Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av nær-infrarød emitting gull nanoklynger for biologiske applikasjoner

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 3, 1
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 4First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

En pålitelig og lett reproduserbar metode for fremstilling av funksjonelt, nær-infrarød emitterende fotoluminescerende gull nanoklynger og deres direkte deteksjon inne hela celler ved flyt cytometri og konfokal laser skanning mikroskopi er beskrevet.

Abstract

I løpet av det siste tiåret har fluorescerende gullnanoklynger (AuNCs) vært vitne til økende popularitet i biologiske applikasjoner og enorm innsats har vært viet til deres utvikling. I denne protokollen har en nylig utviklet, facile metode for fremstilling av vannløselig, biokompatibel og kolloidalt stabil nær-infrarød emitterende AuNCs blitt beskrevet i detalj. Denne kjemiske syntesen for romtemperatur, nederen opp gir lett funksjonelt AuNCer avkortet med thioctic acid og tiolmodifisert polyetylenglykol i vandig løsning. Den syntetiske tilnærmingen krever verken organiske løsemidler eller ekstra ligandutveksling eller omfattende kunnskap om syntetisk kjemi for å reprodusere. De resulterende AuNCs tilbyr gratis overflate karboksylsyrer, som kan funksjonaliseres med ulike biologiske molekyler bærer en fri amingruppe uten å påvirke de fotoluminescerende egenskapene til AuNCs negativt. En rask, pålitelig prosedyre for flyt cytometrisk kvantifisering og konfokal mikroskopisk avbildning av AuNC opptak av HeLa celler også blitt beskrevet. På grunn av det store Stokes-skiftet er riktig innstilling av filtre i flow cytometri og konfokal mikroskopi nødvendig for effektiv påvisning av nær-infrarød fotoluminescens av AuNCs.

Introduction

I det siste tiåret har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerende gull nanoklynger (PL AuNCs) dukket opp som lovende sonder for både grunnleggende forskning og praktiske applikasjoner1,2,33,4,5,6,7,8,9,10. Deres mange ønskelige egenskaper inkluderer høy fotostabilitet, tunable utslipp maxima, lang utslippslevetid, store Stokes skift, lav toksisitet, god biokompatibilitet, renal clearance og facile biokonjugering. PL AuNCs kan gi fotoluminescens fra blått til nær-infrarød (NIR) spektral regionen, avhengig av antall atomer i klyngen11 og arten av overflaten ligand12. NIR (650-900 nm) som sender ut AuNCs er spesielt lovende for langsiktig in vitro og in vivo avbildning av celler og vev, da de tilbyr høyt signal-til-støy-forhold på grunn av minimum overlapping med egenautofluorescens, svakere spredning og absorpsjon, og høy vevspenetrasjon av NIR-lys13,14.

I de senere årene har ulike tilnærminger som drar nytte av Au-S kovalente interaksjoner blitt utviklet for å forberede NIR-PL AuNCs avkortet med en rekke thiol-holdige ligander13,,15,16,17. For biomedisinske applikasjoner må AuNCs funksjonaliseres med en biologisk komponent for å lette bindingsinteraksjoner. Dermed er AuNCs med høy kolloidal stabilitet som lett kan funksjoneliseres i vandig løsningsmiddel svært ønskelig. Det overordnede målet med den nåværende protokollen er å beskrive en tidligere rapportert18 forberedelse av AuNCs med en funksjonelt karboksylsyregruppe på overflaten ved å bruke tioctic acid og polyetylenglykol (PEG) i et vandig miljø i detalj og deres bøyning med molekyler som bærer en primær amin etter syre-aminkoblingsmetoden. På grunn av den enkle syntesen og høy reproduserbarhet, kan denne protokollen brukes og tilpasses av forskere fra ikke-kjemi bakgrunn.

En av de viktigste forutsetningene for anvendelser av AuNCs i biomedisinsk forskning er evnen til å observere og måle AuNCs inne i celler. Blant metodene som er tilgjengelige for å overvåke nanopartikkelopptak av celler, flow cytometri (FCM) og konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) tilbyr robuste, høy gjennomstrømning metoder som tillater rask måling av internalisering av fluorescerende nanomaterialer i stort antall celler19. Her har FCM og CLSM-metoden for direkte måling og analyse av PL AuNCs inne i celler, uten behov for ekstra fargestoffer, også blitt presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av nær-infrarød emitterende AuNCs (1)

  1. Tilsett 7,8 mg (37,8 μmol) tioctic acid (TA) og 60 μL av 2 M NaOH til 23,4 ml ultrarent vann (resistivitet 18,2 MΩ.cm ved 25 °C) og rør (minst 1000 rpm) til det oppløses helt (~ 15-20 min). For raskere oppløsning av TA, sonicate blandingen. For syntesen anbefales nylaget TA-løsning.
  2. Tilsett 10,2 μL haucl4·3H2O (470 mg/ml) vandig oppløsning til oppløsningen.
  3. Etter 15 min, tilsett 480 μL NaBH4 (1,9 mg/ml) under kraftig omrøring (minst 1000 o/min) og rør reaksjonsblandingen under samme forhold over natten.
    MERK: Forbered NaBH4-løsningen i iskaldt ultrarent vann og legg til reaksjonsblandingen umiddelbart etter tilberedning.
    MERK: Syntesen av AuNCer er lett skalerbar. Opptil 2 L aunCer ble syntetisert i en enkelt batch, uten noen endring i partiklenes optiske egenskaper.
  4. (Kritisk) Neste dag, rense løsningen ved å bruke tre sykluser av sentrifugering / filtrering ved hjelp av en membran filtrering enhet med en molekylvekt cut-off av 3 kDa. Uten denne renseprosedyren fungerer følgende trinn ikke som det skal.
  5. Tilsett tiol-terminert polyetylenglykol (MW 2000; 15,6 mg; 7,8 μmol) til oppløsningen, juster pH til 7-7,5 og rør blandingen over natten for å oppnå 1. Rense spredningen ved å bruke tre sykluser med sentrifugering/filtrering ved hjelp av en membranfiltreringsenhet med en molekylvektreduksjon på 3 kDa.
    MERK: Justering av pH til 7-7,5 er ekstremt viktig. Høyere pH kan resultere i et blått skifte av utslipp maxima.

2. Bøyning av 3-(aminopropyl)triphenylphosphoniumbromid (TPP) på overflaten av 1

  1. Bland 1 oppløsning (24 ml) tilberedt i forrige trinn og 3-(aminopropyl)triphenylphosphoniumbromid (12 mg, ~ 30 μmol). Juster pH til 4,5 med 1 M HCl.
    MERK: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) bromid salt ble utarbeidet som beskrevet i litteraturen20.
  2. Start reaksjonen ved å legge til et overskudd av N-(3-dimetyl-aminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC· HCl) (60 mg, 312 μmol). PH av løsningen vil øke og bør ikke få lov til å gå utover 6. Overvåk pH-en til reaksjonsblandingen den første timen. Hvis pH øker over 6, reduser den til 4,5-6 ved å legge til 1 M HCl.
  3. Rør reaksjonsblandingen over natten ved romtemperatur.
  4. Rense spredningen ved å bruke tre sykluser med sentrifugering/filtrering ved hjelp av en membranfiltreringsenhet med en molekylvektreduksjon på 3 kDa for å oppnå 2. Fortynn 2 oppnådd her med ultrarent vann til det opprinnelige volumet på 24 ml. Konsentrasjonen av Au i oppløsningen er 200 μg/ml.

3. Cellekultur

  1. Kultur HeLa celler (HPA kultur samling) i Dulbecco modifisert Eagle's Medium supplert med 10% føtal storfe serum i 5% CO2 ved 37 °C.
  2. Split og passasje cellene når de når ~ 80% samløpet. For å minimere oppkjøpet av nye mutanter, bør antall celleforplantninger ikke overstige 30.

4. AuNC internalisering i HeLa-celler

  1. Frø cellene i en 12-brønnplate med en tetthet på 20.000 celler / ml (1 ml / brønn). Målet er å oppnå ~ 50% samløpet etter 48 timer.
  2. Ved 48 timer etter seeding, aspirere kulturmediet og tilsett 400 μL av komplett kulturmedium (for ubehandlede kontroller) eller 500 μg nanopartikler i 400 μL av komplett kultivert medium (for behandlede prøver) til hver brønn. Returner kulturene til en 37 °C inkubator.
    MERK: Tilsetning av høye volumer av AuNC-oppløsning påvirker cellelevedyktigheten negativt. AuNC-løsninger må konsentreres. Dermed 2 oppnådd i trinn 2.4 er konsentrert 100 ganger. 40 ml AuNC var konsentrert til 400 μL. En 25 μL aliquot av denne konsentrerte løsningen ble tilsatt til 400 μL cellekulturmedier for å oppnå ønsket AuNC-konsentrasjon.
  3. Etter 2 timer internisering løsner du cellene etter standard trypsinisering i henhold til produsentens protokoll.
  4. Samle prøvene i polypropylen mikrocentrifuge rør og sentrifuge i 5 min ved 350 x g ved 4 °C.
  5. Forbered følgende FCM buffer: pre-kjølt fosfat bufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7.4) supplert med 2% storfe serum albumin på 4 °C.
  6. Vask pellets med 1 ml FCM buffer og sentrifuge i 5 min ved 350 x g ved 4 °C.
  7. Resuspender pelleten i 500 μL fcm buffer og lagre prøver ved 4 °C før analyse.

5. Analyse av flow cytometri

  1. Filtrer alle prøver ved hjelp av et 5 ml polystyren rundt bunnrør med en cellesilhette.
  2. Før du anskaffer data ved hjelp av instrumentprogramvaren, må du angi cytometerkonfigurasjonen.
  3. Formater alle dot-tomter og histogrammer for 'Oppkjøp'.
  4. Tegne en to-parameter dot plot av fremover scatter-området (FSC-A) og side scatter-området (SSC-A) for å vise distribusjon av celler. Hvis du vil utelate dobbeltretter, oppretter du en to-parameter dot plot av FSC høyde (FSC-H) vs. FSC-A. Hvis du vil overvåke den relative fluorescensintensiteten i prøven, plotter du et enkeltparameterhistogram for det fluorescerende kanalområdet (FL-A). Bruk en lineær skala til å skildre FSC- og SSC-data, og en logaritmisk skala for alle fluorescerende parametere.
  5. Oppfør ubehandlet prøve (uten nanopartikler) med lav strømningshastighet for å minimere hendelser med sammenfall (hvis det er tillatt av instrumentet). Under oppkjøpet justerer du fotomultiplikatorrøret (PMT)-spenningene for å få den ubehandlede populasjonen på skala på FSC vs SSC-plottet. Juster om nødvendig PMT-spenninger for FL-kanalen for å plassere den ufargede populasjonen på venstre hjørne av histogrammet.
  6. Velg den spesifikke "gate-fanen" i programvaren, og tegn en passende port rundt den ønskede populasjonen. Celler inne i porten vil flytte til neste kontrollpunkt.
  7. Ta opp 10 000 hendelser per eksempel.
  8. Ta opp alle eksempler under de samme instrumentinnstillingene.
  9. Bruk et passende program til å analysere flytcytometridataene.
    MERK: Noen programmer kan kreve tilpasset oppsett av filtre. For filterutveksling følger du alltid produsentens anbefalinger i brukerhåndboken.
    MERK: Eksperimentet kan lagres og lastes inn på nytt for å bevare instrumentinnstillingene og gatingstrategien.
    MERK: En sidespredningshøyde (SSC-H) vs. sidescatterområde (SSC-A) plott kan også brukes til dobbeltekskludering. Denne typen gating kan være mer følsom, da FSC-detektoren vanligvis ikke er en PMT.

6. Internalisering av 2 i HeLa-celler for konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM)

  1. Frø cellene på en 4-kammers glassbunn 35 mm tallerken med en tetthet på 250 000 celler/ml (0,5 ml/kammer). Oppbevar kammeret i en 37 °C inkubator med 5% CO2 atmosfære. Målet er å oppnå ~ 50% samløpet etter 24 timer.
  2. Ved 24 timer etter såing tilsett du 100 μg 2 (eller 10 μL fra lageroppløsningen på 10 mg/ml) til hvert parabolkammer som inneholder 0,5 ml medium med cellene (for behandlede prøver).
  3. Returner retten til inkubatoren. La cellene internalisere AuNCene i 24 timer før du bruker dem for CLSM.
  4. Etter internaliseringsperioden, kast mediet og vask cellene med forvarmet friskt medium i 5 min. Gjenta vasketrinnet igjen. Fyll deretter hvert kammer med 800 μL friskt medium.

7. CLSM Imaging av levende Hela-celler merket med 2

  1. For mikroskopisk bildebehandling bruker du objektivobjektivobjektivet 63x (n = 1.518) (NA = 1.4) i et konfokalmikroskop med Plan-Apochromat.
  2. Monter fatet på mikroskopets inverterte stadium med kammeret varmet til 37 °C og leveres med fuktet 5% CO2 atmosfære.
  3. For å oppdage internalisert AuNC, bruk et 405 nm lasersett med 2 % strøm med en passende strålesplitter. Still inn rekkevidden av deteksjonsbølgelengder mellom 650 og 760 nm.
  4. Sett oppløsningen på bildet til 2048 x 2048 piksler. I innstillingen for anskaffelseshastighet, sikt er det for en pikselbotid rundt 4 μs. Kjøp bildet med 2x snitt (linjemodus, gjennomsnittsmetode gjennomsnitt). Sett pinhole til 1 luftig enhet (for 405 nm lys). For høyere følsomhet, bruk fotontellingsmodus.
  5. For riktig belysning i overført lys med differensialinterferenskontrast (DIC), bruk Köhlers innstilling av kondensatoren og feltstoppet. For oppkjøp av overført lys, bruk en 488 nm laser på 0,7% strøm uten fluorescensdetektor tildelt. Angi en passende strålesplitter for laserbølgelengden.
  6. Få to bilder for hvert spor (rød fluorescens og DIC). Spor AuNCs ved deres røde fluorescens; cellegrenser bestemmes lett i det overførte lyset med DIC-bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NIR PL AuNCs ble utarbeidet fra Au3+ i nærvær av TA, og deretter var tiol-avsluttet PEG (MW 2000) bundet på AuNC-overflaten for å oppnå 1 etter arbeidsflyten vist i figur 1. Amidic kobling mellom 1 og 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromide gitt 2. Som forventet indikerte absorpsjonsspektra (Figur 2a) at AuNCs 1 og 2 ikke har et karakteristisk overflateplasmonbånd og viser bred utslipp fra 550 nm til 850 nm (Figur 2b). Etter vedlegg av TPP til overflaten av 1, økte PL sterkt. Utslipp fra AuNCs var også synlig under UV-lys (365 nm, Figur 2b innfelt). Utslippet fra AuNCs er stabilt og utslipp bølgelengde er uavhengig av eksitasjon bølgelengde (Figur 2c). Utslippsintensiteten er imidlertid maksimal når den er spent med UV-lys.

2 ble oppdaget inne i HeLa-celler ved å overvåke PL på et strømningscytometer. HeLa-celler ble inkubert i 2 timer med 2 ved mediekonsentrasjoner mellom 0,5 mg/ml og 2 mg/ml. FCM data bekreftet opptak av 2 av HeLa celler. NIR fluorescens (>720 nm) var avhengig av begge gangene (figur 3a)og konsentrasjon på 2 (Figur 3b). Maksimal intensitet ble observert med 780/60 bandpass-filteret.

AuNCer i celler ble avbildet ikke-invasivt ved hjelp av et standard konfokallaserskanningsmikroskop. Figur 4 viser det konfokale bildet av HeLa-celler farget med 2 (200 μg/ml). Etter 24 timer inkubasjon ble lys rød fotoluminescens på 2 inne i cellene observert.

Figure 1
Figur 1: Syntese av gullnanoklyngene. Arbeidsflyt for utarbeidelse av 1 og 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Optiske egenskaper av gull nanoklynger. Normalisert (a) absorpsjon spektra (Innfelt: Fotografi av vandige løsninger av 1 og 2 under hvitt lys) og (b) fotoluminescerende spektra på 200 μg / ml vandige løsninger på 1 og 2 (Innfelt: fotografi av AuNC-løsningene under UV-lys (365 nm)). (c) Utsitingpl kart over 2. Eksitasjon er forskjøvet med 10 nm trinn. Utslippstoppen rundt 750 nm er veldig stabil (skifter ikke med eksitasjon) og viser et enormt Stokes-skifte fra eksitasjon. Den mest effektive eksitasjon skjer rundt 340 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Påvisning av gullnanoklynger inne i HeLa-cellene ved å flyte cytometri. Internalisering av 2 i HeLa celler ble studert ved hjelp av FCM. Histogrammene viser (a) tid- og (b) konsentrasjonsavhengig opptak av AuNCs av HeLa-celler. I det tidsavhengige eksperimentet ble HeLa-celler ubehandlet (kontroll; 0 h) eller behandlet med 1,28 mg/ml 2 og inkubert ved 37 °C for de angitte tidene. Cellene ble deretter vasket med PBS og analysert av FCM. I det konsentrasjonsavhengige eksperimentet ble HeLa-celler ubehandlet (kontroll; 0 mg/ml) eller behandlet med de angitte konsentrasjonene på 2 og behandlet på samme måte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: CLSM-avbildning av HeLa-celler merket med gullnanoklyngene. HeLa celler ble inkubert med 2 (200 μg / ml) i 24 timer og avbildet med CLSM. (a) Representerer rød fluorescens kanal (650-760 nm); (b) den overførte lyskanalen (DIC) og (c) er overlegg av (a) og (b). Skala bar, 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Stabilitetstest på 1. Photoluminescence spektra av 1 i 1 M NaCl på 0 t og etter 72 timer. Intensiteten ble normalisert til maxima. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NIR-emitterende AuNCer ble syntetisert ved hjelp av en nedenfra-opp-tilnærming der gullforløperløsningen (HAuCl4) ble behandlet med egnede tiolligander, etterfulgt av reduksjon av Au3+. Reduksjon av metallioner i vandig løsning har en tendens til å aggregere og resulterer i store nanopartikler i stedet for ultrasmå NCer21. For å forberede ultrasmå (≤2 nm) PL AuNCs, ble de syntetiske forholdene justert for å forhindre dannelse av store partikler og fremme dannelse av ultrasmå klynger. Arten av ligands brukes til å cap AuNC overflaten spiller også en viktig rolle i å påvirke strukturen, elektroniske og optiske egenskaper av partiklene12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Derfor er det å velge passende ligander som er i stand til å stabilisere ultrasmå klynger nøkkelen til å oppnå svært fluorescerende AuNCer. Thiol-holdige ligander er de mest brukte stabilisatorene i syntese av AuNCs, på grunn av den sterke kovalente bindingen mellom tioler og gull. En tidligere rapport31 indikerer at multithiol-baserte ligander er langt bedre enn monothiol ligands i stabilisering av PL AuNCs. Multi-thiol ligands gir forbedret kolloidal stabilitet til AuNCs på grunn av det høyere antall bindingssteder mellom ligand og AuNC overflate. Bidentate thiol TA ble brukt til syntese av NIR PL AuNCs fordi det gir mye bedre kolloidal stabilitet til AuNCs over et bredt spekter av ugunstige forhold sammenlignet med monothiol ligander32. TA gir også vandig fasevekst av nanopartikler med diskret størrelseskontroll, og viktigst av alt tilbyr den en karboksylsyregruppe på overflaten av nanopartiklene som kan brukes til bøyning av biologisk relevante molekyler33,34.

TA stabiliserer AuNCs ved elektrostatisk frastøting forårsaket av deprotonerte karboksylategrupper på overflaten35. Men i sure løsninger blir TA-beskyttede AuNCer kolaiblet ustabile på grunn av protonasjon av karboksylategruppen. Nanopartikler kan stabiliseres elektririsk, snarere enn rent elektrostatisk. Denne tilnærmingen gir kolloidal stabilisering selv i nærvær av høye saltkonsentrasjoner og pH-endringer, noe som er viktig for biomedisinske applikasjoner. For å overdra elektrosteriske stabilisering til TA-AuNCs ble klyngene senere funksjonalisert med tiol-terminert PEG (MW 2000) med et 5:1 molar-forhold på TA:PEG, noe som gir 1 (Figur 1). For vellykket feste av tiol-avsluttet PEG må TA-AuNCer renses. Funksjonalisering av AuNC med PEG har forbedret den vandige løseligheten ved sur pH og en økning i kolloidal stabilitet i høy ionisk styrkemedia. Det er viktig at det utføres tiltredsing av tiol-terminert PEG på pH 7,0-7,5. Høyere pH ville resultere i blått skifte av utslippmaxima. Ubundne ligander ble fjernet ved sentrifugering/filtrering ved hjelp av en membranfiltreringsenhet med en molekylvektreduksjon på 3 kDa. Ligandene som er forbundet med nanopartikler opplever betydelig linjeutvidelse i 1H NMR sammenlignet med frie ligander, som kan skjule toppoppdrag og integrasjon36. Betydelig bred 1H NMR topp forbundet med thioctic syre og tiol-modifisert polyetylen glykol antyder ligander er bundet til AuNC overflaten og fjerning av frie ligander18. Vellykket integrering av selvlysende AuNCs i et biologisk miljø krever stabilitet over forhold, for eksempel høy ionisk styrke fordi biologiske medier er rike på overskudd av ioner. Stabiliteten på 1 ble verifisert ved å overvåke fotoluminescensen i 1 M NaCl over en periode på 72 timer. Ingen signifikant endring i fotoluminescensegenskaper i 1 M NaCl indikerer høy stabilitet av AuNCs (Supplerende figur 1). AuNCs var stabile i bufret løsning i mer enn et år uten tegn til nedbør (data ikke vist).

1 tilbyr karboksylsyre på overflaten. Karbodiimidbaserte koplingsreagenser er mye brukt til å koble karboksylsyrer til aminer via dannelse av amidbinding37. Den mest brukte karbodiimidbasert koblingsreagens i vandig løsning er 1-etyl-3-(dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC∙HCl). EDC∙HCl har blitt brukt til kovalent kobling av TPP-bromid med 1 for å oppnå 2. En av de viktigste fordelene med denne protokollen er bøyning av molekyler med en primær amingruppe via amidbindingsdannelse uten å gå på akkord med fluorescens og kolloidal stabilitet. Høyoppløselig transmisjonelektronmikroskopi (HRTEM) karakterisering viste at AuNCs 1 og 2 begge har en gjennomsnittlig diameter på 1,15 ± 0,2 nm, noe som indikerer at funksjonskoblingen ikke endrer kjernestørrelsen på AuNCs18. Alternativt kan de gratis karboksylgruppene aktiveres ved hjelp av EDC og Sulfo-NHS38. Løsninger på 1 og 2 som er spente med en UV-lampe (365 nm) fluorescerer lys rød (Figur 1b, innfelt), mens de ser lyse gule ut under omgivelsesbelysning (Figur 1a, innfelt). TPP-konjugering øker AuNC PL på grunn av metall-til-ligand ladeoverføring (MLCT)18.

Nanopartikler kan forårsake negative biologiske effekter som kan begrense deres anvendelser i biologi. For å evaluere cytotoksisiteten til 2 på HeLa-celler, ble XTT (natrium 2, 3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-[(fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium indre salt) celleviabilitetsanalyse ble utført. HeLa-celler behandlet med 2 (200 μg/ml) i 48 timer viste ingen tap av cellelevedyktighet sammenlignet med kontrollceller. Denne observasjonen antyder auncs er biokompatible, noe som gjør dem lovende kandidater som fluorescerende sonder for anvendelse i biologisk forskning.

Når du er spent med en 405 nm laser, 2 gir en bred utslipp med en maksimal rundt ~ 750 nm. Den ekstremt store Stokes skift (~ 350 nm) gjør at det utsendte lyset kan skilles pålitelig fra den spennende lyskilden; FCM-filterinnstillingen må imidlertid konfigureres på riktig måte. For 2 er 780/60 nm bandpass-filteret ideelt på grunn av filterets bredehet og det faktum at utslippsmaksimumet på AuNCs er i samme region. Det er svært viktig å bruke brede bandpassfiltre i utslippsområdet maxima for effektiv påvisning av PL39,40,41,42. Det tids- og doseavhengige fluorescenssignalet fra celler behandlet med 2 tyder på at FCM kan brukes til å overvåke cellestudier på en praktisk måte ved hjelp av AuNCer. Når inkubasjonstiden ble økt til 24 timer, var en 40 μg/ml konsentrasjon på 2 tilstrekkelig til å oppdage AuNCer ved fluorescens i FCM (data ikke vist). For korte inkubasjonstider (1-2 timer) er det imidlertid nødvendig med høyere konsentrasjoner av AuNCer. Denne metoden for å oppdage AuNCs ved NIR fluorescenssignal med et standard flytcytometer vil bidra til å ytterligere utvide de potensielle anvendelsene av AuNCs i biomedisinsk vitenskap. Tilnærmingen som er beskrevet her, kan brukes til å vurdere hastigheter og mekanismer for mobilopptak14, relasjoner mellom nanopartikkelkonsentrasjon og cellulær toksisitet, eller effekter av overflatekjemi på nanoklyngeopptak på en rask og kvantitativ måte ved hjelp av FCM.

Cellulært opptak av 2 av HeLa-celler ble avbildet av CLSM. Etter 24 timer inkubasjon ble lyse røde utslipp av 2 oppdaget ved eksitasjon med 405 nm laser. Men en 405 nm laser også interesserer iboende fluoroforer inne i cellene. For å skille signalet fra AuNC fra autofluorescens, ble utslippet fra AuNC samlet inn over 650 nm. De attraktive egenskapene, som lys nær-infrarød luminescens, høy kolloidal stabilitet, god biokompatibilitet og høyere resultater viser at AuNCs er lovende bildemidler for biomedisinske og cellulære bildebehandlingsapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Noen deler av metodene og resultatene ble tidligere presentert i artikkelen av Pramanik et al.18 Her har disse metodene blitt konvertert til praktiske punkt-for-punkt-protokoller. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige til Alzbeta Magdolenova for hennes hjelp med flow cytometri. Forfatterne anerkjenner den økonomiske støtten fra GACR-prosjektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi ble utført i Laboratoriet for confocal og fluorescens Mikroskopi co-finansiert av European Regional Development Fund og statsbudsjettet i Tsjekkia, prosjekter nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 og CZ.2.16/3.1.00/21515, og støttet av czech-BioImaging store RI-prosjektet LM2015062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Bioengineering Utgave 157 Gull Nanocluster Fotoluminescerende Nær-Infrarød Høy Quantum Yield Flow Cytometri Confocal Mikroskopi
Syntese av nær-infrarød emitting gull nanoklynger for biologiske applikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta,… More

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter