Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntes av nära infraröd avgivande guld nanokluster för biologiska tillämpningar

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 3, 1
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 4First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

En tillförlitlig och lätt reproducerbar metod för beredning av functionalizable, nära infraröd avgivande fotoluminescerande guld nanokluster och deras direkta detektion inuti HeLa celler genom flöde cytometri och confocal laser scanning mikroskopi beskrivs.

Abstract

Under det senaste årtiondet har fluorescerande guld nanokluster (AuNCs) bevittnat växande popularitet i biologiska tillämpningar och enorma ansträngningar har ägnats åt deras utveckling. I detta protokoll har en nyligen utvecklad, facile metod för beredning av vattenlösliga, biokompatibla och kolloidalt stabil nära infraröd avgivande AuNCs beskrivits i detalj. Denna rumstemperatur, nedifrån och upp kemisk syntes ger lätt funktionelliserbara AuNCs täckt med tiooktsyra och tioolmodifierad polyetylenglykol i vattenlösning. Den syntetiska metoden kräver varken organiska lösningsmedel eller ytterligare ligand utbyte eller omfattande kunskap om syntetisk kemi att reproducera. De resulterande AuNCs erbjuder gratis yta karboxylsyra, som kan funktionaliseras med olika biologiska molekyler som bär en fri amin grupp utan att negativt påverka de fotoluminescerande egenskaperna hos AuNCs. Ett snabbt, tillförlitligt förfarande för flöde cytometrisk kvantifiering och confocal mikroskopisk avbildning av AuNC upptag av HeLa celler också beskrivits. På grund av den stora Stokes skift, korrekt inställning av filter i flöde cytometri och konfokalmikroskopi är nödvändigt för effektiv detektion av nära infraröd fotoluminescens av AuNCs.

Introduction

Under det senaste årtiondet har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerande nanokluster i guld (PL AuNCs) framträtt som lovande sonder för både grundforskning och praktiska tillämpningar1,,2,,3,4,,5,,6,,,7,,8,,9,10. Deras många önskvärda egenskaper inkluderar hög fotostabilitet, avstämbara utsläpp maxima, långa utsläpp livstider, stora Stokes skift, låg toxicitet, god biokompatibilitet, renal clearance och facile bioconjugation. PL AunCs kan ge fotoluminescens från det blå till nära infraröda (NIR) spektralområdet, beroende på antalet atomer i klustret11 och arten av ytan ligand12. NIR (650-900 nm) avger AuNCs är särskilt lovande för långsiktiga in vitro och in vivo imaging av celler och vävnader, eftersom de erbjuder hög signal-brus förhållande på grund av minsta överlappning med inneboende autofluorescens, svagare spridning och absorption, och hög vävnad penetration av NIR ljus13,14.

Under de senaste åren har olika metoder som utnyttjar Au-S kovalenta interaktioner utvecklats för att förbereda NIR-PL AuNCs begränsas med en mängd tiool-innehållande ligander13,,15,16,17. För biomedicinska tillämpningar måste Auncs funktionaliseras med en biologisk komponent för att underlätta bindande interaktioner. Således auncs med hög kolloidal stabilitet som är lätt functionalizable i vattenlösningsmedel är mycket önskvärt. Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att beskriva en tidigare rapporterade18 beredning av AuNCs med en functionalisable karboxylsyra grupp på ytan genom att använda tiooktic syra och polyetylenglykol (PEG) i en vattenmiljö i detalj och deras konjugering med molekyler som bär en primär amin efter syra-amin kopplingsmetod. På grund av enkel syntes och hög reproducerbarhet, kan detta protokoll användas och anpassas av forskare från icke-kemi bakgrunder.

En av de viktigaste förfrågeför tillämpningar av AuNCs i biomedicinsk forskning är förmågan att observera och mäta AuNCs inuti celler. Bland de metoder som finns tillgängliga för att övervaka nanopartikelupptag av celler, flödescytometri (FCM) och konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) erbjuder robusta, hög genomströmning metoder som möjliggör snabba mätningar av internalisering av fluorescerande nanomaterial i stort antal celler19. Här har fcm och CLSM-metod för direkt mätning och analys av PL AuNCs inuti celler, utan behov av ytterligare färgämnen, också presenterats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av nära infraröda avgivande AuNCs (1)

  1. Tillsätt 7,8 mg (37,8 μmol) tiookt syra (TA) och 60 μl 2 M NaOH till 23,4 ml ultrapurevatten (resistivitet 18,2 MΩ.cm vid 25 °C) och rör om (minst 1 000 varv/min) tills det löser sig helt (~15-20 min). För snabbare upplösning av TA, sonikera blandningen. För syntes rekommenderas nyberedd TA-lösning.
  2. Tillsätt 10,2 μl HAuCl4·3H2O (470 mg/ml) vattenlösning till lösningen.
  3. Efter 15 minuter tillsätt 480 μl NaBH4 (1,9 mg/ml) under kraftig omrörning (minst 1 000 varv/min) och rör om i reaktionsblandningen under samma förhållanden över natten.
    OBS: Förbered NaBH4-lösningen nyligen i iskallt ultrarent vatten och tillsätt reaktionsblandningen omedelbart efter beredningen.
    Syntesen av AuNCs är lätt skalbar. Upp till 2 L auncs syntetiserades i ett enda parti, utan någon förändring i partiklarnas optiska egenskaper.
  4. (Kritisk) Nästa dag, rena lösningen genom att tillämpa tre cykler av centrifugering / filtrering med hjälp av ett membran filtreringsenhet med en molekylvikt cut-off på 3 kDa. Utan denna reningsprocedur fungerar inte följande steg korrekt.
  5. Tillsätt tioolsenad polyetylenglykol (MW 2,000; 15,6 mg; 7,8 μmol) till lösningen, justera pH-värdet till 7-7,5 och rör om blandningen över natten för att få 1. Rena dispersionen genom att tillämpa tre centrifugerings-/filtreringscykler med hjälp av en membranfiltreringsanordning med en molekylviktsskärning på 3 kDa.
    OBS: Justering av pH till 7-7,5 är oerhört viktigt. Högre pH kan resultera i en blå förskjutning av utsläpp maxima.

2. Konjugering av 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium bromid (TPP) på ytan av 1

  1. Blanda den 1 lösning (24 ml) som beretts i föregående steg och 3-(aminopropyl)trifenylphosphoniumbromid (12 mg, ~30 μmol). Justera pH-värdet till 4,5 med 1 M HCl.
    OBS: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) bromid salt beretts som beskrivs i litteraturen20.
  2. Starta reaktionen genom att lägga till ett överskott av N-(3-dimetyl-aminopropyl)-N′-etylcarbodiimide hydroklorid (EDC· HCl) (60 mg, 312 μmol). Lösningens pH-kort kommer att öka och bör inte tillåtas gå längre än 6. Övervaka pH-värdet för reaktionsblandningen under den första timmen. Om pH-värdet ökar över 6, minska det till 4,5–6 genom att lägga till 1 M HCl.
  3. Rör om i reaktionsblandningen över natten i rumstemperatur.
  4. Rena dispersionen genom att tillämpa tre centrifugerings-/filtreringscykler med hjälp av en membranfiltreringsanordning med en molekylviktsskärning på 3 kDa för att erhålla 2. Späd 2 erhålls här med ultrapure vatten till den ursprungliga volymen av 24 ml. Koncentrationen av Au i lösningen är 200 μg/ml.

3. Cellkultur

  1. Kultur HeLa celler (HPA kultur samling) i Dulbecco modifierade Eagle's Medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum i 5% CO2 vid 37 °C.
  2. Dela och passage cellerna när de når ~ 80% sammanflödet. För att minimera förvärv av nya mutanter bör antalet cellförökningar inte överstiga 30.

4. AuNC internalisering i HeLa celler

  1. Så frön cellerna i en 12-brunnsplatta med en densitet på 20 000 celler/ml (1 ml/brunn). Målet är att uppnå ~ 50% sammanflödet efter 48 h.
  2. Vid 48 h efter sådd, aspirera odlingsmediet och tillsätt 400 μl komplett odlingsmedium (för obehandlade kontroller) eller 500 μg nanopartiklar i 400 μl komplett odlat medium (för behandlade prover) till varje brunn. Återför kulturerna till en inkubator på 37 °C.
    OBS: Tillägg av höga volymer av AuNC-lösning påverkar cellens livskraft negativt. AuNC-lösningar måste koncentreras. Således koncentreras 2 som erhålls i steg 2.4 100 gånger. 40 ml AuNC koncentrerades till 400 μL. En 25 μL alikvot av denna koncentrerade lösning tillsatts till 400 μL cellodlingsmedia för att erhålla önskad AuNC-koncentration.
  3. Efter 2 h internalisering, lossa cellerna genom standard trypsinization enligt tillverkarens protokoll.
  4. Samla in proverna i mikrocentrifugrör av polypropylen och centrifug i 5 min vid 350 x g vid 4 °C.
  5. Förbered följande FCM-buffert: förkyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM NaNa 2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7.4) kompletterat med 2% bovin serumalbumin vid 4 °C.
  6. Tvätta pelletsen med 1 ml FCM-buffert och centrifug i 5 min vid 350 x g vid 4 °C.
  7. Resuspend pelleten i 500 μL FCM buffert och lagra prover vid 4 °C före analys.

5. Flödescytometrianalys

  1. Filtrera alla prover med ett 5 ml polystyren runt bottenrör med cell-sillock.
  2. Innan du hämtar data med hjälp av instrumentprogramvaran ska du ange cytometerkonfigurationen.
  3. Formatera alla punktdiagram och histogram för "Förvärv".
  4. Rita ett punktdiagram med två parametrar för det främre spridningsområdet (FSC-A) och side scatter-området (SSC-A) för att visa fördelning av celler. Om du vill utesluta du dubbletar skapar du ett punktdiagram med två parametrar med FSC-höjd (FSC-H) jämfört med FSC-A. Om du vill övervaka den relativa fluorescensintensiteten i provet ritar du ett histogram med en parameter för fluorescerande kanalområdet (FL-A). Använd en linjär skala för att visa FSC- och SSC-data och en logaritmisk skala för alla fluorescerande parametrar.
  5. Förvärva obehandlat prov (utan nanopartiklar) med lågt flöde för att minimera händelser vid sammanträffande (om instrumentet tillåter det). Justera under förvärvet av fotomultiplierrörets (PMT) spänningar för att få den obehandlade populationen på skala på FSC vs SSC-tomten. Om det behövs, justera PMT-spänningar för FL-kanalen för att placera den ofläckade populationen i det vänstra hörnet av histogrammet.
  6. Välj den specifika "grindfliken" i programvaran och rita en lämplig grind runt önskad population. Celler inuti porten kommer att flytta till nästa kontrollpunkt.
  7. Spela in 10 000 händelser per prov.
  8. Registrera alla prover under samma instrumentinställningar.
  9. Använd ett lämpligt program för att analysera flödescytometridata.
    Vissa program kan kräva anpassad installation av filter. För filterutbyte följer alltid tillverkarens rekommendationer i bruksanvisningen.
    Experimentet kan sparas och laddas om för att bevara instrumentinställningarna och gating-strategin.
    OBS: En sida scatter höjd (SSC-H) vs sidan scatter område (SSC-A) tomt kan också användas för doublet uteslutning. Denna typ av gating kan vara mer känsliga eftersom FSC detektorn är vanligtvis inte en PMT.

6. Internalisering av 2 i HeLa celler för konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM)

  1. Sådd cellerna på en 4-kammare glasbotten 35 mm skålen med en densitet av 250.000 celler / ml (0,5 ml / kammare). Förvara kammaren i en 37 °C-inkubator med 5 % CO2-atmosfär. Målet är att uppnå ~ 50% sammanflödet efter 24 h.
  2. Tillsätt 100 μg 2 (eller 10 μL från stamlösningen på 10 mg/ml) vid 10 mg/ml) till varje skålkammare som innehåller 0,5 ml medium med cellerna (för behandlade prover).
  3. Lämna tillbaka skålen till inkubatorn. Låt cellerna internalisera AuNCs för 24 timmar innan du använder dem för CLSM.
  4. Efter internaliseringsperioden, kassera mediet och tvätta cellerna med förvärmt färskt medium i 5 min. Upprepa tvättsteget en gång till. Fyll sedan varje kammare med 800 μL färskt medium.

7. CLSM Imaging av levande Hela celler märkta med 2

  1. För mikroskopisk avbildning, använd 63x olja (n = 1,518) objektiv (NA = 1,4) i ett konfokalmiskop med Plan-Apochromat.
  2. Montera skålen på mikroskopet inverterad scen med kammaren värmd till 37 °C och levereras med fuktad 5% CO2 atmosfär.
  3. För att upptäcka internaliserad AuNC, använd en 405 nm laser som på 2% effekt med en lämplig strål splitter. Ställ in detekteringsvåglängder mellan 650 och 760 nm.
  4. Ställ in bildens upplösning på 2 048 x 2 048 pixlar. I inställningen för förvärvshastighet, sikta på en pixelinbläddringstid runt 4 μs. Förvärva bilden med 2x-medelvärde (linjeläge, medelvärdesmetod). Ställ in hålet på 1 Luftig enhet (för 405 nm ljus). För högre känslighet, använd fotonräkningsläge.
  5. För korrekt belysning i överfört ljus med differentialinterferenskontrast (DIC), använd Köhlers inställning av kondensorn och fältstoppet. För förvärv av överfört ljus, använd en 488 nm laser vid 0,7% effekt utan fluorescensdetektor tilldelad. Ställ in en lämplig stråle splitter för laservåglängden.
  6. Hämta två bilder för varje spår (röd fluorescens och DIC). Spåra AuNCs genom sin röda fluorescens; cellgränser bestäms lätt i det överförda ljuset med DIC-bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NIR PL AuNCs utarbetades från Au3 + i närvaro av TA, och sedan thiol-avslutade PEG (MW 2.000) var bunden på AuNC ytan för att få 1 efter arbetsflödet som visas i figur 1. Amidkoppling mellan 1 och 3-(aminopropyl) trifenylfosfonium (TPP) bromid förutsatt 2. Som väntat visade absorptionsspektra (figur 2a) att AuNCs 1 och 2 inte har ett karakteristiskt ytplasmonband och uppvisar breda utsläpp från 550 nm till 850 nm (figur 2b). Efter fastsättning av TPP till ytan av 1, pl ökade kraftigt. Utsläpp från AuNCs var också synligt under UV-ljus (365 nm, figur 2b infälld). Utsläppen från AuNCs är stabilt och utsläppsvåglängden är oberoende av excitationsvåglängd (figur 2c). Utsläppsintensiteten är dock maximal när den är upphetsad av UV-ljus.

2 upptäcktes inuti HeLa celler genom att övervaka PL på ett flöde cytometer. HeLa celler inkuberades i 2 timmar med 2 vid mediekoncentrationer mellan 0,5 mg/ml och 2 mg/ml. FCM data bekräftade upptag av 2 av HeLa celler. NIR-fluorescens (>720 nm) var beroende av både tid (figur 3a) och koncentration av 2 (figur 3b). Maximal intensitet observerades med 780/60 bandpass filter.

AuNCs inom celler avbildades icke-invasivt med hjälp av en standard confocal laser scanning mikroskop. Figur 4 visar den konfiala bilden av HeLa-celler som färgats med 2 (200 μg/ml). Efter 24 h av inkubation ljusa röda fotoluminescens av 2 inne i cellerna observerades.

Figure 1
Figur 1: Syntes av guldnanoklustererna. Arbetsflöde för utarbetandet av 1 och 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Guldnanoklusterernas optiska egenskaper. Normaliserad (a) absorptionsspektra (Infälld: Fotografi av vattenlösningarna 1 och 2 under vitt ljus) och (b) fotoluminescerande spektra av 200 μg/mL vattenlösningar av 1 och 2 (Infälld: fotografi av AuNC-lösningarna under UV-ljus (365 nm)). c)Pl-karta över exciteringsutsläpp av 2. Excitation skiftas av 10 nm kliver. Utsläppstoppet runt 750 nm är mycket stabil (skiftar inte med excitation) och visar en enorm Stokes-förskjutning från excitation. Den mest effektiva excitationen sker runt 340 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Detektering av guldnanokluster inuti HeLa-cellerna genom flödescytometri. Internalisering av 2 i HeLa celler studerades med FCM. Histogrammen visar (a) tid- och (b) koncentrationsberoende upptag av AuNCs av HeLa-celler. I det tidberoende experimentet var HeLa-celler obehandlade (kontroll; 0 h) eller behandlades med 1,28 mg/ml 2 och inkuberade vid 37 °C under de angivna tiderna. Cellerna tvättades sedan med PBS och analyserades av FCM. I det koncentrationsberoende experimentet behandlades HeLa-cellerna (kontroll; 0 mg/ml) eller behandlades med de angivna koncentrationerna av 2 och bearbetades på samma sätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: CLSM-avbildning av HeLa-celler märkta med nanokluster i guld. HeLa-celler inkuberades med 2 (200 μg/ml) i 24 timmar och avbildades med CLSM. (a) Representerar röd fluorescenskanal (650-760 nm); b) Den överförda ljuskanalen (DIC) ochcär överlagring avaochb. Skala bar, 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggs figur 1: Stabilitetsprovning av 1. Photoluminescence spektra av 1 i 1 M NaCl vid 0 h och efter 72 h. Intensiteten normaliserades till maxima. Klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NIR-avgivande AuNCs syntetiserades med hjälp av en bottom-up-strategi där guldprekursorlösningen (HAuCl4)behandlades med lämpliga tiolligander, följt av en minskning av Au3+. Minskning av metalljoner i vattenlösning tenderar att aggregera och resulterar i stora nanopartiklar snarare än ultrasmå NCs21. För att förbereda ultrasmå (≤2 nm) PL AuNCs justerades de syntetiska förhållandena för att förhindra bildandet av stora partiklar och främja bildandet av ultrasmå kluster. Arten av ligander som används för att täcka AuNC ytan spelar också en viktig roll i att påverka strukturen, elektroniska och optiska egenskaper av partiklarna12,22,23,24,25,26,2727,28,29,30. Därför väljer lämpliga ligander som kan stabilisera ultrasmå kluster är nyckeln till att få mycket fluorescerande AuNCs. Thiol-innehållande ligander är de vanligaste stabilisatorerna i syntesen av AuNCs, på grund av den starka kovalenta bindning mellan tioler och guld. En tidigare rapport31 visar att multithiol-baserade ligander är vida överlägsen monothiol ligands i stabilisering av PL AuNCs. Multi-thiol ligander ger förbättrad kolloidal stabilitet till AuNCs på grund av det högre antalet bindande platser mellan ligand och AuNC yta. Bidentate tiool TA användes för syntes av NIR PL AuNCs eftersom det ger mycket bättre kolloidal stabilitet till AuNCs över ett brett spektrum av ogynnsamma förhållanden jämfört med monothiol ligander32. TA ger också vattenfastillväxt av nanopartiklar med diskret storlekskontroll, och viktigast av allt, det erbjuder en karboxylsyra grupp på ytan av nanopartiklar som kan användas för konjugering av biologiskt relevanta molekyler33,34.

TA stabiliserar AuNCs genom elektrostatisk avsky orsakad av deprotonerade karboxylatgrupper på ytan35. I sura lösningar blir dock TA-skyddade AuNCs colloidally instabil på grund av protonation av karboxylatgruppen. Nanopartiklar kan stabiliseras elektrosteriskt, snarare än rent elektrostatiskt. Detta tillvägagångssätt ger kolloidal stabilisering även i närvaro av höga saltkoncentrationer och pH-förändringar, vilket är viktigt för biomedicinska tillämpningar. För att ge elektrosterisk stabilisering till TA-AuNCs, var kluster därefter functionalized med thiol-avslutade PEG (MW 2.000) vid en 5:1 molar förhållandet av TA: PEG, vilket ger 1 (figur 1). För framgångsrik kvarstad på pina som avslutas måste TA-AuNCs renas. Funktionalisering av AuNC med PEG har förbättrat vattenlöslighet vid surt pH och en ökning av kolloidal stabilitet i hög jonisk styrka media. Det är viktigt att fastsättningen av thiol-avslutad PEG utförs vid pH 7.0-7.5. Högre pH skulle resultera i blå förskjutning av utsläpp maxima. Obundna ligander avlägsnades genom centrifugering/filtrering med hjälp av en membranfiltreringsenhet med en molekylvikt cut-off på 3 kDa. De ligander som är förknippade med nanopartiklar upplever betydande linje breddning i 1H NMR jämfört med fria ligander, vilket kan skymma topp uppdrag och integration36. Betydligt bred 1H NMR topp i samband med tiooktic syra och tioolmodifierad polyetylenglykol föreslår ligands är bundna till AuNC ytan och avlägsnande av fria ligander18. Framgångsrik integrering av självlysande AuNCs i en biologisk miljö kräver stabilitet över förhållanden, såsom hög jonisk styrka eftersom biologiska medier är rika på över joner. Stabiliteten i 1 kontrollerades genom att övervaka fotoluminiscensen i 1 M NaCl under en period av 72 h. Ingen signifikant förändring av fotoluminescensegenskaperna i 1 M NaCl indikerar den höga stabiliteten hos AuNCs(tilläggsbild 1). Auncs var stabila i buffrad lösning i mer än ett år utan några tecken på nederbörd (data visas inte).

1 erbjuder karboxylsyra på ytan. Carbodiimide baserade koppling reagenser används ofta för att kovalent länka karboxylsyror till aminer via bildandet av amid bond37. Det vanligaste carbodiimidebaserade kopplingsreagensen i vattenlösning är 1-etyl-3-(dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC-HCl). EDC-HCl har använts för kovalent koppling av TPP-bromid med 1 för att erhålla 2. En av de stora fördelarna med detta protokoll är konjugation av molekyler med en primär amingrupp via amidbindningsbildning utan att kompromissa med fluorescens och kolloidal stabilitet. Högupplöst transmissionselektronmikroskopi (HRTEM) karakterisering visade att AuNCs 1 och 2 båda har en genomsnittlig diameter på 1,15 ± 0,2 nm, vilket indikerar att den funktionella kopplingen inte ändrar kärnstorleken på AuNCs18. Alternativt kan de kostnadsfria carboxylgrupperna aktiveras med EDC och Sulfo-NHS38. Lösningar på 1 och 2 upphetsad med en UV-lampa (365 nm) fluorescerar klarröd (figur 1b, infälld), medan de verkar ljusgul under omgivande belysning ( figur1a, infälld). TPP konjugation ökar AuNC PL på grund av metall-till-ligand laddning överföring (MLCT)18.

Nanopartiklar kan orsaka negativa biologiska effekter som kan begränsa deras tillämpningar inom biologin. För att utvärdera cytotoxicitet av 2 på HeLa celler, XTT (natrium 2, 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-[(fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inre salt) cell livskraft analys utfördes. HeLa celler behandlas med 2 (200 μg/ml) för 48 h visade ingen förlust av cellens livskraft jämfört med kontrollceller. Denna iakttagelse tyder AuNCs är biokompatibla, vilket gör dem lovande kandidater som fluorescerande sonder för tillämpning i biologisk forskning.

När upphetsad med en 405 nm laser, 2 ger ett brett utsläpp med högst runt ~ 750 nm. Den extremt stora Stokes-skiftet (~350 nm) gör att det avgivna ljuset på ett tillförlitligt sätt kan skiljas från den spännande ljuskällan. FCM-filterinställningen måste dock konfigureras på rätt sätt. För 2 är 780/60 nm bandpass filter perfekt på grund av filtrets bredd och det faktum att utsläppet maximalt auncs är i samma region. Det är mycket viktigt att använda breda bandpassfilter i utsläppsområdet för effektiv detektering av PL39,,40,,41,42. Den tids- och dosberoende fluorescenssignalen från celler som behandlats med 2 tyder på att FCM kan användas för att enkelt övervaka cellstudier med AuNCs. När inkubationstiden ökade till 24 timmar var en 40 μg/ml-koncentration på 2 tillräcklig för att detektera aufc genom fluorescens i FCM (data visades inte). För korta inkubationstider (1-2 h) behövs dock högre koncentrationer av AuNCs. Denna metod för att upptäcka AuNCs genom NIR fluorescens signal med en standard flöde cytometer kommer att bidra till att ytterligare bredda de potentiella tillämpningar av AuNCs i biomedicinsk vetenskap. Den metod som beskrivs här skulle kunna användas för att bedöma priser och mekanismer för cellulärt upptag14, samband mellan nanopartikelkoncentration och cellulär toxicitet, eller effekterna av ytkemi på nanoklusterupptag på ett snabbt och kvantitativt sätt med hjälp av FCM.

Cellulärt upptag av 2 av HeLa-celler avbildades av CLSM. Efter 24 h av inkubation ljusa röda utsläpp av 2 upptäcktes vid excitation med 405 nm laser. Men en 405 nm laser exciterar också de inneboende fluorofores inuti cellerna. För att skilja signalen från AuNC från autofluorescens, var utsläppet från AuNC samlas in över 650 nm. De attraktiva egenskaperna, såsom ljusa nära infraröda luminescens, hög kolloidal stabilitet, god biokompatibilitet och ovan resultat visar att AuNCs är lovande bildbehandlingsmedel för biomedicinska och cellulära bildframställning applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vissa delar av de metoder och resultat som tidigare presenterades i artikeln av Pramanik et al.18 Här har dessa metoder omvandlats till praktiska point-by-point-protokoll. Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Alzbeta Magdolenova för hennes hjälp med flödescytometri. Författarna erkänner det ekonomiska stödet från GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi utfördes i laboratoriet för konfuktal- och fluorescensmikroskopi som medfinansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget, projekt nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 och CZ.2.16/3.1.00/21515, och stöds av det tjeckisk-BioImaging stora RI-projektet LM2015062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Bioengineering Utgåva 157 Guld Nanocluster Fotoluminescerande nära infraröd hög kvantavkastning flödescytometri konfokalmikroskopi
Syntes av nära infraröd avgivande guld nanokluster för biologiska tillämpningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta,… More

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter