Summary
ここでは、市販のマイクロウェル培養システムを用いた精巣特異的組織アーキテクチャを用いたブタ精巣オルガノイドの再現可能な生成のためのプロトコルを提示する。
Abstract
オルガノイドは、組織の構造と生体内の器官の機能を要約することができる複数の細胞タイプで構成される3次元構造です。オルガノイドの形成は、基礎研究と翻訳研究の異なる道を開きました。近年、精巣オルガノイドは男性の生殖生物学の分野に関心を集めています。精巣オルガノイドは、細胞間相互作用、組織発達、および生殖細胞ニッチ微小環境の研究を可能にし、高スループット薬と毒性スクリーニングを容易にする。精巣特異的組織アーキテクチャを用いて精巣オルガノイドを確実かつ再現可能に生成する方法が必要である。マイクロウェル培養システムには、ピラミッド型マイクロウェルの密集した配列が含まれています。思春期前精巣に由来する精巣細胞は、これらのマイクロウェルに遠心分離され、精巣特異的組織構造および細胞関連を有する精巣オルガノイドを生成するために培養される。このプロセスを介して何千もの均質なオルガノイドを生成することができます。ここで報告されたプロトコルは、男性の生殖を研究する研究者に広く関心を持つことになります。
Introduction
近年、3次元(3D)オルガノイドへの関心が復活している。腸1、胃2、膵臓3、4、肝臓5、脳6などの異なる臓器は、3Dオルガノイド系に正常に誘導されている。これらのオルガノイドは、生体内の器官と建築的および機能的類似性を持ち、単層培養システム7よりも組織微小環境の研究に生物学的に関連している。その結果、精巣オルガノイドも同様に関心を集め始めている、8,9,10,11,12.これまでに報告された方法の大半は、複雑で非高スループット10であり、ECMタンパク質8、10の添加を必要とする。この複雑さはまた、再現性の問題につながります。精巣の精巣のような細胞関連を持つ精巣オルガノイドの生成を可能にする簡単で再現可能な方法が必要です。
我々は最近、これらの要件12に対処するシステムを報告しました.豚をモデルに、マイクロウェルシステムに遠心強制集約アプローチを採用しました。マイクロウェルシステムでは、各ウェルには多数の同一の小さなマイクロウェル13が含まれています。これは均一なサイズの多数の球形の生成を可能にする。マイクロウェルシステムは精巣特異的な建築が付いている多数の均一なオルガノイドの発生を可能にした。システムは簡単であり、ECMタンパク質の添加を必要としない。
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Protocol
注:1週齢の子豚の精巣は、市販の豚の去勢から副産物として商業豚農場から得られた。精巣の調達は、カルガリー大学の動物ケア委員会によって承認されました。
1. 組織消化のための酵素溶液の調製
注:2つの異なるコラゲナーゼIV溶液(溶液A、B)およびデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)溶液を含む3つの異なる酵素溶液が必要です。
- 溶液Aを調剤するために、高グルコースダルベッコの修飾イーグルミディアム(DMEM)の25mLにコラゲナーゼIVS(材料表)と40mgのコラゲナーゼIV W(材料表)を20mg溶解する。その後、0.22 μmフィルターで殺菌をフィルタリングします。トリプシン活性を阻害する溶液Aに胎児ウシ血清(FBS)の0.4 mLを追加します。
- 溶液Bを調剤するには、DMEMの40mLにコラゲナーゼIVW(材料表)の80mgを溶解する。その後、0.22 μmフィルターで殺菌をフィルタリングします。
- DNase I溶液(7mg/mL)を調剤し、DMEMの10mLでDNase Iの70mgを溶解する。その後、0.22 μmフィルターで殺菌をフィルタリングします。
注:ここで概説するコラゲナーゼIV溶液に対する酵素濃度は、元の物品14に記載されている濃度(2mg/mL)から異なる。現在のプロトコルは、わずかに高い生存率を持つセルを生成します。しかし、両方のプロトコルによって単離された細胞は、同一の組織アーキテクチャを持つオルガノイドを産生する。
2. 精巣組織酵素消化
- 精巣を滅菌ビーカーに集め、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含むリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で洗浄する。洗浄後、1%P/Sを含むPBSを含む100mm組織培養皿に精巣を移し、オートクレーブドハサミと鉗子を使用してチュニカ膣および精巣を除去する。単離した精巣を新しい100mm皿に移し、1%P/Sを含むPBSで十分に洗浄します。
- 不妊を維持するには、チュニカアルブギンアから精巣のパレンキマを剥離するために、滅菌はさみと鉗子の別のセットを使用してください。ツニカのすぐ下の縦軸に沿って精巣を切ります。その後、2つの鉗子を使用してチュニカから精巣を剥がし、1%P/Sで1 mL DMEMを含む新しい100ミリメートル皿に置きます。
- 皮をむいた精巣を滅菌はさみで1-2mmのティッシュ片にミンチします。チョッピング後、無菌鉗子を使用して結合組織の白い断片を除去する。
- みじん切りの組織片を溶液Aに移し、DMEMで50mLまで上にして、コラゲナーゼIV S(材料表)に対して0.4mg/mLの濃度とコラゲナーゼIV W(材料表)の濃度0.8mg/mLを得る。組織片を含む溶液Aを30分間30分間水浴に入れ、5分ごとにチューブを穏やかに反転させ、DNAの放出を目視で確認する。
- 自由浮遊DNAが観察された場合、DNase Iの500 μLを追加します。30分後、チューブを90xgで遠心分離し、ブレーキを25°Cで1.5分間1.5分間使用し、上清を廃棄します。
注:DNAは曇り物質として現れます。チューブを振ると、組織片は落ち着き、DNAは浮遊したままになります。
- 自由浮遊DNAが観察された場合、DNase Iの500 μLを追加します。30分後、チューブを90xgで遠心分離し、ブレーキを25°Cで1.5分間1.5分間使用し、上清を廃棄します。
- 溶液Bをチューブに加え、DMEMで最大50mLの上に付加し、コラゲナーゼIV W(材料表)の濃度1.2mg/mLを得た。チューブを30分間37°Cの水浴に入れ、5分ごとにチューブを穏やかに反転させます。
- 30分後、チューブを90 x gで遠心分離し、ブレーキを25°Cで1.5分間行います。その後、上清を捨て、1%P/SでPBSで一度洗います。
注:溶液AとBの両方から廃棄された上清は、主に間質細胞を含む。 - 50 mLまでのPBSで管を上に上げる。慎重に上部からチューブを収集し、新しい50 mLチューブに配置します。
注:大きな未消化組織断片はすぐに底部に沈み、消化された半卵管は懸濁液中に残ります。大きな組織断片を収集する必要はありません。この手順は、元のチューブ内の溶液がほぼ明確になり、消化されていない組織断片が残るまで数回繰り返すことができます。 - 25°Cのブレーキで90 x gの管を遠心分離し、上清を捨てます。新鮮なPBSと遠心分離機を再び追加します。この洗浄手順を 2 回繰り返します。
- 最後のPBS洗浄後、上清を取り出し、PBSの5 mLで半精管を再中断する。次いで、0.25%トリプシン-エチレン科ミネテトラセチン酸(EDTA)の15mLを管状に添加する。チューブを37°Cの水風呂に入れ、2分ごとに穏やかに反転させます。多くの自由浮遊DNAが観察された場合は、DMEMの5 mLでDNase Iの500 μLを追加します。
- 顕微鏡下の単一細胞に対する管の酵素消化を評価する(最初に5分後、次いで2分ごとに)。大部分が単一の細胞を検出できる場合は、5 mLのFBSで反応を停止し、70 μmメッシュを通して濾過し、40 μmメッシュを介してフィルタリングします。
注:消化に使用される50mLチューブ(溶液A、B、0.25%トリプシン-EDTA)のキャップが適切に締め付けられていることに注意してください。水浴中の汚染が懸念される場合は、パラフィンフィルムをキャップの周りに巻いて無菌性を確保してもよい。 - 55°Cでブレーキを持つ500 x gで単一の細胞を遠心分離し、5%FBSおよび1%P/Sを含む濃縮培地(DMEM/F12)で再中断し、生存細胞の数をカウントする。これが開始セルの母集団です。100 x 103細胞を固定し、12に記載の生殖細胞マーカーUCHL1(ユビキチンC末端ヒドロラーゼL1)に対して免疫細胞化学を行い、この開始細胞集団における生殖細胞の割合を決定する。
注:生殖細胞マーカープロミエロチック白血病亜鉛フィンガータンパク質(PLZF)15は、UCHL1に対する適切な代替手段としても用いることができる。開始細胞集団において、期待される細胞収率は、組織の約700〜800 x 109/gである。この細胞集団における生殖細胞の割合は4〜5%でなければならない。 - この開始細胞集団の約20 x 106を2つの超低アタッチメント100mmペトリ皿(各皿に1%P/Sを含むDMEM/F12の10 mLに懸濁した10 x 106細胞)を組織培養インキュベーター(37°C)で2日間置く、5% CO2、 21% 酸素)。残りの細胞で生殖細胞濃縮を行う。
注:最適な生存率と細胞品質を確保するために、生殖細胞濃縮とその後の定量化が行われる間、開始細胞集団は2日間の超低アタッチメント組織培養皿で培養中に置かれる。
3. 胚芽細胞濃縮
注:上記の手順は、主にセルトリ細胞および生殖細胞を生み出す。異なる接着特性は、差動めっきを介してセルトリ細胞と生殖細胞の分離を可能にします。
- 種子20-25 x 106細胞の開始細胞集団を100mm組織培養皿当たり、差動めっきのための濃縮培地(DMEM/F12、5%FBSおよび1%P/S)の総容積8mLで提供する。細胞をインキュベーター(37°C、5%CO2、21%O2)に入れ、1.5時間後に、セルトリ細胞の大部分がプレートに付着することを確認します。
- 2枚のプレート(主に生殖細胞を含む)を1枚の新しい100mmプレートに集め、インキュベーターに戻します。1時間後、再び新しい100ミリメートルプレートに2プレートの上清を組み合わせます。プレートをインキュベーターに一晩戻します。
注:組み合わされた上清は、主に生殖細胞を含む。プレートと一緒に廃棄される付着細胞は、主にセルトリおよび眼膜筋細胞などの精巣体細胞である。 - 濃縮された生殖細胞を次のように2分の1で回収する。
注:濃縮生殖細胞は、異なる、非付着画画分およびわずかに付着した分画に付着する。これらの分画は共に濃縮された生殖細胞集団を形成する- 非付着分画:上清を収集します。
- わずかに付着した分画:PBSでプレートを穏やかに洗浄し、室温で5分間0.25%トリプシン-EDTAの2mLで2mLで処理し、2mLの濃縮培地で反応を停止し、非付着画画分と同じチューブに集めます。
注:0.25% トリプシン-EDTAは、1:20トリプシン溶液を生成するためにPBSで希釈する必要があります。
- 細胞カウンターを用いて細胞の総数を数え、100 x 103細胞を固定し、12に記載の生殖細胞マーカーUCHL1に対して免疫細胞化学を行い、この濃縮細胞集団における生殖細胞の割合を決定する。
注:この細胞集団における生殖細胞の割合は、少なくとも60〜70%でなければなりません。定量化のための免疫細胞化学は1日を必要とするので、濃縮された細胞は、最適な細胞品質と生存率を確保するために、DMEM/F12を1%P/Sで補充した超低アタッチメント100mmペトリ皿に入れるべきです。
4. 播種用細胞の調製
- 開始細胞製剤を収穫するには、超低付属品100mm皿から50mLチューブに上清を集めます。PBSでプレートを激しく洗い、付着した細胞を回収します。酵素消化は必要ありません。
注:精巣細胞の一部は、主にセルトリ細胞が、超低アタッチメントプレートにわずかに付着しうる。 - 開始細胞製剤と濃縮生殖細胞を組み合わせて、25%の生殖細胞を含む働く細胞製剤を得る。500 x gでブレーキを 25 °C で 5 分間ブレーキをかけて、上清を捨ててオルガノイド形成培地(DMEM/F12 はインスリン 10 μg/mL、トランスフェリン 5.5 μg/mL、セレン 6.7 ng/mL、20 ng/mL の成長因子を補充)、1% P/S)。セル密度を mL あたり 2.4 x 106に調整します。
注:このプロトコルで13を使用したマイクロウェルプレートの各ウェルには、1,200個のマイクロウェルが含まれていました。 - 以下の式を使用して、以下に説明するセルあたりのセル数を計算します。
ウェル当たりの細胞数=各オルガノイドに対してクラスター化するマイクロウェルx個数。 - それぞれ1,000個からオルガノイドを生成し、それぞれ(1,200 x 1,000細胞各=)1.2 x 106細胞を種目する。細胞懸濁液中の細胞密度を、細胞が0.5 mLの培地で播種する方法で調整する。それぞれ1,000個から形成されたオルガノイドの場合、mL当たり2.4 x 106細胞の密度(0.5 mLで1.2 x 106細胞)を使用します。
5. 細胞を受け取るマイクロウェルの調製
注:細胞がマイクロウェル表面に付着しないようにするには、メーカーが購入できる界面活性剤すすで処理してください。
- 各井戸に0.5 mLのすすり液を加えます。気泡が井戸に閉じ込められていないことを確認します。気泡を除去するには、もしあれば、25°Cで25°Cで2,000 x gでプレートを遠心分離します。
- 低倍率反転顕微鏡でプレートを観察し、気泡がマイクロウェルから除去されたことを確認します。閉じ込められた気泡が観察された場合は、残りの気泡を除去するために2分間25°Cでブレーキで2,000 x gで再び遠心分離機を取り除きます。
- 蓋でプレートを覆い、室温で30分間インキュベートします。処理が完了したら、すすり液を取り除き、すぐに滅菌水またはPBSでプレートを洗浄します。すす液で処理した後、プレートが乾燥していないことを確認します。
6. 精巣オルガノイドの生成
- 各ウェルに0.5 mLのオルガノイド形成培地(細胞なし)を加え、25°Cでブレーキをかけて2,000 x gの遠心分離機を2分間加え、閉じ込められた気泡を取り除きます。低倍率反転顕微鏡で井戸を観察し、気泡が除去されたことを確認します。閉じ込められた気泡が観察された場合は、残りの気泡を除去するために2分間25°Cでブレーキで2,000 x gで再び遠心分離機を取り除きます。
- 作業セルサスペンションの0.5 mLを追加し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。55°Cで500 x gの遠心分離機を25°Cで5分間、反転顕微鏡を使用して、細胞がマイクロウェル内に集まっていることを確認します。
- プレートを細胞培養インキュベーターに移し、5日間培養する。1日おきにメディアの半分を変更します。
- オルガノイドを失うことなく媒体を変更するには、ピペットの先端を井戸の壁に触れ、穏やかに下げてメニスカスに触れ、ゆっくりと媒体を描きます。メニスカスが落ちるように従ってください。新鮮な媒体を追加するには、媒体の撤退と同じ側の井戸の壁にピペットの先端をタッチし、それがゆっくりと壁を流れることができるように、ウェルの壁に対して穏やかに新鮮な媒体を追加します。
- オルガノイドを回復するには、広い口のピペットを使用して、メディアを上下に優しくピペットします。これにより、オルガノイドがマイクロウェルから出てくる可能性があります。
- オルガノイドを収集し、PBSで洗浄し、生殖細胞マーカー(UCH-L1)、セルトリ細胞マーカー(GATA結合タンパク質4-GATA4)、眼球筋細胞マーカー(α-平滑筋アクチン-αSMA)およびライディッヒ細胞マーカー(サイトクロム)の免疫細胞化学を修正して実行します。P450-CYP450)記載の12と共焦点顕微鏡下で可視化する。
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Representative Results
マイクロウェルで培養した1週間齢のブタ精巣から単離された細胞をスフェロイド(図1A、図2)に分かれて、線引きされ、異なる外装(半精巣上皮)と内部コンパートメント(((図1B、図2)。2つのコンパートメントは、コラーゲンIV+ve地下膜によって分離された。UCH-L1+ve生殖細胞およびGATA4+veセルトリ細胞は、基基膜上の外部コンパートメント内にあった(図1B、図2)。α-SMA+ve周辺筋細胞は基板膜の内部に沿って局在し、シトクロムP450+veライディッヒ細胞は間質の中心にあった(図1B、図2)。この構造(図2)は、ライディグ細胞、眼膜筋細胞が間質室の間質に位置する場所(図1C)に類似している。生殖細胞と、セルトリ細胞は半生性上皮に位置する。
図1:マイクロウェル由来精巣オルガノイドは、反転地形を用いた精巣特異的組織構造を示す。(A)0、3、および5日間のマイクロウェル培養におけるブタ精巣細胞。(B)特定の細胞型を同定する精巣オルガノイドの免疫蛍光画像:セルトリ細胞(GATA4)、系下膜(コラーゲンIV);生殖細胞 (UCH-L1);管内筋細胞 (α-SMA);ライディグ細胞(CYP450)。(C)組織学的外観(H&E)と1週齢の豚精巣の概略図。特定のセルタイプは、対応する矢印で示されます。スケールバー = 50 μm.この図は、Sakibら12.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オルガノイド形成の概略表図。単一精巣細胞を播種し、精巣オルガノイドを生成するために5日間マイクロウェルで培養する。この図は、Sakibら12.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、生体内12の精巣に類似した組織アーキテクチャを持つ多数の精巣オルガノイドの一貫した、反復可能な生成を可能にする簡単な方法を確立した。このアプローチはブタ精巣細胞を用いて開発されたが、マウス、非ヒト霊長類およびヒト精巣12にもより広く適用可能である。精巣オルガノイド8、9、10、11を産生するための多くの異なる方法が報告されている。Baertらは、成人ヒト精巣の脱細胞化により得られた余分な細胞マトリックス(ECM)を用いて精巣細胞を培養することにより、成人および思春期前試料からヒト精巣オルガノイドを生成した11。このモデルは明確な精巣形態を持っていなかったが, オルガノイドは、テストステロンとサイトカイン11を分泌することができます。.別のヒトオルガノイドモデルは、可溶化精巣ECMタンパク質およびオルガノイドを利用したぶら下がり降下培養法を用いてペンダーグラフトらによって報告された8.Alves-Lopesらは、ラット10から精巣オルガノイドを生成するために、ユニークな3層地下膜マトリックス(例えば、マトリゲル)勾配系を使用した。このシステムの細胞は、血液精巣の障壁を持つ管状構造を生成しました.これらの管状構造の生殖細胞もレチノイン酸刺激10に応答した。これらの方法はすべてやや複雑で、高スループットアッセイに使用するのが難しい。対照的に、マイクロウェルシステムは、シンプルで再現性があり、組織性精巣オルガノイドを生成することができ、高スループット薬および毒性アッセイに使用することができる。
ここで概説する方法では、細胞密度1,000細胞/マイクロウェル(1,000細胞/オルガノイド)を使用していますが、この方法は、わずか125細胞/マイクロウェル12を持つオルガノイドを生成するために使用することができます。これは、限られたサンプルを試す場合に特に使用できます。
遠心分離中にプレートのバランスが正しく行われなかった場合、細胞の偏った分布は、サイズと形状が変動するオルガノイドの生成を引き起こす可能性があります。マイクロウェルプレートのバランスを適切に行うには注意が必要です。細胞が播種されたら、メディアの変更中にプレートを取り扱う際に注意を払う必要があります。インキュベーターから取り出すときやメディアの変化中に乱気流を作り出すときにプレートを振り過ぎると、オルガノイドの一部がマイクロウェルから出てきて他の人と融合する可能性があります13。
哺乳類生殖細胞ニッチは複雑で多細胞である。セルトリ細胞、眼膜下耳筋細胞、ライディグ細胞などの精巣中の異なる細胞は、すべて生殖細胞の維持および運命16、17に寄与する。私たちのオルガノイドシステムは、特定の細胞型の異なるシグナル伝達経路を操作するために使用することができます。目的の遺伝子は、生殖細胞または細胞内筋細胞、セルトリ細胞などの他の精巣体細胞で上下に調節することができる。これらの修飾された細胞は、他の精巣細胞と組み合わせて修飾精巣オルガノイドを生成することができ、ECM沈着、形態形成、細胞シグナル伝達、および精子形成に対する編集の効果を研究するために使用することができます。このような修飾は、薬物スクリーニングのための特定の疾患の型を生成するために行うこともできます。吊り下げ滴や超低アタッチメントUボトムプレート8の培養物などの球状オルガノイドの生成のための他の方法と比較して、マイクロウェルシステムを使用すると、よりアクセスしやすく、よりアクセス可能な精巣オルガノイドモデルを可能にし、変更。例えば、生殖細胞は、遺伝的に修飾または実験因子で処理され、単純な遠心分離によってあらかじめ作られた野生型オルガノイド上に置かれ、下流の効果のために観察されてもよい。
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Disclosures
アングリン博士は発明家としてAggreWell技術に金銭的な関心を持っています。
Acknowledgments
この作品は、NIH/NICHD HD091068-01が稲田ドブリンスキー博士に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
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