Summary
可動性の高い、近赤外線発光光発光金ナノクラスターの調製法と、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡によるHeLa細胞内での直接検出の信頼性と再現性の高い方法について説明する。
Abstract
過去10年間、蛍光金ナノクラスター(AuNC)は生物学的用途で人気が高まっており、その開発に多大な努力が注がれてきました。本プロトコルでは、水溶性、生体適合性、およびコロイド的に安定な近赤外線発光AuNCの調製のための、最近開発されたファシリティ法が詳細に説明されている。この室温、ボトムアップ化学合成は水溶液のチオクチン酸およびチオール修飾ポリエチレングリコールで覆われた容易に機能可能なAuNCを提供する。合成アプローチでは、有機溶剤や追加のリガンド交換も、合成化学の広範な知識も必要ありません。結果として得られたAuNCは、フリー表面カルボン酸を提供し、AuNCの光発光特性に悪影響を及ぼすことなく、遊離アミン基を有する様々な生体分子で機能化することができる。HeLa細胞によるAuNC取り込みのフロー細胞量定量および共焦点顕微鏡イメージングのための迅速で信頼性の高い手順についても説明した。ストークスシフトが大きいため、AuNCの近赤外光発光を効率的に検出するには、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡におけるフィルタの適切な設定が必要です。
Introduction
過去10年間で、超小型(≤2 nm)光発光金ナノクラスター(PL AuNC)は、基礎研究と実用的な,,アプリケーション1、2、3、4、5、6、7、8、9、102,の両方の有望なプローブとして登場9,10しました3,4,5。6,78,1彼らの多くの望ましい特徴は高い写真安定性、調整可能な放出の極大さ、長い放出の寿命、大きいストークスのシフト、低い毒性、良い生物適合性、腎クリアランスおよびファシリティバイオコンジュゲーションを含んでいる。PLのAuNCは、青色から近赤外(NIR)スペクトル領域までの光発光を提供することができ、クラスター11内の原子の数および表面リガンド12の性質に応じて異なる。NIR(650-900 nm)を発するAUNCは、細胞および組織の長期的なインビトロおよびインビボイメージングにおいて特に有望であり、内在自家蛍光との重なりが最小、散乱と吸収の弱さ、およびNIR光13、14,14の高い組織浸透による高いシグナル対雑音比を提供する。
近年、種々のチオール含有リガンド13、15、16、17を用いたNIR-PL AuNCを調製するために15,16,17、Au-S共有結合相互作用を利用する様々なアプローチが開発されている。生物医学の応用のために、AuNCは結合相互作用を促進するために生物学的なコンポーネントによって機能化されなければならない。従って、水性溶媒中で容易に機能可能な高いコロイド安定性を有するオーNCが非常に望ましい。現在のプロトコルの全体的な目標は、水性環境下でチオクチン酸およびポリエチレングリコール(PEG)を詳細に採用し、酸アミンカップリング法に従って一次アミンを持つ分子との結合を使用して、表面に機能可能なカルボン酸基を有するAuNCの以前に報告された18の調製を記述することです。合成が容易で再現性が高いため、このプロトコルは非化学の背景を持つ研究者が使用し、適応することができます。
生物医学研究におけるAuNCの応用に必要な重要な条件の1つは、細胞内のAuNCを観察し測定する能力です。細胞によるナノ粒子の取り込み監視に利用できる方法のうち、フローサイトメトリー(FCM)および共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、多数の細胞19における蛍光ナノ材料の内在化を迅速に測定できる、堅牢で高スループットな方法を提供する。ここで、細胞内のPL AuNCを直接測定および分析するためのFCMおよびCLSM法は、追加の染料を必要とせず、また提示されている。
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Protocol
1. 近赤外線発出オーNCの準備 (1)
- 7.8 mg(37.8 μmol)チオクチン酸(TA)と2M NaOHの60 μLを23.4mLの超純水(25°Cで抵抗率18.2 MΩ.cm)に加え、完全に溶解するまで(少なくとも1,000rpm)(少なくとも1,000rpm)をかき混ぜます(〜15〜20分)。TAの迅速な溶解のために、混合物を超音波処理します。合成には、作りたてのTA溶液が推奨される。
- 10.2 μL の HAuCl4・3H2O (470 mg/mL) の水溶液を溶液に加えます。
- 15分後、激しい撹拌(少なくとも1,000rpm)下でNaBH 4(1.9mg/mL)480μLを加え、同じ条件下で反応混合物を一晩攪拌します。4
注:新鮮な氷冷超純水でNaBH4溶液を調製し、調製後すぐに反応混合物に追加します。
メモ: AuNC の合成は容易にスケーラブルです。最大2LのAuNCを単一バッチで合成し、粒子の光学特性に変化を起じることなく行った。 - (クリティカル)翌日、分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して溶液を浄化する。この精製手順がなければ、以下の工程が正常に動作しない。
- チオール終端ポリエチレングリコール(MW 2,000;15.6 mg;7.8 μmol)を溶液に加え、pHを7~7.5に調整し、混合物を一晩攪拌して1を得る。分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して分散液を浄化する。
注: 7-7.5 への pH の調整は非常に重要です。pHが高いほど、発光マキシマの青いシフトが生じる可能性があります。
2. 1の表面に3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)の結合
- 前工程で調製した溶液1(24mL)と3-(アミノプロピル)臭化トリフェニルホスホニウム(12mg、〜30μmol)を混合します。1 M HCl で pH を 4.5 に調整します。
注:3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)ブロマイド塩は文献20に記載されているように調製した。 - N-(3-ジメチル-Nアミノプロピル)-N'エチルカルボジジミド塩酸塩(EDC·HCl)(60mg、312 μmol)。溶液のpHは増加し、6を超えて行くことを許されるべきではない。反応混合物のpHを最初の1時間監視する。pH が 6 を超える場合は、1 M HCl を追加して 4.5 ~ 6 に減らします。
- 反応混合物を室温で一晩かき混ぜる。
- 分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して分散液を精製し、2を得る。ここで得られた2を超純水で24mLの初期体積に希釈する。溶液中のAuの濃度は200 μg/mLである。
3. 細胞培養
- ダルベッコの修飾されたイーグルの培地における培養HeLa細胞(HPA培養コレクション)は、37°Cで5%CO2で10%の胎児ウ2シ血清を添加した。
- 彼らは約80%合流に達したときに細胞を分割し、通過します。新しい変異体の獲得を最小限に抑えるために、細胞の伝播数は30を超えてはならない。
4. HeLa細胞へのAuNCの内部化
- 20,000細胞/mL(1 mL/ウェル)の密度で12ウェルプレートに細胞を播種します。目標は、48時間後に〜50%の合流を達成することです。
- 48時間のポストシードで、培養培地を吸引し、400μGの完全な培養培地(未処理のコントロール用)または500μgのナノ粒子を400μLの完全培養培地(処理サンプル用)に各ウェルに加えます。培養物を37°Cインキュベーターに戻します。
注:大量のAuNC溶液を添加すると、細胞の生存率に悪影響を及ぼします。AuNCソリューションは集中する必要があります。このようにしてステップ2.4で得られた2は100回濃縮される。40 mL AuNCを400μLに濃縮した。この濃縮溶液の25μLアリコートを400μLの細胞培養培地に添加し、所望のAuNC濃度を得た。 - 2時間の内部化後、メーカーのプロトコルに従って標準的なトリプシン法によってセルを取り外します。
- 4 °Cで350 x gで5分間、ポリプロピレンマイクロ遠心分離管と遠心分離機でサンプルを収集します。
- 次のFCMバッファーを準備する:4°Cで2%ウシ血清アルブミンを補充する前冷やしたリン酸緩衝生理(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM Na2HPO 4、1.47 mM NaH2PO4、pH7.4)を補充した。4
- 4°Cで350 x gで5分間、FCMバッファーと遠心分離機の1 mLでペレットを洗浄します。
- 500 μLのFCMバッファーでペレットを再懸濁し、分析前にサンプルを 4 °C に保存します。
5. フローサイトメトリー解析
- セルストレーナーキャップ付き5 mLポリスチレンラウンドボトムチューブを使用して、すべてのサンプルをフィルターします。
- 計測器ソフトウェアを使用してデータを取得する前に、サイトメーターの構成を指定します。
- 「取得」のすべてのドットプロットとヒストグラムをフォーマットします。
- 前方散乱領域(FSC-A)と側面散乱領域(SSC-A)の2パラメータのドットプロットをプロットして、セルの分布を示します。ダブレットを除外するには、FSC 高さ (FSC-H) と FSC-A の 2 パラメータのドット プロットを作成します。サンプル中の相対的な蛍光強度を監視するには、蛍光チャネル領域(FL-A)の単一パラメータヒストグラムをプロットします。線形スケールを使用して、FSC および SSC データを表現し、すべての蛍光パラメータの対数スケールを使用します。
- 一致する事象を最小限に抑えるために、未処理のサンプル(ナノ粒子を含まない)を低い流量で取得し(機器で許可されている場合)取得中に、光増倍管(PMT)電圧を調整して、FSCとSSCプロットで未処理の母集団をスケールで取得します。必要に応じて、FL チャンネルの PMT 電圧を調整して、染色されていない母集団をヒストグラムの左隅に配置します。
- ソフトウェア内の特定の「ゲートタブ」を選択し、希望の人口の周りに適切なゲートを描画します。ゲート内のセルは次のチェックポイントに移動します。
- サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録します。
- すべてのサンプルを同じインストゥルメント設定で記録します。
- フローサイトメトリーデータを分析するには、適切なプログラムを使用します。
注: アプリケーションによっては、フィルタのカスタマイズが必要な場合があります。フィルタ交換については、常にユーザーガイドの製造の推奨事項に従ってください。
メモ:実験を保存して再ロードして、計測器の設定とギャッティング戦略を保存することができます。
注: 横散乱高さ(SSC-H)と側散乱領域(SSC-A)プロットは、ダブル除外にも使用できます。このタイプの格紙は、通常はPMTではないため、より感度が高くなる可能性があります。
6. 共焦点レーザー走査顕微鏡用HeLa細胞への2の内部化(CLSM)
- 250,000セル/mL(0.5 mL/チャンバー)の密度で4チャンバーガラス底35mm皿に細胞を播種します。チャンバーを5%CO2雰囲気の37°Cインキュベーター2に入れます。目標は、24時間後に〜50%の合流を達成することです。
- 24時間のポストシードで、細胞と一緒に0.5 mLの培地を含む各皿チャンバーに2の100 μg(または10 mg/mLのストック溶液から10 μL)を加えます(処理されたサンプル用)。
- 皿をインキュベーターに戻します。細胞は、CLSM用に使用する前に24時間、AuNCを内部化します。
- 内在化期間の後、培地を捨て、あらかじめ温めた新鮮な培地で細胞を5分間洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。その後、各チャンバーに800 μLの新鮮な培地を充填します。
7. 2で標識された生きたヘラ細胞のCLSMイメージング
- 顕微鏡イメージングの場合は、プラン・アポクロマトと共焦点顕微鏡で63x油(n = 1.518)対物レンズ(NA = 1.4)を使用してください。
- チャンバーを37°Cに温め、加湿した5%CO2雰囲気を供給して、顕微鏡反転ステージに皿を2取り付けます。
- 内部化されたAuNCを検出するには、適切なビームスプリッターを備えた2%のパワーで405 nmレーザーセットを使用します。検出波長の範囲を650~760nmの範囲に設定します。
- 画像の解像度を 2048 x 2048 ピクセルに設定します。取得速度設定では、4 μs前後のピクセルドウェル時間を目指し、2x平均(ラインモード、平均法平均平均)で画像を取得します。ピンホールを1つのエアリーユニット(405 nm光用)に設定します。高感度を設定するには、フォトンカウントモードを使用します。
- 差動干渉コントラスト(DIC)を用いた透過光の照明を正しく行う場合は、ケーラーのコンデンサとフィールドストップの設定を使用します。透過光の取得には、蛍光検出器を割り当てずに0.7%の電力で488nmレーザーを使用してください。レーザー波長に適したビームスプリッタを設定します。
- 各トラック(赤蛍光とDIC)の2つの画像を取得します。彼らの赤い蛍光によってAuNCを追跡します。細胞境界はDICの写真と透過光の中で容易に決定される。
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Representative Results
NIR PL AuNCは、TAの存在下でAu3+から調製され、次いで、チオール終端PEG(MW 2,000)をAuNC表面に結合し、図1に示すワークフローに従って1を得た。1と3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)ブロマイドの間のアミニックカップリングは2.予想通り、吸収スペクトル(図2a)は、AuNC11および2が特徴的な表面プラズモンバンドを有しておらず、550nmから850nmまでの広い発光を示すことを示した(図2b)。TPPを1の表面に付着した後、PLは強く増加した。オーNCからの放出は、UV光下でも見える(365 nm、図2bインセット)。AuNCからの発光は安定しており、発光波長は励起波長とは無関係である(図2c)。ただし、UV ライトで励起すると、発光強度は最大になります。
フローサイトメーター上のPLを監視することによってHeLa細胞内で2を検出した。HeLa細胞を、0.5 mg/mLと2 mg/mLの間の培地濃度で2時間インキュベートした。FCMデータはHeLa細胞による2の取り込みが確認された。NIR蛍光(>720 nm)は、時間(図3a)と濃度2(図3b)の両方に依存していた。780/60バンドパスフィルタで最大強度が観測された。
細胞内のAuNCは、標準的な共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて非侵襲的に画像化した。図4は、2(200μg/mL)で染色されたHeLa細胞の共焦点像を示しています。 224時間のインキュベーション後、細胞内部2の真っ赤な光発光が観察された。
図1:金ナノクラスターの合成1と2の準備のワークフロー .この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:金ナノクラスターの光学的特性正規化(a)吸収スペクトル (インセット: 白色光下の1と2の水溶液の写真)と(b)1と2の200 μg/mL水溶液の光発光スペクトル1(インセット: UV光下のAuNC溶液の写真(365 nm))。(c) 励起放出PLマップ2.励起は10 nmステップずされる。750 nmの周りの放出ピークは非常に安定しており(励起と共にシフトしない)、興奮からの巨大なストークスシフトを示す。最も効率的な励起は340 nmの周りに起こる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメトリーによるHeLa細胞内の金ナノクラスターの検出2のHeLa細胞への内在化をFCMを用いて検討した。ヒストグラムは、HeLa細胞によるAuNCの(a)時間および(b)濃度依存的な取り込みを示す。時間依存実験では、HeLa細胞を未処理(対照;0時間)、または1.28mg/mL2で処理し2、示された時間に対して37°Cでインキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、FCMによって分析した。濃度依存実験では、HeLa細胞を未治療(対照;0mg/mL)、または示された濃度2で処理し、同様に処理した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:金ナノクラスターで標識されたHeLa細胞のCLSMイメージング。HeLa細胞を24時間(200μg/mL)でインキュベートし、CLSMで画像化.した。a(b) 伝送光チャネル (DIC) および (c) のオーバーレイ (a) と (b)スケールバー、50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:1の安定性試験。0時間及び72時間後に1 MNaClの1の光発光スペクトル。強度は最大に正規化されました。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
NIR発光AuNCは、金前駆体溶液(HAuCl4)を適切なチオールリガンドで処理し4、続いてAu3+の還元を行うボトムアップアプローチを用いて合成した。水溶液中の金属イオンの還元は凝集する傾向があり、超小型NC21ではなく、大きなナノ粒子をもたらす。超小型(≤2 nm)PL AuNCを調製するために、合成条件を調整して大きな粒子の形成を防止し、超小クラスターの形成を促進した。AuNC表面をキャップするために使用されるリガンドの性質はまた、粒子,,,,,,12、22、23、24、25、26、27、28、29、30の構造、電子および光学特性に影響を与える上で重要な役割を果たす。12,22,2329,302425262728したがって、超小型クラスターを安定化できる適切なリガンドを選ぶことが、蛍光性の高いAuNCを得る鍵となります。チオール含有リガンドは、チオールと金の間の強い共有結合のために、AuNCの合成に最も一般的に使用される安定剤です。以前の報告31は、PL AuNCの安定化においてマルチチオールベースのリガンドがモノチオールリガンドよりもはるかに優れていることを示している。マルチチオールリガンドは、リガンドとAuNC表面との結合部位の数が多いため、AuNCにコロイド安定性を高めます。また、オリエン酸チオールTAは、モノチオールリガンド32と比較して広範囲の有害条件にわたってAuNCに多くの改善されたコロイド安定性を提供するため、NIR PL AuNCの合成に使用された。TAはまた、離散的なサイズ制御を有するナノ粒子の水相成長を提供し、そして最も重要なことは、生物学的に関連する分子33、34,34の結合に利用することができるナノ粒子の表面にカルボン酸基を提供する。
TAは、表面35上の脱プロトン化カルボキシレート基によって生じる静電反発によってAuNCを安定化させる。しかし、酸性溶液では、TA保護されたAuNCは、カルボキシレート基のプロトネーションによりコロイド的に不安定になる。ナノ粒子は、純粋に静電気的にではなく、静電気的に安定化することができます。このアプローチは、高塩濃度およびpH変化の存在下でもコロイド安定化を提供し、これは生物医学的用途にとって重要である。TA-AuNCに電気安定化を与えるために、クラスターは、TA:PEGの5:1モル比でチオール終端PEG(MW 2,000)で後に機能し、1を得た(図1)。チオール終端PEGの取り付けが成功するためには、TA-AuNCを精製する必要があります。PEGを用いたAuNCの機能化により、酸性pHにおける水溶性が向上し、高イオン強度媒体におけるコロイド安定性の向上が行われた。チオール終端PEGの付着がpH 7.0-7.5で行われることが重要である。pHが高いほど、発光最大値の青いシフトが生じる。非結合リガンドは、分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて遠心分離/ろ過によって除去した。ナノ粒子に関連するリガンドは、フリーリガンドと比較して1HNMRで有意な線幅を広げ、ピーク割り当ておよび統合36をあいまいにすることができる。チオクト酸およびチオール修飾ポリエチレングリコールに関連する有意に広い1HNMRピークは、リガンドがAuNC表面に結合し、遊離リガンド18の除去を示唆している。生物培地はイオンを超える量が多いため、発光AuNCを生物学的環境にうまく組み込むには、イオン強度の高い条件に対する安定性が必要です。1の安定性は、72時間の期間にわたって1 M NaClにおける光発光を監視することによって検証した。1 M NaClにおける光発光特性に有意な変化は、AuNCの安定性が高いことを示す(補足図1)。AuNCは、沈殿の証拠なしに1年以上緩衝溶液中で安定していた(データは示されていない)。
1は表面にカルボン酸を提供しています。カルボジイミド系カップリング試薬は、アミド結合37の形成を介してカルボン酸をアミンに共有結合するために広く使用されている。水溶液中で最も一般的に使用されるカルボジイミドベースのカップリング試薬は、1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC∙HCl)です。EDC∙HClは、2を得るために1とのTPP臭化物の共有結合に使用されている。このプロトコルの主な利点の1つは、蛍光およびコロイド安定性を損なうことなくアミド結合形成を介して一次アミン基を有する分子の結合である。高解像度透過型電子顕微鏡(HRTEM)特性評価は、AuNC 1と2の両方が平均直径1.15±0.2nmであることを示し、機能的カップリングがAuNC18のコアサイズを変化させないことを示した。あるいは、無料のカルボキシル基は、EDCおよびスルフォNHS38を使用して活性化することができる。UVランプ(365 nm)で励起された1と2のソリューションは、明るい赤色(図1b、インセット)を蛍光しますが、周囲の照明下では淡い黄色に見えます(図1a、インセット)。TPP結合は、金属間電荷移動(MLCT)18によりAuNC PLを増加させる。
ナノ粒子は、生物学における応用を制限する有害な生物学的影響を引き起こす可能性があります。HeLa細胞に対する2の細胞毒性を評価するために、XTT(ナトリウム2、3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルフォフェニル)-5-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム内塩)細胞生存アッセイを行った。HeLa細胞を48時間2(200μg/mL)で処理した場合、コントロール細胞と比較して細胞生存率の損失は見なかった。この観察は、AuNCが生体適合性であることを示唆しており、生物学的研究における応用のための蛍光プローブとして有望な候補となる。
405 nmレーザーで励起すると、2は最大約750nmの広い発光を提供する。極めて大きなストークスシフト(350nm)により、放出された光を励起光源と確実に区別することができます。ただし、FCM フィルター設定は適切に構成する必要があります。2の場合、780/60 nmバンドパスフィルタは、フィルタの広さとAuNCの最大放出が同じ領域にあるという事実のために理想的です。PL,39、40、41、42の効率的な検出のために放出最大の領域39,40で広帯域バンドパスフィルタを使用することは非常41に42重要です。2で処理された細胞からの時間および用量依存性蛍光シグナルは、FCMがAuNCを用いて細胞研究を簡便に監視するために使用できることを示唆している。インキュベーション時間を24時間に増加させたとき、FCMにおける蛍光によるAuNCの検出には40μg/mL濃度2で十分であった(データは示さなかった)。しかし、短いインキュベーション時間(1-2時間)には、より高い濃度のAuNCが必要です。NIR蛍光シグナルを標準フローサイトメーターで検出するこの方法は、生物医学におけるAuNCの潜在的な応用をさらに広げるのに役立ちます。ここで説明するアプローチは、細胞の取り込み14の速度とメカニズム、ナノ粒子濃度と細胞毒性の関係、または表面化学がナノクラスターの取り込みに及ぼす影響をFCMを用いて迅速かつ定量的に評価するために使用することができる。
HELa細胞による2の細胞取り込みはCLSMによって画像化された。24時間のインキュベーションの後、明るい赤色発光2が405nmレーザーで励起されたときに検出された。しかし、405nmレーザーはまた、細胞内の固有の蛍光性を励起する。オート蛍光とAuNCの信号を区別するために、AuNCからの放出は650nm以上に集めた。明るい近赤外発光、高コロイド安定性、良好な生体適合性などの魅力的な特性は、AuNCが生物医学および細胞イメージングアプリケーションの有望なイメージング剤であることを示しています。
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Disclosures
メソッドと結果のいくつかの部分は、プラマニクら18の記事で以前に提示された、ここで、これらの方法は、実用的なポイントバイポイントプロトコルに変換されています。著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、アルツベタ・マグドルレノワのフローサイトメトリーの助けに感謝している。著者らは、GACRプロジェクトNr.18-12533Sからの財政的支援を認めている。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算が共同出資した共焦点・蛍光顕微鏡研究所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ.2.16/3.1.00/21515、およびチェコバイオイメージング大RIプロジェクトLM2015062によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
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