प्लेट को अपकेंद्रण।
  2. यह सत्यापित करने के लिए कि बुलबुले माइक्रोवेल्स से हटा दिए गए हैं, एक निम्न-आवर्धक उल्टे सूक्ष्मदर्शी के नीचे प्लेट का प्रेक्षण कीजिए। यदि फंस बुलबुले मनाया जाता है, तो किसी भी शेष बुलबुले को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 2,000 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ढक्कन और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। उपचार पूरा होने के बाद, धोने के समाधान को हटा दें और तुरंत प्लेट को बाँझ पानी या पीबीएस के साथ धो लें। सुनिश्चित करें कि प्लेट rinsing समाधान के साथ उपचार के बाद बाहर सूखी नहीं है।

6. वृषण organoids की पीढ़ी

  1. किसी भी फंस हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र 2,000 x ग्राम पर organoid गठन माध्यम (किसी भी कोशिकाओं के बिना) के 0.5 एमएल जोड़ें। यह सत्यापित करने के लिए कि वायु के बुलबुले हटा दिए गए हैं, एक निम्न-आवर्धक उल्टे सूक्ष्मदर्शी के नीचे कूप का प्रेक्षण कीजिए। यदि फंस बुलबुले मनाया जाता है, तो किसी भी शेष बुलबुले को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 2,000 x ग्राम पर फिर से अपकेंद्रित्र।
  2. काम सेल निलंबन के 0.5 एमएल जोड़ें और धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण. 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के साथ 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। यह सत्यापित करने के लिए कि कोशिकाओं में माइक्रोवेल्स के भीतर संकुल है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  3. प्लेट को 5 दिनों के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर और संस्कृति में स्थानांतरित करें। हर दूसरे दिन मध्यम का आधा बदलें.
    1. किसी भी organoids खोने के बिना माध्यम को बदलने के लिए, अच्छी तरह से की दीवार के लिए पिपेट टिप को छूने और धीरे से कम करने के लिए मेनिस्कस को छूने और धीरे धीरे माध्यम आकर्षित. यह नीचे चला जाता है के रूप में mencus का पालन करने के लिए सुनिश्चित करें. ताजा माध्यम जोड़ने के लिए, मध्यम वापसी के रूप में एक ही पक्ष पर अच्छी तरह से दीवार के लिए पिपेट टिप स्पर्श करें और अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ धीरे से ताजा माध्यम जोड़ें, यह धीरे-धीरे दीवार के नीचे प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है।
  4. organoids ठीक करने के लिए, धीरे एक विस्तृत मुंह पिपेट का उपयोग कर मध्यम ऊपर और नीचे pippette. यह organoids microwells से बाहर आने के लिए अनुमति देगा.
  5. organoids लीजिए, पीबीएस के साथ धोने, ठीक है और रोगाणु सेल मार्कर (UCH-L1), Sertoli सेल मार्कर (GATA बाइंडिंग प्रोटीन 4-GATA4), peritubular myoid सेल मार्कर (-मूथ स्नायु Actin-जेडSMA) और Leydig सेल मार्कर (Cytochrome) के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रदर्शन P450-CYP450) के रूप मेंवर्णित 12 और एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 सप्ताह पुराने पॉर्सिन टेस्ट से अलग कोशिकाओं कि microwells में सुसंस्कृत थे स्व-संगठित गोलोइड में (चित्र 1ए, चित्र 2), delineated और अलग बाहरी (semineous उपकला) और आंतरिक डिब्बों के साथ ( अंतरास्थाय) (चित्र 1ठ, चित्र 2) । दो डिब्बों एक कोलेजन चतुर्थ+ वे तहखाने झिल्ली द्वारा अलग किया गया. UCH-L1+ve रोगाणु कोशिकाओं और GATA4+ve Sertoli कोशिकाओं तहखाने झिल्ली पर बाहरी डिब्बे में थे (चित्र 1बी, चित्र 2). -SMA+ve peritubular myoid कोशिकाओं तहखाने झिल्ली के अंदर के साथ स्थानीयकृत किया गया, जबकि Cytochrome P450+ve Leydig कोशिकाओं interstitium के केंद्र में थे (चित्र 1बी, चित्र 2). यह संरचना (चित्र 2) स्थिति स्थितियों के समान है (चित्र 1ब्), जहां लेयडिग कोशिकाएं, परितुब्युलर मायॉइड कोशिकाएं मध्यवर्ती डिब्बे में इंटरस्टिशियम में स्थित होती हैं; और रोगाणु कोशिकाओं, Sertoli कोशिकाओं अर्द्धनीफेरस उपकला पर स्थित हैं.

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोवेल व्युत्पन्न वृषण organoids एक उल्टे स्थलाकृति के साथ वृषण-विशिष्ट ऊतक वास्तुकला प्रदर्शन. (ए) 0, 3, और माइक्रोवेल संस्कृति के 5 दिनों में पोरसिन वृषण कोशिकाओं। (बी) विशिष्ट कोशिका प्रकारों की पहचान करने वाले वृषण organoids के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों: Sertoli कोशिकाओं (GATA4), तहखाने झिल्ली (कोलेजन चतुर्थ); रोगाणु कोशिकाओं (UCH-L1); पेरियूबुलर मायॉइड कोशिकाओं (जेड-SMA); Leydig कोशिकाओं (CYP450). (ग)हिस्टोलॉजिकल उपस्थिति (एच एंड ई) और 1 सप्ताह पुराने सुअर वृषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. विशिष्ट कक्ष प्रकार संगत तीरों के साथ इंगित किए जाते हैं. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह आंकड़ा साकिब एट अल12से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: organoid गठन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. पृथक एकल वृषण कोशिकाओं बीज और वृषण organoids का उत्पादन करने के लिए 5 दिनों के लिए microwells में सुसंस्कृत कर रहे हैं. यह आंकड़ा साकिब एट अल12से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम एक सरल विधि है कि ऊतक वास्तुकला है कि vivo12में वृषण के समान है के साथ वृषण organoids की बड़ी संख्या के अनुरूप, repeatable पीढ़ी की अनुमति देता है की स्थापना की है. जबकि दृष्टिकोण porcin वृषण कोशिकाओं का उपयोग कर विकसित किया गया था, यह अधिक मोटे तौर पर माउस, गैर मानव प्राइमेट और मानव वृषण12के लिए भी लागू है. वृषण organoids8,9,10,11के उत्पादन के लिए विभिन्न तरीकों की सूचना दी गई है . Baert एट अल. वयस्क मानव testes11के decellularization द्वारा प्राप्त अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ECM) के साथ वृषण कोशिकाओं culturing द्वारा वयस्क और पूर्व pubertal नमूने से मानव वृषण organoids उत्पन्न . हालांकि इस मॉडल अलग वृषण आकृति विज्ञान नहीं था, organoids टेस्टोस्टेरोन और साइटोकिन्स स्रावित कर सकता है11. एक अन्य मानव organoid मॉडल Pendergraft एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था एक फांसी ड्रॉप संस्कृति विधि है कि solubilized वृषण ECM प्रोटीन और organoids का उपयोग का उपयोग कर टेस्टोस्टेरोन8का उत्पादन कर सकता है का उपयोग कर. Alves-Lopes et al. एक अद्वितीय तीन परत तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) ढाल प्रणाली का इस्तेमाल किया चूहों से वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए10. इस प्रणाली में कोशिकाओं ट्यूबलर संरचनाओं कि एक रक्त testes बाधा था उत्पन्न. इन नलिका की तरह संरचनाओं में रोगाणु कोशिकाओं को भी रेटिनोइक एसिड उत्तेजना10के लिए उत्तरदायी थे. इन सभी तरीकों को कुछ जटिल और चुनौतीपूर्ण उच्च थ्रूपुट assays के लिए उपयोग कर रहे हैं. इसके विपरीत, microwell प्रणाली सरल है, reproduible, organotypic वृषण organoids उत्पन्न कर सकते हैं और उच्च थ्रूपुट दवा और विषाक्तता परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यद्यपि यहाँ उल्लिखित विधि में हमने सेल घनत्व 1,000 कोशिकाओं/माइक्रोवेल (1,000 कोशिकाओं/organoid) का उपयोग किया है, इस विधि का उपयोग 125 कोशिकाओं/माइक्रोवेल12के साथ organoids उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। सीमित नमूनों के साथ प्रयोग करते समय यह विशेष उपयोग का हो सकता है।

यदि थाली सही ढंग से centrifugation के दौरान संतुलित नहीं है, कोशिकाओं के असमान वितरण चर आकार और आकार के साथ organoids के उत्पादन का कारण बन सकता है. माइक्रोवेल प्लेट को ठीक से संतुलित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। एक बार कोशिकाओं को बीज दिया गया है, ध्यान मीडिया में परिवर्तन के दौरान थाली से निपटने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. प्लेट को इन्क्यूबेटर से बाहर निकालते समय या मीडिया में परिवर्तन के दौरान अशांति पैदा करने से प्लेट को बहुत अधिक हिलाने से कुछ अंग माइक्रोवेल्स से बाहर आ सकते हैं और अन्य13के साथ फ्यूज हो सकते हैं .

स्तनधारी रोगाणु कोशिका आला जटिल और बहुकोशिकीय है। वृषण में विभिन्न कोशिकाओं जैसे सेर्टोली कोशिकाओं, पेरिटूबुलर मायॉइड कोशिकाओं, लेइडिग कोशिकाओं सभी रोगाणु कोशिका ओंकार के रखरखाव और भाग्य16,17में योगदान देते हैं । हमारे organoid प्रणाली विशिष्ट सेल प्रकार में विभिन्न संकेतन रास्ते में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्याज का एक जीन ऊपर या रोगाणु कोशिकाओं या अन्य वृषण कायिक कोशिकाओं जैसे peritubular मायऑइड कोशिकाओं, Sertoli कोशिकाओं में downregulated किया जा सकता है. इन संशोधित कोशिकाओं तो संशोधित वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए अन्य वृषण कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा सकता है, जो तब ECM जमाव पर संपादन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, morphogenesis, सेल सेल संकेतन, और शुक्राणुजनन. इस तरह के संशोधनों को भी दवा स्क्रीनिंग के लिए विशिष्ट रोग phenotypes उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है. ऐसे फांसी बूँदें या अल्ट्रा कम लगाव यू-नीचे प्लेटें8में संस्कृति के रूप में गोलाभ organoids की पीढ़ी के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, microwell प्रणाली का उपयोग कर एक वृषण organoid मॉडल है कि अधिक सुलभ है और के लिए अनुमति देता है के लिए अनुमति दी गई है संशोधन. उदाहरण के लिए, रोगाणु कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित या प्रयोगात्मक कारकों के साथ इलाज किया जा सकता है और सरल अपकेंद्रण द्वारा एक पूर्वनिर्मित जंगली प्रकार organoid पर रखा और बहाव प्रभाव के लिए मनाया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

डॉ Ungrin एक आविष्कारक के रूप में AggreWell प्रौद्योगिकी में एक वित्तीय रुचि है.

Acknowledgments

इस कार्य को NIH/NICHD HD091068-01 द्वारा डॉ इना डोब्रिन्स्की को समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक 152 टेस्टेस organoid microwell रोगाणु कोशिकाओं Sertoli कोशिकाओं organotypic
माइक्रोवेल संस्कृति का उपयोग करके टेस्टिस विशिष्ट वास्तुकला के साथ पोरसिन वृषण ऑर्गनॉइड्स का उत्पादन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A.,… More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter