Summary
Beschrieben wird eine zuverlässige und leicht reproduzierbare Methode zur Herstellung funktionalisierbarer, nahininiert emittierender photolumineszierender Gold-Nanocluster und deren direkter Detektion in HeLa-Zellen durch Durchflusszytometrie und konfokale Laserscanmikroskopie.
Abstract
In den letzten zehn Jahren haben fluoreszierende Gold-Nanocluster (AuNCs) eine wachsende Popularität in biologischen Anwendungen erlebt, und enorme Anstrengungen wurden für ihre Entwicklung unternommen. In diesem Protokoll wurde eine kürzlich entwickelte, einfache Methode zur Herstellung von wasserlöslichen, biokompatiblen und kolloidstabilen AuNCs mit Nahinfraroteund im Detail beschrieben. Diese chemische Synthese mit Raumtemperatur und Bottom-up-Gehalt bietet leicht funktionsiierbare AuNCs, die mit Thioctsäure und Thiol-modifiziertem Polyethylenglykol in wässriger Lösung einzuschließen sind. Der synthetische Ansatz erfordert weder organische Lösungsmittel oder zusätzlichen Ligandenaustausch noch umfassende Kenntnisse der synthetischen Chemie, um sich zu vermehren. Die resultierenden AuNCs bieten freie Oberflächencarbonsäuren, die mit verschiedenen biologischen Molekülen funktionalisiert werden können, die eine freie Amingruppe tragen, ohne die photolumineszierenden Eigenschaften der AuNCs zu beeinträchtigen. Ein schnelles, zuverlässiges Verfahren zur zytometrischen Durchflussquantifizierung und konfokale mikroskopische Bildgebung der AuNC-Aufnahme durch HeLa-Zellen wurde ebenfalls beschrieben. Aufgrund der großen Stokes-Verschiebung ist eine korrekte Einstellung von Filtern in der Durchflusszytometrie und konfokalen Mikroskopie für die effiziente Detektion der Nahinfrarot-Photolumineszenz von AuNCs erforderlich.
Introduction
In den letzten zehn Jahren haben sich ultrakleine photolumineszierende Gold-Nanocluster (PL AuNCs) als vielversprechende Sonden sowohl für die Grundlagenforschung als auch für praktische Anwendungen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Zu ihren vielen wünschenswerten Eigenschaften gehören hohe Photostabilität, abstimmbare Emissionsmaxima, lange Emissionslebensdauern, große Stokes-Verschiebungen, geringe Toxizität, gute Biokompatibilität, Renalclearance und einfache Biokonjugation. PL AuNCs können Photolumineszenz von der blauen bis zur Nahinfrarot -Spektralregion (NIR) bereitstellen, abhängig von der Anzahl der Atome innerhalb des Clusters11 und der Art des Oberflächenliganden12. NIR (650-900 nm) emittierende AuNCs sind besonders vielversprechend für die langfristige In-vitro- und In-vivo-Bildgebung von Zellen und Geweben, da sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund minimaler Überlappung mit intrinsischer Autofluoreszenz, schwächerer Streuung und Absorption und hoher Gewebedurchdringung von NIR-Licht13,14bieten.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die die kovalenten Wechselwirkungen von Au-S nutzen, um NIR-PL AuNCs vorzubereiten, die mit einer Vielzahl von thiolhaltigen Liganden13,15,16,17gekrönt sind. Für biomedizinische Anwendungen müssen AuNCs mit einer biologischen Komponente funktionalisiert werden, um Bindungswechselwirkungen zu erleichtern. Daher sind AuNCs mit hoher kolloidaler Stabilität, die in wässrigem Lösungsmittel leicht funktionalisierbar sind, sehr wünschenswert. Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls besteht darin, eine zuvor gemeldete18 Zubereitung von AuNCs mit einer funktionalisierbaren Carbonsäuregruppe an der Oberfläche zu beschreiben, indem Thioctic acid und Polyethylenglykol (PEG) in einer wässrigen Umgebung im Detail eingesetzt werden und ihre Konjugation mit Molekülen, die ein primäres Amin nach dem Säure-Amin-Kopplungsverfahren tragen. Aufgrund der einfachen Synthese und hohen Reproduzierbarkeit kann dieses Protokoll von Forschern aus nicht-chemischen Hintergründen verwendet und angepasst werden.
Eine der wichtigsten Voraussetzungen für Anwendungen von AuNCs in der biomedizinischen Forschung ist die Fähigkeit, AuNCs in Zellen zu beobachten und zu messen. Unter den verfügbaren Methoden zur Überwachung der Nanopartikelaufnahme durch Zellen bieten durchFlusszytometrie (FCM) und konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) robuste, hochdurchsatzige Methoden, die schnelle Messungen der Internalisierung fluoreszierender Nanomaterialien in einer großen Anzahl von Zellen ermöglichen19. Hier wurden auch FCM- und CLSM-Verfahren zur direkten Messung und Analyse von PL AuNCs in Zellen vorgestellt, ohne dass zusätzliche Farbstoffe erforderlich sind.
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Protocol
1. Vorbereitung von Nahinfrarot emittierenden AuNCs (1)
- Fügen Sie 7,8 mg (37,8 mol) Thioctic Acid (TA) und 60 l von 2 M NaOH auf 23,4 ml Reinstwasser (Widerstand 18,2 M x ,cm bei 25 °C) und rühren (mindestens 1.000 Rpm), bis es sich vollständig auflöst (ca. 15-20 min). Für eine schnellere Auflösung von TA, beschallen Sie die Mischung. Für die Synthese wird eine frisch zubereitete TA-Lösung empfohlen.
- Fügen Sie der Lösung 10,2 l HAuCl43H2O (470 mg/ml) wässriger Lösung hinzu.
- Nach 15 min 480 l NaBH4 (1,9 mg/ml) unter kräftigem Rühren (mindestens 1.000 U/min) hinzufügen und das Reaktionsgemisch unter den gleichen Bedingungen über Nacht rühren.
HINWEIS: Bereiten Sie die NaBH4-Lösung in eiskaltem Reinstwasser frisch vor und fügen Sie das Reaktionsgemisch unmittelbar nach der Zubereitung hinzu.
HINWEIS: Die Synthese von AuNCs ist einfach skalierbar. Bis zu 2 L AuNCs wurden in einer einzigen Charge synthetisiert, ohne dass sich die optischen Eigenschaften der Partikel änderten. - (Kritisch) Am nächsten Tag reinigen Sie die Lösung, indem Sie drei Zyklen Zentrifugation/Filtration mit einem Membranfiltrationsgerät mit einem Molekulargewichtsabgrenzung von 3 kDa anwenden. Ohne dieses Reinigungsverfahren funktioniert der folgende Schritt nicht richtig.
- Thiol-terminiertes Polyethylenglykol (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 mg Mol) in die Lösung geben, den pH-Wert auf 7-7,5 einstellen und das Gemisch über Nacht umrühren, um 1zu erhalten. Reinigen Sie die Dispersion durch drei Zyklen Zentrifugation/Filtration mit einer Membranfiltrationsvorrichtung mit einem Molekulargewichtsabgrenzung von 3 kDa.
HINWEIS: Die Einstellung des pH-Werts auf 7-7,5 ist äußerst wichtig. Ein höherer pH-Wert kann zu einer blauen Verschiebung der Emissionsmaxima führen.
2. Konjugation von 3-(Aminopropyl)triphenylphosphoniumbromid (TPP) auf der Oberfläche von 1
- Mischen Sie die im vorherigen Schritt hergestellte 1 Lösung (24 ml) und 3-(Aminopropyl)triphenylphosphoniumbromid (12 mg, 30 x mol). Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 mit 1 M HCl ein.
HINWEIS: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) Bromidsalz wurde wie in der Literatur beschrieben20hergestellt. - Beginnen Sie die Reaktion, indem Sie einen Überschuss von N-(3-Dimethyl-Aminopropyl)- N-Ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC-N HCl) (60 mg, 312 Mol). Der pH-Wert der Lösung wird zunehmen und sollte nicht über 6 hinausgehen. Überwachen Sie den pH-Wert des Reaktionsgemisches für die erste Stunde. Wenn der pH-Wert über 6 steigt, reduzieren Sie ihn auf 4,5–6, indem Sie 1 M HCl hinzufügen.
- Rühren Sie das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur.
- Reinigen Sie die Dispersion durch drei Zyklen Zentrifugation/Filtration mit einer Membranfiltrationsvorrichtung mit einem Molekulargewichtsabgrenzung von 3 kDa, um 2zu erhalten. Verdünnen Sie hier 2 mit Reinstwasser auf das Anfangsvolumen von 24 ml. Die Konzentration von Au in der Lösung beträgt 200 g/ml.
3. Zellkultur
- Culture HeLa Zellen (HPA Kultursammlung) in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum in 5%CO2 bei 37 °C.
- Teilen und durchdurchlassen Sie die Zellen, wenn sie den Zusammenfluss von 80 % erreichen. Um die Anschaffung neuer Mutanten zu minimieren, sollte die Anzahl der Zellausbreitungen 30 nicht überschreiten.
4. AuNC-Internalisierung in HeLa-Zellen
- Samen der Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen/ml (1 ml/well). Das Ziel ist es, nach 48 h einen Zusammenfluss von 50 % zu erreichen.
- Bei 48 h Nachsaat das Kulturmedium ansaugen und jedem Brunnen 400 l komplettes Kulturmedium (für unbehandelte Kontrollen) oder 500 g Nanopartikel in 400 l komplettem Kulturmedium (für behandelte Proben) hinzufügen. Bringen Sie die Kulturen auf einen 37 °C-Inkubator zurück.
HINWEIS: Die Zugabe großer Volumina der AuNC-Lösung beeinträchtigt die Zelllebensfähigkeit. AuNC-Lösungen müssen konzentriert werden. So wird 2 in Schritt 2.4 erhalten 100 mal konzentriert. 40 ml AuNC wurde auf 400 l konzentriert. Ein Aliquot dieser konzentrierten Lösung wurde 400 L Zellkulturmedien zugesetzt, um die gewünschte AuNC-Konzentration zu erhalten. - Nach 2 h Internalisierung die Zellen durch Standard-Trypsinisierung nach dem Herstellerprotokoll lösen.
- Sammeln Sie die Proben in Polypropylen-Mikrozentrifugenrohren und Zentrifuge für 5 min bei 350 x g bei 4 °C.
- Bereiten Sie folgenden FCM-Puffer vor: vorgekühlte Phosphatgepufferte Saline (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7,4) ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin bei 4 °C.
- Die Pellets mit 1 ml FCM-Puffer und Zentrifuge 5 min bei 350 x g bei 4 °C waschen.
- Setzen Sie das Pellet in 500 l FCM-Puffer wieder aus und lagern Sie Proben vor der Analyse bei 4 °C.
5. Durchflusszytometrie-Analyse
- Filtern Sie alle Proben mit einem 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr mit einer Zell-Siebkappe.
- Geben Sie vor dem Erfassen von Daten mithilfe der Gerätesoftware die Zytometerkonfiguration an.
- Formatieren Sie alle Punktplots und Histogramme für 'Akquisitionen'.
- Zeichnen Sie ein Zwei-Parameter-Punktdiagramm des vorwärts gerichteten Streubereichs (FSC-A) und des seitenstreuenden Bereichs (SSC-A), um die Verteilung der Zellen anzuzeigen. Um Doublets auszuschließen, erstellen Sie ein Zwei-Parameter-Punktdiagramm fSC-Höhe (FSC-H) vs. FSC-A. Um die relative Fluoreszenzintensität in der Probe zu überwachen, zeichnen Sie ein Histogramm mit einem Parameter für den fluoreszierenden Kanalbereich (FL-A) auf. Verwenden Sie eine lineare Skala, um FSC- und SSC-Daten darzustellen, und eine logarithmische Skala für alle fluoreszierenden Parameter.
- Erfassen Sie unbehandelte Proben (ohne Nanopartikel) bei geringer Durchflussrate, um lagegleiche Ereignisse zu minimieren (sofern das Instrument dies zulässt). Passen Sie während der Erfassung die Photomultiplier-Rohr-Spannungen (PMT) an, um die unbehandelte Population auf dem FSC-vs-SSC-Plot maßstabsgetreu zu erhalten. Passen Sie bei Bedarf die PMT-Spannungen für den FL-Kanal an, um die ungefärbte Population in der linken Ecke des Histogramms zu platzieren.
- Wählen Sie die spezifische "Gate-Registerkarte" in der Software und zeichnen Sie ein entsprechendes Tor um die gewünschte Bevölkerung. Zellen innerhalb des Gates werden zum nächsten Checkpoint verschoben.
- Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Beispiel auf.
- Zeichnen Sie alle Samples unter den gleichen Instrumenteneinstellungen auf.
- Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Flow-Zytometrie-Daten zu analysieren.
HINWEIS: Einige Anwendungen erfordern möglicherweise eine angepasste Einrichtung von Filtern. Für den Filteraustausch folgen Sie immer den Empfehlungen der Fertigung im Benutzerhandbuch.
HINWEIS: Das Experiment kann gespeichert und neu geladen werden, um die Geräteeinstellungen und die Gating-Strategie beizubehalten.
HINWEIS: Ein Seitenstreuhöhe (SSC-H) vs. Side Scatter Area (SSC-A) Plot kann auch für Doublet-Ausschluss verwendet werden. Diese Art von Gating kann empfindlicher sein, da der FSC-Detektor normalerweise kein PMT ist.
6. Internalisierung von 2 in HeLa-Zellen für konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM)
- Säen Sie die Zellen auf eine 4-Kammer-Glasboden-35-mm-Schale mit einer Dichte von 250.000 Zellen/ml (0,5 ml/Kammer). Bewahren Sie die Kammer in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2-Atmosphäre auf. Das Ziel ist es, nach 24 h einen Zusammenfluss von 50 % zu erreichen.
- Bei 24 h Nachsaat 100 g von 2 (oder 10 l aus der Stammlösung von 10 mg/ml) in jede Schalenkammer geben, die 0,5 ml Medium mit den Zellen (für behandelte Proben) enthält.
- Bringen Sie das Gericht an den Inkubator zurück. Lassen Sie die Zellen die AuNCs für 24 h verinnerlichen, bevor Sie sie für CLSM verwenden.
- Nach der Internalisierungsphase das Medium entsorgen und die Zellen mit vorgewärmten frischen Medien für 5 min waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Dann füllen Sie jede Kammer mit 800 l frischem Medium.
7. CLSM Imaging von lebenden Hela-Zellen, die mit 2
- Für die mikroskopische Bildgebung verwenden Sie 63x Öl (n = 1.518) Objektivlinse (NA = 1.4) in einem konfokalen Mikroskop mit Plan-Apochromat.
- Montieren Sie die Schale auf dem Mikroskop invertiert Bühne mit der Kammer auf 37 °C erwärmt und mit befeuchteter 5%CO2-Atmosphäre versorgt.
- Um internalisierte AuNC zu erkennen, verwenden Sie einen 405 nm Lasersatz mit 2% Leistung mit einem geeigneten Strahlsplitter. Stellen Sie den Bereich der Erfassungswellenlängen zwischen 650 und 760 nm ein.
- Legen Sie die Auflösung des Bildes auf 2048 x 2048 Pixel fest. Ziel enden Sie in der Einstellung der Erfassungsgeschwindigkeit für eine Pixelverweilzeit um 4 s. Erfassen Sie das Bild mit 2x Mittelung (Linienmodus, Mittelmittelwert). Stellen Sie das Loch auf 1 Luftige Einheit (für 405 nm Licht). Für eine höhere Empfindlichkeit verwenden Sie den Photonenzählmodus.
- Für die korrekte Beleuchtung im Durchlicht mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) verwenden Sie Köhlers Einstellung des Kondensators und des Feldstopps. Für die Erfassung von Durchlicht verwenden Sie einen 488 nm Laser mit 0,7% Leistung, ohne dass ein Fluoreszenzdetektor zugeordnet ist. Stellen Sie einen geeigneten Strahlteiler für die Laserwellenlänge ein.
- Erfassen Sie zwei Bilder für jede Spur (rote Fluoreszenz und DIC). Verfolgen Sie AuNCs anhand ihrer roten Fluoreszenz; Zellgrenzen lassen sich im übertragenen Licht mit DIC-Bildern leicht bestimmen.
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Representative Results
NIR PL AuNCs wurden von Au3+ in Gegenwart von TA vorbereitet, und dann wurde thiol-terminiertes PEG (MW 2.000) auf der AuNC-Oberfläche gebunden, um 1 nach dem in Abbildung 1dargestellten Workflow zu erhalten. Amidische Kopplung zwischen 1 und 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) Bromid zur Verfügung gestellt 2. Wie erwartet zeigten Absorptionsspektren (Abbildung 2a) an, dass die AuNCs 1 und 2 kein charakteristisches Oberflächen-Plasmonband aufweisen und eine breite Emission von 550 nm bis 850 nm aufweisen (Abbildung 2b). Nach der Befestigung von TPP an der Oberfläche von 1erhöhte sich die PL stark. Die Emission von AuNCs war auch unter UV-Licht sichtbar (365 nm, Abbildung 2b Einset). Die Emission von AuNCs ist stabil und die Emissionswellenlänge ist unabhängig von der Anregungswellenlänge (Abbildung 2c). Die Emissionsintensität ist jedoch maximal, wenn sie mit UV-Licht angeregt wird.
2 wurde in HeLa-Zellen durch Überwachung der PL auf einem Durchflusszytometer nachgewiesen. HeLa-Zellen wurden für 2 Stunden mit 2 in Medienkonzentrationen zwischen 0,5 mg/ml und 2 mg/ml inkubiert. FCM-Daten bestätigten die Aufnahme von 2 durch HeLa-Zellen. Die NIR-Fluoreszenz (>720 nm) war sowohl von der Zeit (Abbildung 3a) als auch von der Konzentration von 2 (Abbildung 3b) abhängig. Maximale Intensität wurde mit dem Bandpassfilter 780/60 beobachtet.
AuNCs in Zellen wurden nicht-invasiv mit einem Standard-Konfokallaser-Scanning-Mikroskop abgebildet. Abbildung 4 zeigt das konfokale Bild von HeLa-Zellen, die mit 2 (200 g/ml) gefärbt sind. Nach 24 h Inkubation wurde eine leuchtend rote Photolumineszenz von 2 in den Zellen beobachtet.
Abbildung 1: Synthese der Gold-Nanocluster. Workflow der Vorbereitung von 1 und 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optische Eigenschaften der Gold-Nanocluster. Normalisierte (a) Absorptionsspektren (Inset: Fotografie der wässrigen Lösungen von 1 und 2 unter weißem Licht) und (b) photolumineszierende Spektren von 200 g/mL wässrigen Lösungen von 1 und 2 (Inset: Fotografie der AuNC-Lösungen unter UV-Licht (365 nm)). (c) Erregungs-Emission PL-Karte von 2. Die Erregung wird um 10 nm Stufen verschoben. Die Emissionsspitze um 750 nm ist sehr stabil (verschiebt sich nicht mit Anregung) und zeigt eine enorme Stokes-Verschiebung von der Anregung. Die effizienteste Anregung tritt um 340 nm auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachweis von Gold-Nanoclustern in den HeLa-Zellen durch Durchflusszytometrie. Die Internalisierung von 2 in HeLa-Zellen wurde mit FCM untersucht. Die Histogramme zeigen (a) zeit- und (b) konzentrationsabhängige Aufnahme von AuNCs durch HeLa-Zellen. Im zeitabhängigen Experiment wurden HeLa-Zellen unbehandelt (Kontrolle; 0 h) oder mit 2 1,28 mg/ml2 behandelt und bei 37 °C für die angegebenen Zeiten inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und von FCM analysiert. Im konzentrationsabhängigen Experiment wurden HeLa-Zellen unbehandelt (Kontrolle; 0 mg/ml) oder mit den angegebenen Konzentrationen von 2 behandelt und auf die gleiche Weise verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CLSM-Bildgebung von HeLa-Zellen, die mit den Gold-Nanoclustern gekennzeichnet sind. HeLa-Zellen wurden mit 2 (200 g/ml) für 24 h inkubiert und mit CLSMabgebildet. (a) Stellt roten Fluoreszenzkanal (650-760 nm) dar; b) Durchseimlichtkanal (DIC) und (c) ist Überlagerung von (a) und (b). Maßstabsleiste, 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Stabilitätstest von 1. Photolumineszenzspektren von 1 in 1 M NaCl bei 0 h und nach 72 h. Die Intensität wurde auf die Maxima normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
NIR-emittierende AuNCs wurden mit einem Bottom-up-Ansatz synthetisiert, bei dem die Goldvorläuferlösung (HAuCl4) mit geeigneten Thiolligaden behandelt wurde, gefolgt von einer Reduktion von Au3+. Die Reduktion von Metallionen in wässriger Lösung neigt dazu, sich zu aggregieren und führt eher zu großen Nanopartikeln als zu ultrakleinen NCs21. Um ultrakleine PL-AuNCs zu erstellen, wurden die synthetischen Bedingungen angepasst, um die Bildung großer Partikel zu verhindern und die Bildung von ultrakleinen Clustern zu fördern. Die Art der Liganden verwendet, um die AuNC-Oberfläche zu kappen spielt auch eine wichtige Rolle bei der Beeinflussung der Struktur, elektronische und optische Eigenschaften der Partikel12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Daher ist die Wahl geeigneter Liganden, die in der Lage sind, ultrakleine Cluster zu stabilisieren, der Schlüssel, um hochfluoreszierende AuNCs zu erhalten. Thiolhaltige Liganden sind die am häufigsten verwendeten Stabilisatoren bei der Synthese von AuNCs, aufgrund der starken kovalenten Bindung zwischen Thiolen und Gold. Ein früherer Bericht31 zeigt, dass Multithiol-basierte Liganden bei der Stabilisierung von PL AuNCs Monothiol-Liganden weit überlegen sind. Multithiol Liganden bieten AuNCs eine verbesserte kolloidale Stabilität aufgrund der höheren Anzahl von Bindungsstellen zwischen Liganden und AuNC-Oberfläche. Bidentate Thiol TA wurde für die Synthese von NIR PL AuNCs verwendet, weil es eine viel verbesserte kolloidale Stabilität für AuNCs über eine breite Palette von widrigen Bedingungen im Vergleich zu Monothiol Liganden32bietet. TA bietet auch wässrige Phasenwachstum von Nanopartikeln mit diskreter Größenkontrolle, und vor allem bietet es eine Carbonsäuregruppe auf der Oberfläche der Nanopartikel, die für die Konjugation biologisch relevanter Moleküle33,34verwendet werden kann.
TA stabilisiert AuNCs durch elektrostatische Abstoßung durch deprotonierte Carboxylatgruppen auf der Oberfläche35. Bei sauren Lösungen werden TA-geschützte AuNCs jedoch durch die Protonierung der Carboxylatgruppe kolloidal instabil. Nanopartikel können elektrosterisch und nicht rein elektrostatisch stabilisiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht eine kolloidale Stabilisierung auch bei hohen Salzkonzentrationen und pH-Veränderungen, was für biomedizinische Anwendungen wichtig ist. Um den TA-AuNCs eine elektrosterische Stabilisierung zu verleihen, wurden die Cluster anschließend mit thiol-terminiertem PEG (MW 2.000) mit einem Molverhältnis von TA:PEG von 5:1 funktionalisiert, was 1 ergibt (Abbildung 1). Für eine erfolgreiche Befestigung von thiol-beendeten PEG müssen TA-AuNCs gereinigt werden. Die Funktionalisierung von AuNC mit PEG hat die wässrige Löslichkeit bei saurem pH-Wert und eine Erhöhung der kolloidalen Stabilität in Medien mit hoher Ionenstärke verbessert. Es ist wichtig, dass die Befestigung von thiol-terminiertem PEG bei pH 7.0-7.5 durchgeführt wird. Ein höherer pH-Wert würde zu einer blauen Verschiebung der Emissionsmaxima führen. Ungebundene Liganden wurden durch Zentrifugieren/Filtrieren mit einem Membranfiltrationsgerät mit einem Molekulargewichtsabstand von 3 kDa entfernt. Die Liganden, die mit Nanopartikeln in Verbindung gebracht werden, erleben eine signifikante Linienverbreiterung in 1H NMR im Vergleich zu freien Liganden, die Spitzenzuweisungen und Integration verschleiern können36. Deutlich breiter 1H NMR-Peak, der mit Thioctsäure und Thiol-modifiziertem Polyethylenglykol assoziiert ist, deutet darauf hin, dass die Liganden an die AuNC-Oberfläche gebunden sind und freie Liganden entfernt werden18. Die erfolgreiche Integration von lumineszierenden AuNCs in eine biologische Umgebung erfordert Stabilität über Bedingungen, wie z. B. hohe Ionenstärke, da biologische Medien reich an Ionen sind. Die Stabilität von 1 wurde durch die Überwachung der Photolumineszenz in 1 M NaCl über einen Zeitraum von 72 h überprüft. Keine signifikante Veränderung der Photolumineszenzeigenschaften in 1 M NaCl deutet auf eine hohe Stabilität der AuNCs hin (Zusatzabbildung 1). AuNCs waren mehr als ein Jahr lang in gepufferter Lösung stabil, ohne dass es Anzeichen für Niederschläge gab (Daten wurden nicht angezeigt).
1 bietet Carbonsäure auf der Oberfläche. Carbodiimid-basierte Kupplungsreagenzien werden häufig verwendet, um Carbonsäuren kovalent mit Aminen über die Bildung von Amidbindung37zu verbinden. Das am häufigsten verwendete Carbodiimid-basierte Kupplungsreagenz in wässriger Lösung ist 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC-HCl). EDC-HCl wurde zur kovalenten Kopplung von TPP-Bromid mit 1 verwendet, um 2zu erhalten. Einer der Hauptvorteile dieses Protokolls ist die Konjugation von Molekülen mit einer primären Amingruppe über die Bildung von Amidbindung, ohne die Fluoreszenz und kolloidale Stabilität zu beeinträchtigen. Die Charakterisierung der Hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) zeigte, dass die AuNCs 1 und 2 beide einen durchschnittlichen Durchmesser von 1,15 x 0,2 nm haben, was darauf hinweist, dass die Funktionskopplung die Kerngröße der AuNCs18nicht ändert. Alternativ können die kostenlosen Carboxylgruppen mit EDC und Sulfo-NHS38aktiviert werden. Lösungen von 1 und 2 aufgeregt mit einer UV-Lampe (365 nm) Fluoreszenz hellrot (Abbildung 1b, inset), während sie hellgelb unter Umgebungsbeleuchtung erscheinen (Abbildung 1a, Inset). TPP-Konjugation erhöht die AuNC PL durch Metall-Zu-Ligand-Ladungstransfer (MLCT)18.
Nanopartikel können schädliche biologische Wirkungen verursachen, die ihre Anwendungen in der Biologie einschränken können. Zur Bewertung der Zytotoxizität von 2 auf HeLa-Zellen wurde XTT (Natrium 2, 3-bis (2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-Tetrazolium-Innensalz) zelllebensfähigkeitswert durchgeführt. HeLa-Zellen, die mit 2 (200 g/ml) für 48 h behandelt wurden, zeigten keinen Verlust der Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollzellen. Diese Beobachtung legt nahe, dass AuNCs biokompatibel sind, was sie zu vielversprechenden Kandidaten als fluoreszierende Sonden für die Anwendung in der biologischen Forschung macht.
Bei Einem 405 nm Laser bietet 2 eine breite Emission mit einer maximalen Emission von ca. 750 nm. Die extrem große Stokes-Verschiebung (ca. 350 nm) ermöglicht es, das emittierte Licht zuverlässig von der spannenden Lichtquelle zu unterscheiden; Die FCM-Filtereinstellung muss jedoch entsprechend konfiguriert werden. Für 2 ist der 780/60 nm Bandpassfilter ideal, da sich der Filter breiter verbreitert und das Emissionsmaximum von AuNCs in der gleichen Region liegt. Es ist sehr wichtig, Breitbandfilter im Bereich der Emissionsmaxima für die effiziente Detektion von PL39,40,41,42zu verwenden. Das zeit- und dosisabhängige Fluoreszenzsignal von Zellen, die mit 2 behandelt werden, legt nahe, dass FCM verwendet werden kann, um Zellstudien bequem mit AuNCs zu überwachen. Wenn die Inkubationszeit auf 24 h erhöht wurde, reichte eine Konzentration von 40 g/ml von 2 aus, um AuNCs durch Fluoreszenz in FCM zu erkennen (Daten nicht dargestellt). Für kurze Inkubationszeiten (1-2 h) sind jedoch höhere Konzentrationen von AuNCs erforderlich. Diese Methode zur Detektion von AuNCs durch NIR-Fluoreszenzsignal mit einem Standard-Durchflusszytometer wird dazu beitragen, die potenziellen Anwendungen von AuNCs in der biomedizinischen Wissenschaft weiter zu erweitern. Der hier beschriebene Ansatz könnte verwendet werden, um Raten und Mechanismen der zellulären Aufnahme14, Zusammenhänge zwischen Nanopartikelkonzentration und zellulärer Toxizität oder Auswirkungen der Oberflächenchemie auf die Nanocluster-Aufnahme auf schnelle und quantitative Weise mit FCM zu bewerten.
Die zelluläre Aufnahme von 2 durch HeLa-Zellen wurde von CLSM abgebildet. Nach 24 h Inkubation wurde bei Anregung mit 405 nm Laser eine leuchtend rote Emission von 2 erkannt. Ein 405 nm Laser regt aber auch die intrinsischen Fluorophore in den Zellen an. Um das Signal von AuNC von der Autofluoreszenz zu unterscheiden, wurde die Emission von AuNC über 650 nm gesammelt. Die attraktiven Eigenschaften wie helle Nahinfrarot-Lumineszenz, hohe kolloidale Stabilität, gute Biokompatibilität und die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die AuNCs vielversprechende Bildgebungsmittel für biomedizinische und zelluläre Bildgebungsanwendungen sind.
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Disclosures
Einige Teile der Methoden und Ergebnisse wurden zuvor in dem Artikel von Pramanik et al.18 vorgestellt. Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren sind Alzbeta Magdolenova für ihre Hilfe bei der Durchflusszytometrie dankbar. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das GACR-Projekt Nr. 18-12533S. Mikroskopie wurde im Labor für Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, das vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und dem Staatshaushalt der Tschechischen Republik kofinanziert wird. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 und CZ.2.16/3.1.00/21515 und unterstützt durch das tschechisch-bioImaging große RI-Projekt LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
