Bioengineering

जैविक अनुप्रयोगों के लिए नियर-इन्फ्रारेड उत्सर्जक गोल्ड नैनोक्लस्टर्स का संश्लेषण

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388

Goutam Pramanik¹, Alena Keprova¹, Jan Valenta², Vaclav Bocan³, Klaudia Kvaková^1,4, Lenka Libusova³, Petr Cigler¹

¹Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, ²Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, ³Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, ⁴First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

कार्यात्मक, निकट-अवरक्त उत्सर्जक फोटोल्यूमिनेसेंट गोल्ड नैनोक्लस्टर ्स और फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा वाला कोशिकाओं के अंदर उनका प्रत्यक्ष पता लगाने की तैयारी के लिए एक विश्वसनीय और आसानी से प्रजनन योग्य विधि वर्णित है।

Abstract

पिछले एक दशक में, फ्लोरोसेंट गोल्ड नैनोक्लस्टर्स (AuNCs) ने जैविक अनुप्रयोगों में बढ़ती लोकप्रियता देखी है और उनके विकास के लिए भारी प्रयास समर्पित किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में, पानी में घुलनशील, जैव संगत, और कोलॉयडरूप से स्थिर निकट अवरक्त उत्सर्जक AuNCs की तैयारी के लिए हाल ही में विकसित, फेसियल विधि का विस्तार से वर्णन किया गया है। यह कमरे का तापमान, बॉटम-अप रासायनिक संश्लेषण आसानी से कार्यात्मक एएनसी प्रदान करता है जो जलीय समाधान में थियोटिक एसिड और थिओल-संशोधित पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ छाया हुआ है। सिंथेटिक दृष्टिकोण न तो कार्बनिक सॉल्वैंट्स या अतिरिक्त लिगामेंट एक्सचेंज की आवश्यकता है और न ही प्रजनन के लिए सिंथेटिक रसायन विज्ञान के व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है। परिणामस्वरूप AuNCs मुफ्त सतह कार्बोक्लिक एसिड प्रदान करता है, जिसे एएनसी के फोटोल्यूमिनेसेंट गुणों को प्रतिकूल रूप से प्रभावित किए बिना एक मुक्त अमीन समूह वाले विभिन्न जैविक अणुओं के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। वाला कोशिकाओं द्वारा प्रवाह साइटोमेट्रिक क्वांटिफिकेशन और एएनसी तेज की कॉन्फोकल सूक्ष्म इमेजिंग के लिए एक त्वरित, विश्वसनीय प्रक्रिया भी वर्णित की गई है। बड़े स्टोक्स बदलाव के कारण, ऑएनसी के निकट-अवरक्त फोटोल्यूमिनेस का कुशल पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में फिल्टर की उचित सेटिंग आवश्यक है।

Introduction

पिछले एक दशक में, अल्ट्रास्मॉल (2 एनएम) फोटोल्यूमिनेसेंट गोल्ड नैनोक्लस्टर्स (पीएल एएनसी) मौलिक अनुसंधान और व्यावहारिक^,अनुप्रयोगों^,^1,^,^,^2,^,^3,^4,^5,^6,^,⁷^7,^8,^,^9,^,¹⁰दोनों के लिए आशाजनक जांच के रूप में उभरा है। उनकी कई वांछनीय विशेषताओं में उच्च फोटोस्थिरता, tunable उत्सर्जन मैक्सिमा, लंबे उत्सर्जन जीवन काल, बड़े स्टोक्स बदलाव, कम विषाक्तता, अच्छी जैव अनुकूलता, गुर्दे की निकासी और फेसियल बायोकॉन्जुजेशन शामिल हैं। पीएल एएनसी क्लस्टर¹¹ के भीतर परमाणुओं की संख्या और सतह लिगांड¹²की प्रकृति के आधार पर नीले से निकट अवरक्त (एनआईआर) स्पेक्ट्रल क्षेत्र तक फोटोल्यूमिनेसेंस प्रदान कर सकता है। एनआईआर (650-900 एनएम) उत्सर्जन करने वाले एएनसी विशेष रूप से विट्रो में और कोशिकाओं और ऊतकों की वीवो इमेजिंग में दीर्घकालिक के लिए आशाजनक हैं, क्योंकि वे आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस, कमजोर बिखरने और अवशोषण, और एनआईआर प्रकाश^13,^,¹⁴के उच्च ऊतक प्रवेश के साथ न्यूनतम ओवरलैप के कारण उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करते हैं।

हाल के वर्षों में, एनआईआर-पीएल ऑएनसी को तैयार करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जिनमें विभिन्न प्रकार के थिओल युक्त^{लिगांड13,}^,^15,^,^16,^,¹⁷शामिल हैं। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए, AuNCs बाध्यकारी बातचीत की सुविधा के लिए एक जैविक घटक के साथ कार्यात्मक किया जाना चाहिए । इस प्रकार, उच्च कोलाइडल स्थिरता के साथ एएनसी जो जलीय सॉल्वेंट में आसानी से कार्यात्मक हैं, अत्यधिक वांछनीय हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य सतह पर एक कार्यात्मक कार्बोक्कुलिक एसिड समूह के साथ एएनसी की पहले से रिपोर्ट की गई¹⁸ तैयारी का वर्णन करना है, जो विस्तार से एक जलीय वातावरण में थ्ियोटिक एसिड और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) को नियोजित करके और एसिड-अमीन युग्मन विधि के बाद एक प्राथमिक बारूदी सुरंग वाले अणुओं के साथ उनका संयोजन है। संश्लेषण और उच्च प्रजनन क्षमता की आसानी के कारण, इस प्रोटोकॉल का उपयोग गैर-रसायन विज्ञान पृष्ठभूमि के शोधकर्ताओं द्वारा किया और अनुकूलित किया जा सकता है।

जैव चिकित्सा अनुसंधान में AuNCs के अनुप्रयोगों के लिए प्रमुख आवश्यकताओं में से एक कोशिकाओं के अंदर AuNCs का निरीक्षण और उपाय करने की क्षमता है । कोशिकाओं द्वारा नैनोपार्टिकल तेज की निगरानी के लिए उपलब्ध तरीकों में, फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम) और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) मजबूत, उच्च थ्रूपुट विधियों की पेशकश करते हैं जो बड़ी संख्या में कोशिकाओं¹⁹में फ्लोरोसेंट नैनोमैटेरियल्स के आंतरिककरण के तेजी से मापकी अनुमति देते हैं। यहां, अतिरिक्त रंगों की आवश्यकता के बिना कोशिकाओं के अंदर पीएल एएनसी के प्रत्यक्ष मापन और विश्लेषण के लिए एफसीएम और सीएलएसएम विधि भी प्रस्तुत की गई है।

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Protocol

1. निकट अवरक्त उत्सर्जन AuNCs की तैयारी (1)

7.8 मिलीग्राम (37.8 μmol) थिओटिक एसिड (टीए) और 2 एम NaOH के 60 μL अल्ट्राप्योर पानी के 23.4 मिलीग्राम (प्रतिरोधकता 18.2 Mω.cm 25 डिग्री सेल्सियस पर) जोड़ें और हलचल (कम से कम 1,000 आरपीएम) जब तक यह पूरी तरह से घुल (~ 15-20 min) । टीए के तेजी से विघटन के लिए, मिश्रण को सोनीकेट करें। संश्लेषण के लिए, हौसले से तैयार टीए समाधान की सिफारिश की जाती है।
समाधान के जलीय समाधान के एचएयूसीएल₄·3एच₂ओ (470 मिलीग्राम/एमएल) के 10.2 माइक्रोन जोड़ें।
15 मिन के बाद, जोरदार सरगर्मी (कम से कम 1,000 आरपीएम) के तहत NaBH₄ (1.9 मिलीग्राम/mL) के 480 μL जोड़ें और रात भर एक ही शर्तों के तहत प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल।
नोट: हौसले से बर्फ ठंडे अल्ट्राप्यूरी पानी में NaBH₄ समाधान तैयार करें और तैयारी के तुरंत बाद प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें।
नोट: AuNCs का संश्लेषण आसानी से स्केलेबल है। कणों के ऑप्टिकल गुणों में किसी भी परिवर्तन के बिना, एक ही बैच में एएनसी के 2 एल को संश्लेषित किया गया था।
(क्रिटिकल) अगले दिन, 3 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ के साथ झिल्ली निस्पंदन उपकरण का उपयोग करके अपन्तिफेशन/निस्पंदन के तीन चक्रों को लागू करके समाधान को शुद्ध करें । इस शुद्धिकरण प्रक्रिया के बिना, निम्नलिखित चरण ठीक से काम नहीं करता है।
समाधान में थिओल-टर्मिन्ड पॉलीथीन ग्लाइकोल (मेगावाट 2,000; 15.6 मिलीग्राम; 7.8 माइक्रोमोल) जोड़ें, पीएच को 7-7.5 में समायोजित करें और मिश्रण को रात भर 1प्राप्त करने के लिए हिलाएं। 3 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ के साथ झिल्ली निस्पंदन उपकरण का उपयोग करके अपन्तिफेशन/निस्पंदन के तीन चक्रों को लागू करके फैलाव को शुद्ध करें ।
नोट: पीएच का 7-7.5 में समायोजन अत्यंत महत्वपूर्ण है। उच्च पीएच उत्सर्जन मैक्सिमा के एक नीले रंग की पारी में परिणाम कर सकते हैं ।

2. 1 की सतह पर 3-(अमीनोप्रोपिल) ट्रिप्फेनिलफॉस्फोनियम ब्रोमाइड (टीपीपी) का संयुग्मण

पिछले चरण में तैयार 1 समाधान (24 एमएल) और 3-(अमीनोप्रोपिल) ट्रिप्फेनिलफॉस्फोनियम ब्रोमाइड (12 मिलीग्राम, ~ 30 माइक्रोमोल) मिलाएं। पीएच को 1 एम एचसीएल के साथ 4.5 में समायोजित करें।
नोट: 3-(Aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) ब्रोमाइड नमक के रूप में साहित्य में वर्णित²⁰तैयार किया गया था ।
एन-(3-डाइमेथिल-अमीनोप्रोपिल)Nएन ′-एथिलकार्बोडिमिड हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) की अधिकता जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करें एचसीएल) (60 मिलीग्राम, 312 माइक्रोनमोल)। समाधान का पीएच बढ़ेगा और 6 से आगे जाने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। पहले घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के पीएच की निगरानी करें। यदि पीएच 6 से ऊपर बढ़ जाता है, तो 1 एम एचसीएल जोड़कर इसे 4.5-6 तक कम करें।
कमरे के तापमान पर रात भर प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ।
2प्राप्त करने के लिए 3 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ के साथ एक झिल्ली निस्पंदन उपकरण का उपयोग करके अपन्तिफेशन/निस्पंदन के तीन चक्रों को लागू करके फैलाव को शुद्ध करें । पतला 2 यहां 24 मिलीएल की प्रारंभिक मात्रा के लिए अल्ट्राप्योर पानी के साथ प्राप्त किया । समाधान में Au की एकाग्रता २०० μg/mL है ।

3. सेल संस्कृति

डल्बेकको के संशोधित ईगल के माध्यम में संस्कृति वाला कोशिकाएं (एचपीए संस्कृति संग्रह) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ₂ में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक हैं।
विभाजन और कोशिकाओं को पारित जब वे ~ 80% संगम तक पहुंचने। नए म्यूटेंट के अधिग्रहण को कम करने के लिए, सेल प्रचार की संख्या 30 से अधिक नहीं होनी चाहिए।

4. हेला कोशिकाओं में AuNC आंतरिककरण

20,000 कोशिकाओं/mL (1 mL/well) के घनत्व पर 12-अच्छी तरह की प्लेट में कोशिकाओं को बीज करें। लक्ष्य 48 घंटे के बाद ~ 50% संगम प्राप्त करने के लिए है।
48 एच पोस्ट-सीडिंग में, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्ण सुसंस्कृत माध्यम (उपचारित नमूनों के लिए) के 400 माइक्रोन में पूर्ण संस्कृति माध्यम (अनुपचारित नियंत्रणों के लिए) या नैनोकणों के 500 μg जोड़ें। संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटाएं।
नोट: एएनसी समाधान की उच्च मात्रा के अलावा सेल व्यवहार्यता पर प्रतिकूल प्रभाव डालता है। AuNC समाधान ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है । इस प्रकार 2 चरण 2.4 में प्राप्त 100 बार केंद्रित है। 40 एमएल एएनसी 400 माइक्रोन पर केंद्रित था। वांछित एएनसी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 400 माइक्रोन सेल संस्कृति मीडिया में इस केंद्रित समाधान का 25 माइक्रोनएल एलिकोट जोड़ा गया था।
आंतरिककरण के 2 घंटे के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानक ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं को अलग करें।
4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब और 5 मिन के लिए अपकेंद्री के नमूनों को एकत्र करें।
निम्नलिखित एफसीएम बफर तैयार करें: प्री-चिल्ड फॉस्फेट बफरेड लवलाइन (पीबीएस; 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 4.3 एमएम एनए₂एचपीओ_4,1.47 एमएम एनएएच₂पीओ_4,पीएच 7.4) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ पूरक।
छर्रों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 5 मिन के लिए एफसीएम बफर और सेंट्रलाइज के 1 मिलील से धोएं।
एफसीएम बफर के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें और विश्लेषण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

सेल-छलनी टोपी के साथ 5 मिलीआर पॉलीस्टीरिन राउंड-बॉटम ट्यूब का उपयोग करके सभी नमूनों को फ़िल्टर करें।
इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा प्राप्त करने से पहले, साइटोमीटर विन्यास निर्दिष्ट करें।
'अधिग्रहण' के लिए सभी डॉट-प्लॉट और हिस्टोग्राम को प्रारूपित करें।
कोशिकाओं का वितरण दिखाने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) के दो पैरामीटर डॉट प्लॉट को प्लॉट करें। डबल्स को बाहर करने के लिए एफएससी हाइट (एफएससी-एच) बनाम एफएससी-ए का दो पैरामीटर डॉट प्लॉट बनाएं। नमूने में सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता की निगरानी करने के लिए, फ्लोरोसेंट चैनल क्षेत्र (FL-A) के लिए एक एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम की साजिश करें। एफएससी और एसएससी डेटा को चित्रित करने के लिए रैखिक पैमाने का उपयोग करें, और सभी फ्लोरोसेंट मापदंडों के लिए एक लॉगरिथमिक पैमाने पर।
घटना की घटनाओं को कम करने के लिए कम प्रवाह दर पर अनुपचारित नमूना (नैनोकणों के बिना) प्राप्त करें (यदि उपकरण द्वारा अनुमति दी जाती है)। अधिग्रहण के दौरान, एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट पर अनुपचारित आबादी को स्केल पर लाने के लिए फोटोमल्टीक्रेक ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज को समायोजित करें। यदि आवश्यक हो, तो हिस्टोग्राम के बाएं कोने पर अनदाग आबादी को रखने के लिए एफएल चैनल के लिए पीएमटी वोल्टेज को समायोजित करें।
सॉफ्टवेयर में विशिष्ट 'गेट टैब' का चयन करें और वांछित आबादी के चारों ओर एक उपयुक्त गेट आकर्षित करें। गेट के अंदर की कोशिकाएं अगली चौकी पर जाएंगी।
प्रति नमूना 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
सभी नमूनों को एक ही साधन सेटिंग्स के तहत रिकॉर्ड करें।
प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग करें।
नोट: कुछ अनुप्रयोगों को फ़िल्टर के अनुकूलित सेटअप की आवश्यकता हो सकती है। फ़िल्टर एक्सचेंज के लिए हमेशा उपयोगकर्ता गाइड में निर्माण की सिफारिशों का पालन करें।
नोट: प्रयोग को सहेजा जा सकता है और उपकरण सेटिंग्स और गेटिंग रणनीति को संरक्षित करने के लिए फिर से लोड किया जा सकता है।
नोट: एक साइड स्कैटर हाइट (एसएससी-एच) बनाम साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) प्लॉट का इस्तेमाल डबल अपवर्जन के लिए भी किया जा सकता है । इस प्रकार की गेटिंग अधिक संवेदनशील हो सकती है क्योंकि एफएससी डिटेक्टर आमतौर पर पीएमटी नहीं होता है।

6. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के लिए हेला कोशिकाओं में 2 का आंतरिककरण

२५०,००० कोशिकाओं/mL (०.५ mL/कक्ष) के घनत्व पर एक 4 चैंबर ग्लास नीचे ३५ मिमी पकवान पर कोशिकाओं बीज । चैंबर को 5% सीओ₂ वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। लक्ष्य 24 घंटे के बाद ~ 50% संगम प्राप्त करने के लिए है।
24 घंटे के बाद सीडिंग में, कोशिकाओं के साथ मध्यम के ०.५ मिलील युक्त प्रत्येक डिश चैंबर में 2 (या 10 माइक्रोन) के १०० μg जोड़ें (इलाज नमूनों के लिए) ।
इनक्यूबेटर के लिए पकवान वापस। कोशिकाओं को CLSM के लिए उपयोग करने से पहले 24 घंटे के लिए AuNCs आंतरिक करते हैं ।
आंतरिककरण अवधि के बाद, माध्यम को त्यागें और 5 मिन के लिए पूर्व-गरम ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं को धोलें। धोने के कदम को एक बार फिर दोहराएं। फिर प्रत्येक कक्ष को 800 माइक्रोन के साथ भरें।

7. लाइव हेला कोशिकाओं की सीएलएसएम इमेजिंग 2 के साथ लेबल

सूक्ष्म इमेजिंग के लिए, प्लान-एपोक्रोमेट के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में 63x तेल (एन = 1.518) ऑब्जेक्टिव लेंस (एनए = 1.4) का उपयोग करें।
चैंबर के साथ माइक्रोस्कोप उल्टे मंच पर पकवान माउंट 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गरम और आर्द्र 5% सीओ₂ वातावरण के साथ आपूर्ति की।
आंतरिक AuNC का पता लगाने के लिए, एक उपयुक्त बीम स्प्लिटर के साथ 2% शक्ति पर एक 405 एनएम लेजर सेट का उपयोग करें। 650 और 760 एनएम के बीच डिटेक्शन तरंगदैर्ध्य की सीमा निर्धारित करें।
छवि का रेजोल्यूशन 2048 x 2048 पिक्सल पर सेट करें। अधिग्रहण की गति सेटिंग में, पिक्सेल के लिए लक्ष्य 4 μs के आसपास समय निवास । 2x औसत (लाइन मोड, औसत विधि मतलब) के साथ छवि प्राप्त करें । पिनहोल को 1 हवादार यूनिट (405 एनएम लाइट के लिए) सेट करें। उच्च संवेदनशीलता के लिए, फोटॉन-काउंटिंग मोड का उपयोग करें।
अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के साथ प्रेषित प्रकाश में सही रोशनी के लिए, कंडेनसर और फील्ड स्टॉप की कोहलर की सेटिंग का उपयोग करें। प्रेषित प्रकाश के अधिग्रहण के लिए, सौंपे गए किसी भी फ्लोरेसेंस डिटेक्टर के बिना 0.7% बिजली पर 488 एनएम लेजर का उपयोग करें। लेजर तरंगदैर्ध्य के लिए एक उपयुक्त बीम स्प्लिटर सेट करें।
प्रत्येक ट्रैक (लाल फ्लोरेसेंस और डीआईसी) के लिए दो छवियां प्राप्त करें। उनके लाल फ्लोरेसेंस द्वारा AuNCs ट्रैक; सेल सीमाओं को आसानी से डीआईसी चित्रों के साथ प्रेषित प्रकाश में निर्धारित कर रहे हैं।

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Representative Results

एनआईआर पीएल एएनसी को टीए की उपस्थिति में Au^{3 +} से तैयार किया गया था, और फिर थिओल-टर्मिनेट खूंटी (मेगावाट 2,000) को अंक 1में दिखाए गए कार्यप्रवाह के बाद प्राप्त करने के लिए AuNC सतह पर बाध्य किया गया था। 1 और 3-(अमीनोप्रोपिल) ट्रिप्फेनाइलफॉस्फोनियम (टीपीपी) ब्रोमाइड के बीच मामिडिक युग्मन 2प्रदान की गई । जैसा कि अपेक्षित था, अवशोषण स्पेक्ट्रा(चित्रा 2a)ने संकेत दिया कि एएनसी 1 और 2 में एक विशिष्ट सतह प्लाज्मोन बैंड नहीं है और 550 एनएम से 850 एनएम(चित्रा 2बी)तक व्यापक उत्सर्जन दिखाता है। 1की सतह पर टीपीपी के लगाव के बाद, पीएल दृढ़ता से वृद्धि हुई। यूवी लाइट (365 एनएम, फिगर 2बी इनसेट)के तहत एएनसी से उत्सर्जन भी दिखाई दे रहा था। एएनसी से उत्सर्जन स्थिर है और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य उत्तेजना तरंगदैर्ध्य(चित्रा 2 सी)से स्वतंत्र है। हालांकि, यूवी प्रकाश के साथ उत्साहित होने पर उत्सर्जन तीव्रता अधिकतम होती है।

2 एक प्रवाह साइटोमीटर पर पीएल की निगरानी करके वाघेला कोशिकाओं के अंदर पाया गया था । वाघेला कोशिकाओं को ०.५ मिलीग्राम/mL और 2 मिलीग्राम/mL के बीच मीडिया सांद्रता में 2 के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया । एफसीएम डेटा ने हेला कोशिकाओं द्वारा 2 के तेज होने की पुष्टि की। एनआईआर फ्लोरेसेंस (>720 एनएम) दोनों समय(चित्रा 3ए)और 2 की एकाग्रता(चित्रा 3बी)पर निर्भर था। अधिकतम तीव्रता 780/60 बैंडपास फिल्टर के साथ मनाया गया था ।

कोशिकाओं के भीतर AuNCs एक मानक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गैर आक्रामक छवि थे । चित्रा 4 2 (२०० μg/mL) के साथ दाग हेला कोशिकाओं की confocal छवि से पता चलता है । कोशिकाओं के अंदर 2 की ऊष्मायन उज्ज्वल लाल फोटोल्यूमिनेसेंस के 24 घंटे के बाद मनाया गया।

चित्रा 1: सोने नैनोक्लस्टर्स का संश्लेषण। 1 और 2की तैयारी का कार्यप्रवाह । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: गोल्ड नैनोक्लस्टर्स के ऑप्टिकल गुण। सामान्यीकृत(क)अवशोषण स्पेक्ट्रा (इनसेट: सफेद प्रकाश के तहत 1 और 2 के जलीय समाधानों की तस्वीर) और(बी) 200 μg/mL के फोटोल्यूमिनेसेंट स्पेक्ट्रा 1 और 2 (इनसेट: यूवी लाइट (365 एनएम) के तहत AuNC समाधानों की तस्वीर)। (ग)2 केउत्तेजना उत्सर्जन पीएल नक्शा । उत्तेजना 10 एनएम चरणों से स्थानांतरित कर दिया जाता है। ७५० एनएम के आसपास उत्सर्जन चोटी बहुत स्थिर है (उत्तेजना के साथ बदलाव नहीं करता है) और उत्तेजना से एक विशाल स्टोक्स बदलाव से पता चलता है । सबसे कुशल उत्तेजना 340 एनएम के आसपास होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेला कोशिकाओं के अंदर सोने के नैनोक्लस्टर का पता लगाना। वाघेला कोशिकाओं में 2 के आंतरिककरण FCM का उपयोग कर अध्ययन किया गया था । हिस्टोग्राम शो(ए)समय-और(ख)वाघेला कोशिकाओं द्वारा AuNCs के एकाग्रता पर निर्भर तेज । समय पर निर्भर प्रयोग में, वाला कोशिकाओं का इलाज नहीं किया गया (नियंत्रण; 0 एच) या १.२८ मिलीग्राम/mL 2 के साथ इलाज किया और संकेत समय के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड । इसके बाद कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और एफसीएम द्वारा विश्लेषण किया गया । एकाग्रता पर निर्भर प्रयोग में, वाला कोशिकाओं का इलाज नहीं किया गया (नियंत्रण; 0 मिलीग्राम/mL) या 2 की इंगित सांद्रता के साथ इलाज किया और उसी तरह संसाधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4: गोल्ड नैनोक्लस्टर्स के साथ लेबल वाली हेला कोशिकाओं की सीएलएसएम इमेजिंग। वाघेला कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 2 (200 μg/mL) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था और सीएलएसएम के साथ छवि बनाई गई थी। (क)लाल फ्लोरेसेंस चैनल (650-760 एनएम) का प्रतिनिधित्व करता है; (ख) प्रेषित प्रकाश चैनल (डीआईसी) और(ग)(ए)और(ख)का ओवरले है । स्केल बार, 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक आंकड़ा 1: 1 का स्थिरता परीक्षण । 0 एच में 1 एम NaCl में 1 के फोटोल्यूमिनेसेंस स्पेक्ट्रा और 72 घंटे के बाद। तीव्रता को अधिकतमा करने के लिए सामान्य ीकृत किया गया था। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एनआईआर-उत्सर्जक AuNCs को बॉटम-अप दृष्टिकोण का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था जिसमें सोने के अग्रदूत समाधान (एचएयूसीएल₄₎को उपयुक्त थिओल लिगांड के साथ माना गया था, जिसके बाद Au^{3 +}की कमी आई थी। जलीय समाधान में धातु आयनों की कमी के कारण अल्ट्रास्मॉल एनसी²¹के बजाय बड़े नैनोकणों में समग्र और परिणाम होते हैं । अल्ट्रास्मॉल (2 एनएम) पीएल एएनसी तैयार करने के लिए, सिंथेटिक स्थितियों को बड़े कणों के गठन को रोकने और अल्ट्रास्मॉल क्लस्टर के गठन को बढ़ावा देने के लिए समायोजित किया गया था। एएनसी की सतह को सीमित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लिगांडकी प्रकृति^{कणों की}संरचना, इलेक्ट्रॉनिक और ऑप्टिकल गुणों को प्रभावित करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है 12 ,²²^,²³^,24^,²⁵²⁴^,²⁶^,^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰। इसलिए, अल्ट्रास्मॉल क्लस्टर को स्थिर करने में सक्षम उपयुक्त लिगांड चुनना अत्यधिक फ्लोरोसेंट AuNCs प्राप्त करने की कुंजी है। थिओल युक्त लिगांड ्समें थिओल्स और गोल्ड के बीच मजबूत सहसंयोजक संबंध के कारण एएनसी के संश्लेषण में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले स्टेबलाइजर हैं। पिछली रिपोर्ट³¹ से पता चलता है कि मल्टीथिओल आधारित लिगांड पीएल एएनसी के स्थिरीकरण में मोनोथिओल लिगांड ्स से कहीं बेहतर हैं। बहु-थिओल लिगांड ्स लिगांड और एएनसी सतह के बीच बाध्यकारी साइटों की अधिक संख्या के कारण एएनसी को कोलाइडल स्थिरता प्रदान करते हैं। बिडेनटेट थिओल टीए का उपयोग एनआईआर पीएल एएनसी के संश्लेषण के लिए किया गया था क्योंकि यह मोनोथिओल लिगांड्स³²की तुलना में प्रतिकूल परिस्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर एएनसी को बहुत बेहतर कोलॉयडल स्थिरता प्रदान करता है। टीए असतत आकार नियंत्रण के साथ नैनोकणों की जलीय चरण वृद्धि भी प्रदान करता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि यह नैनोकणों की सतह पर एक कार्बोक्लिक एसिड समूह प्रदान करता है जिसका उपयोग जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं^33,^,³⁴के संयोजन के लिए किया जा सकता है।

टीए³⁵सतह पर डिप्रोटोन्ड कार्बोसिलेट समूहों के कारण इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण द्वारा AuNCs को स्थिर करता है । हालांकि, अम्लीय समाधानों में, टीए-संरक्षित AuNCs कार्बोसिलेट समूह के प्रोटोनेशन के कारण कोलाइडी अस्थिर हो जाते हैं। नैनोकणों को विशुद्ध रूप से इलेक्ट्रोस्टैटिकली के बजाय इलेक्ट्रेस्ट्रोस्टिक रूप से स्थिर किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण उच्च नमक सांद्रता और पीएच परिवर्तनों की उपस्थिति में भी कोलॉयडल स्थिरीकरण प्रदान करता है, जो जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। टीए-एएनसी को विद्युत स्थिरीकरण प्रदान करने के लिए, समूहों को बाद में टीए: खूंटी के 5:1 मोलर अनुपात में थिओल-टर्मिनेट खूंटी (मेगावाट 2,000) के साथ कार्यावित किया गया, 1 (चित्रा 1)उपज। थिओल-टर्मिनेट खूंटी के सफल लगाव के लिए टीए-ऑएनसी को शुद्ध किया जाना चाहिए । खूंटी के साथ एएनसी के कार्यात्मकीकरण अम्लीय पीएच में जलीय घुलनशीलता और उच्च आयनिक ताकत मीडिया में कोलॉयडल स्थिरता में वृद्धि में सुधार हुआ है । यह महत्वपूर्ण है कि थिओल-टर्मिनेट खूंटी का कुर्की पीएच 7.0-7.5 पर किया जाता है। उच्च पीएच उत्सर्जन मैक्सिमा के नीले बदलाव में परिणाम होगा । 3 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ के साथ झिल्ली निस्पंदन उपकरण का उपयोग करके अपन्तिफुगेशन/निस्पंदन द्वारा अनबाउंड लिगांड हटा दिए गए थे । नैनोकणों से जुड़े लिगांड ्स मुक्त लिगांड की तुलना में ¹एच एनएमआर में महत्वपूर्ण लाइन का विस्तार होता है, जो पीक असाइनमेंट और एकीकरण³⁶को अस्पष्ट कर सकता है। गौरतलब है कि थियोटिक एसिड और थिओल-संशोधित पॉलीथीन ग्लाइकोल से जुड़े व्यापक ¹एच एनएमआर चोटी से पता चलता है कि लिगांड एएनसी सतह से बंधे हैं और मुफ्त लिगांड्स¹⁸को हटा रहे हैं। एक जैविक वातावरण में ल्यूमिनेसेंट AuNCs के सफल एकीकरण के लिए उच्च आयनिक ताकत जैसी स्थितियों पर स्थिरता की आवश्यकता होती है क्योंकि जैविक मीडिया आयनों से अधिक समृद्ध है। 72 घंटे की अवधि में 1 एम एनसीएल में फोटोल्यूमिनेसेंस की निगरानी करके 1 की स्थिरता का सत्यापन किया गया था। 1 एम एनसीएल में फोटोल्यूमिनेसेंस गुणों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन AuNCs(अनुपूरक चित्रा 1)की उच्च स्थिरता को इंगित करता है । AuNCs वर्षा के किसी भी सबूत के बिना एक साल से अधिक के लिए बफर समाधान में स्थिर थे (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

1 सतह पर कार्बोक्लिक एसिड प्रदान करता है। कार्बोडिमिड आधारित युग्मन अभिकर्ताओं का व्यापक रूप से माइड बॉन्ड³⁷के गठन के माध्यम से कार्बोक्सिलिक एसिड को बारूदी सुरंगों से जोड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। जलीय समाधान में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला कार्बोडिमिड आधारित युग्मन अभिकर्ता 1-एथिल-3-(डाइमेथिलामिनोप्रोपिल) कार्बोडिमिड हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसीएचएल) है। ईडीसी एचसीएल का उपयोग टीपीपी ब्रोमाइड के सहसंयोजक युग्मन के लिए किया गया है जिसमें 2प्राप्त करने के लिए 1 किया गया है। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदों में से एक फ्लोरेसेंस और कोलॉयडल स्थिरता से समझौता किए बिना माइड े बॉन्ड गठन के माध्यम से एक प्राथमिक अमीन समूह के साथ अणुओं का संकीर्तन है। उच्च संकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (HRTEM) लक्षण वर्णन से पता चला है कि AuNCs 1 और 2 दोनों १.१५ ± ०.२ एनएम का औसत व्यास है, जो इंगित करता है कार्यात्मक युग्मन AuNCs¹⁸के मूल आकार में परिवर्तन नहीं करते । वैकल्पिक रूप से, ईडीसी और सल्फो-एनएचएस³⁸का उपयोग करके मुफ्त कार्बोसिल समूहों को सक्रिय किया जा सकता है। 1 और 2 के समाधान यूवी लैंप (365 एनएम) फ्लोरेस उज्ज्वल लाल(चित्रा 1बी,इनसेट)से उत्साहित हैं, जबकि वे परिवेश प्रकाश व्यवस्था के तहत हल्के पीले दिखाई देते हैं(चित्रा 1ए,इनसेट)। टीपीपी संजुगनेशन से एएनसी पीएल को मेटल-टू-लिगामेंट चार्ज ट्रांसफर (एमएलसीटी)¹⁸के कारण बढ़ाता है ।

नैनोकण प्रतिकूल जैविक प्रभाव पैदा कर सकते हैं जो जीव विज्ञान में उनके अनुप्रयोगों को सीमित कर सकते हैं। वाघेला कोशिकाओं पर 2 की साइटोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक्सटीटी (सोडियम 2, 3-बीआईएस (2-मेथोक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफिनाइल)-5-[(फिनाइलिनो)-कार्बोनिल]-2एच-टेट्राजोलियम इनर साल्ट) सेल वायबिलिटी परख किया गया । ४८ घंटे के लिए 2 (२०० μg/mL) के साथ इलाज हेला कोशिकाओं को नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में सेल व्यवहार्यता का कोई नुकसान नहीं दिखाया । इस अवलोकन से पता चलता है कि AuNCs जैव संगत हैं, जो उन्हें जैविक अनुसंधान में आवेदन के लिए फ्लोरोसेंट जांच के रूप में उम्मीदवारों का वादा करता है।

जब एक 405 एनएम लेजर के साथ उत्साहित, 2 ~ 750 एनएम के आसपास एक अधिकतम के साथ एक व्यापक उत्सर्जन प्रदान करता है। बेहद बड़े स्टोक्स शिफ्ट (~ 350 एनएम) उत्सर्जित प्रकाश को रोमांचक प्रकाश स्रोत से मज़बूती से प्रतिष्ठित करने की अनुमति देता है; हालांकि, एफसीएम फिल्टर सेटिंग को उचित रूप से कॉन्फ़िगर करने की आवश्यकता है। 2 के लिए, 780/60 एनएम बैंडपास फिल्टर फिल्टर की व्यापकता और तथ्य यह है कि AuNCs के उत्सर्जन अधिकतम एक ही क्षेत्र में है की वजह से आदर्श है । पीएल³⁹, 40^,^,⁴¹^,,⁴⁰⁴²का कुशल पता लगाने के लिए उत्सर्जन मैक्सिमा के क्षेत्र में व्यापक बैंडपास फिल्टर का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है . 2 के साथ इलाज कोशिकाओं से समय और खुराक पर निर्भर फ्लोरेसेंस संकेत पता चलता है कि FCM आसानी से AuNCs का उपयोग कर सेल अध्ययन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब ऊष्मायन समय को बढ़ाकर 24 घंटे कर दिया गया था, तो एफसीएम (डेटा नहीं दिखाया गया) में फ्लोरेसेंस द्वारा AuNCs का पता लगाने के लिए 2 की 40 μg/mL एकाग्रता पर्याप्त थी। हालांकि, छोटे ऊष्मायन समय (1-2 घंटे) के लिए, एएनसी की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। एक मानक प्रवाह साइटोमीटर के साथ एनआईआर फ्लोरेसेंस सिग्नल द्वारा AuNCs का पता लगाने की यह विधि जैव चिकित्सा विज्ञान में AuNCs के संभावित अनुप्रयोगों को और व्यापक बनाने में मदद करेगी। यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग सेलुलर तेज¹⁴की दरों और तंत्रों, नैनोपार्टिकल एकाग्रता और सेलुलर विषाक्तता के बीच संबंधों, या एनसीएम का उपयोग करके नैनोक्लस्टर तेज पर सतह रसायन विज्ञान के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

वाघेला कोशिकाओं द्वारा 2 के सेलुलर तेज CLSM द्वारा छवि था । 2 के ऊष्मायन उज्ज्वल लाल उत्सर्जन के 24 घंटे के बाद 405 एनएम लेजर के साथ उत्तेजना पर पता चला था। हालांकि, एक 405 एनएम लेजर कोशिकाओं के अंदर आंतरिक फ्लोरोफोरस को भी उत्तेजित करता है। एएनसी के संकेत को ऑटोफ्लोरेसेअलग करने के लिए एएनसी से उत्सर्जन 650 एनएम से ऊपर एकत्र किया गया। आकर्षक गुण, जैसे उज्ज्वल निकट-अवरक्त ल्यूमिनेसेंस, उच्च कोलॉयडल स्थिरता, अच्छी जैव अनुकूलता और उपरोक्त परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि AuNCs बायोमेडिकल और सेलुलर इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इमेजिंग एजेंटों का वादा कर रहे हैं।

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Disclosures

तरीकों और परिणामों के कुछ हिस्से पहले प्रमाणिक एट अल द्वारा लेख में प्रस्तुत किए गए थे।¹⁸ यहां इन तरीकों को व्यावहारिक बिंदु-दर-बिंदु प्रोटोकॉल में बदल दिया गया है। लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक प्रवाह साइटोमेट्री के साथ उसकी मदद के लिए Alzbeta Magdolenova के आभारी हैं । लेखक GACR परियोजना एनआर 18-12533S से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । माइक्रोस्कोपी को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष और चेक गणराज्य के राज्य बजट द्वारा सह-वित्तपोषित कॉन्फोकल और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला में किया गया था, परियोजनाएं नहीं । CZ.1.05/4.1.00/16.0347 और CZ.2.16/3.1.00/21515, और चेक-बायोइमेजिंग लार्ज आरआई परियोजना LM2015062 द्वारा समर्थित ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	TCI Chemicals	D1601	https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4161	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	15130-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98%	Alfa Aesar	L04711	https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35%	PENTA s.r.o.	19350-11000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min	Alfa Aesar	36400	https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000	Sigma-Aldrich	743127	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride	PENTA s.r.o.	16200-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride	PENTA s.r.o.	16610-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	12330-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets	PENTA s.r.o.	15740-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)	Thermo Fisher Scientific	X12223	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223