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Bioengineering

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 3, 1
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 4First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

유세포 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사법에 의한 기능적, 근적외선 발광 광발광 금 나노클러스터 및 HeLa 세포 내부의 직접 검출을 위한 신뢰할 수 있고 쉽게 재현 가능한 방법이 설명되어 있습니다.

Abstract

지난 10년 동안 형광금 나노클러스터(AuNCs)는 생물학적 응용 분야에서 인기가 높아지고 있으며 개발에 많은 노력을 기울였습니다. 이 프로토콜에서는 수용성, 생체 적합성 및 콜로이드적으로 안정된 근적외선 방출 AuNCs의 제조를 위한 최근에 개발된, 허구 적인 방법이 상세히 기술되었다. 이 실온, 상향식 화학 합성은 수성 용액에 티옥산 및 티올 변형 폴리에틸렌 글리콜로 덮인 쉽게 기능성 AuNCs를 제공합니다. 합성 접근법은 유기 용매 나 추가 리간드 교환이나 합성 화학에 대한 광범위한 지식을 필요로하지 않습니다. 생성된 AuNCs는 무료 표면 카르복실산을 제공하며, 이는 AuNCs의 광발광 특성에 악영향을 미치지 않으면서 자유 아민 그룹을 베어링하는 다양한 생물학적 분자로 기능화될 수 있습니다. HeLa 세포에 의한 AuNC 섭취량의 유세포측정 정량화 및 공초점 현미경 이미징을 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 절차도 기술되었다. 큰 스토크스 시프트로 인해 AuNCs의 근적외선 광발광을 효율적으로 검출하려면 유세포 분석 및 공초점 현미경 검사법에서 필터를 적절히 설정해야 합니다.

Introduction

지난 10 년 동안, 초소형 (≤ 2 nm) 광 발광 금 나노 클러스터 (PL AuNCs)는 기초 연구 및 실용적인 응용 프로그램 모두 유망한 프로브로 등장했다1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,99,10.8 그들의 많은 바람직한 특성은 높은 광 안정성, 조정 가능한 방출 최대, 긴 방출 수명, 큰 스토크스 교대, 낮은 독성, 좋은 생체 적합성, 신장 클리어런스 및 허구 생체 융합을 포함한다. PL AuNCs는클러스터(11) 내의 원자수 및 표면리간드(12)의성질에 따라 청색에서 근적외선(NIR) 스펙트럼 영역으로 광발광을 제공할 수 있다. NIR (650-900 nm) 방출 AuNCs는 특히 내재 자가 형광, 약한 산란 및 흡수 및 NIR 빛의 높은 조직 침투와 최소 중첩으로 인해 높은 신호 대 잡음 비를 제공하기 때문에 세포 및 조직의 장기 생체 외 및 생체 내 이미징에 특히 유망하다13,,14.

최근에는, Au-S 공유 상호작용을 활용하는 다양한 접근법이 개발되어 NIR-PL AuNCs가 다양한 티올 함유 리간드13,,15,,16,,17로덮여 있다. 생체 의학 응용의 경우, AuNCs는 결합 상호 작용을 용이하게하기 위해 생물학적 구성 요소로 기능화되어야합니다. 따라서, 수성 용매에서 쉽게 기능화할 수 있는 높은 콜로이드 안정성을 가진 AuNCs는 매우 바람직하다. 현재 프로토콜의 전반적인 목표는 수성 환경에서 티옥산 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 구체적으로 적용하고 산-아민 커플링 방법에 따른 1차 아민을 가진 분자와의 활용을 통해 표면에 기능성 카르복실산 그룹을 가진 AuNCs의18가지 제제를 상세히 설명하는 것이다. 합성의 용이성과 높은 재현성 때문에, 이 프로토콜은 비화학 배경의 연구자들이 사용하고 적응할 수 있습니다.

생물 의학 연구에서 AuNCs의 응용을 위한 주요 필수 조건 중 하나는 세포 내부의 AuNCs를 관찰하고 측정하는 능력입니다. 세포에 의한 나노입자 섭취를 모니터링할 수 있는 방법 중, 유세포 분석법(FCM) 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 많은 수의세포에서형광 나노물질의 내재화를 빠르게 측정할 수 있는 강력하고 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기서, 추가염료없이 세포 내부의 PL AuNCs의 직접 측정 및 분석을 위한 FCM 및 CLSM 방법도 제시되었다.

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Protocol

1. 근적외선 방출 AuNCs 의 준비 (1)

  1. 7.8 mg (37.8 μmol) 티옥산 (TA) 및 2 M NaOH의 60 μL을 23.4 mL의 초순수 (25 °C에서 저항 18.2 MΩ.cm)를 추가하고 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다 (적어도 1,000 rpm). TA의 빠른 용해를 위해 혼합물을 초음파 처리하십시오. 합성을 위해, 갓 준비된 TA 용액이 권장됩니다.
  2. 용액에 HAuCl4·3H2O(470 mg/mL)의 10.2 μL을 추가합니다.
  3. 15분 후, 격렬한 교반(적어도4 1,000 rpm)에 NaBH 4(1.9 mg/mL)의 480 μL을 넣고 같은 조건에서 밤새 저어줍니다.
    참고: NaBH4 용액을 얼음으로 차가운 초순수로 신선하게 준비하고 준비 직후 반응 혼합물에 첨가하십시오.
    참고: AuNCs의 합성은 쉽게 확장 할 수 있습니다. 최대 2L의 AuNCs는 입자의 광학 적 특성에 어떠한 변화도 없이 단일 배치로 합성되었습니다.
  4. (임계) 다음 날, 3 kDa의 분자량 차단을 가진 멤브레인 여과 장치를 사용하여 원심 분리 / 여과의 3 주기를 적용하여 용액을 정화하십시오. 이 정제 절차가 없으면 다음 단계가 제대로 작동하지 않습니다.
  5. 티올 종단 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2,000; 15.6 mg; 7.8 μmol)을 용액에 넣고 pH를 7-7.5로 조정하고 혼합물을 밤새 저어 1을얻습니다. 3 kDa의 분자량 차단을 가진 멤브레인 여과 장치를 사용하여 원심 분리 / 여과의 3 주기를 적용하여 분산을 정화합니다.
    참고: pH를 7-7.5로 조정하는 것은 매우 중요합니다. pH가 높을수록 방출 최대값의 청색 이동이 발생할 수 있습니다.

2. 1의 표면에 3-(아미노프로필) 트리페닐포스포니움 브로마이드(TPP)의 컨쥬게이션

  1. 이전 1 단계에서 제조된 1용액(24 mL)과 3-(아미노프로필)트리페닐포스포늄 브로마이드(12 mg, ~30 μmol)를 혼합한다. 1 M HCl로 pH를 4.5로 조정합니다.
    참고: 3-(아미노프로필)트리페닐포스포니움(TPP) 브로마이드 염은 문헌20에기재된 바와 같이 제조되었다.
  2. N-(3-디메틸-아미노프로필)-N′-에틸카르보디미드N염산염(EDC·)을 추가하여 반응을 시작하십시오. HCl) (60 mg, 312 μmol). 용액의 pH가 증가하고 6을 넘어서는 것을 허용해서는 안됩니다. 반응 혼합물의 pH를 1시간 동안 모니터링한다. pH가 6 이상으로 증가하면 1 M HCl을 추가하여 4.5-6으로 줄입니다.
  3. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 저어줍니다.
  4. 3 kDa의 분자량 차단을 가진 멤브레인 여과 장치를 사용하여 원심분리/여과의 3사이클을 적용하여 분산을 정화하여 2. 24 mL의 초기 부피에 초순수로 여기에서 얻은 희석 2. 용액내의 Au 농도는 200 μg/mL이다.

3. 세포 배양

  1. 덜베코의 변형된 이글 배지에서 배양 헬라 세포(HPA 배양 컬렉션)는 37°C에서 5%CO2에서 10% 태아 소 혈청을 보충하였다.
  2. 그들은 ~ 80 % 합류에 도달 할 때 분할 및 통과 세포. 새로운 돌연변이의 취득을 최소화하기 위해 세포 전파 수가 30을 초과해서는 안됩니다.

4. HeLa 세포로의 AuNC 내화

  1. 20,000 셀 / mL (1 mL / well)의 밀도로 12 웰 플레이트에서 세포를 시드하십시오. 목표는 48 시간 후에 ~ 50 % 합류를 달성하는 것입니다.
  2. 48 h 포스트 시드에서, 배양 배지를 흡인하고 완전한 배양 배지(미처리 대조군) 또는 500 μg의 나노입자를 각각 의 배양 배지(처리된 시료용)에 각각 잘 첨가한다. 배양을 37°C 인큐베이터로 되돌려 보라고 한다.
    참고: 많은 양의 AuNC 용액을 첨가하는 것은 세포 생존에 부정적인 영향을 미칩니다. AuNC 솔루션은 집중되어야 합니다. 따라서 2.4단계에서 얻어진 2는 100회 농축된다. 40 mL AuNC를 400 μL로 농축하였습니다. 이 농축 용액의 25 μL aliquot를 원하는 AuNC 농도를 얻기 위해 400 μL 세포 배양 배지에 첨가하였다.
  3. 내원화 의 2 시간 후, 제조 업체의 프로토콜에 따라 표준 트립시네화에 의해 세포를 분리.
  4. 4 °C에서 350 x g에서 5 분 동안 폴리 프로필렌 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리기에서 샘플을 수집합니다.
  5. 다음 FCM 완충제를 준비: 미리 냉각된 인산완충식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mMNa2HPO4,1.47 mM NaH2PO4,pH 7.4)를 4°C에서 2% 소 혈청 알부민으로 보충하였다.
  6. 4 °C에서 350 x g에서 5 분 동안 FCM 완충제 및 원심 분리기의 1 mL로 펠릿을 세척하십시오.
  7. 500 μL의 FCM 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 분석 전에 4°C에서 샘플을 저장합니다.

5. 유세포 분석

  1. 셀 스트레이너 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브를 사용하여 모든 샘플을 필터링합니다.
  2. 계측기 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하기 전에 세포계 구성을 지정합니다.
  3. '획득'에 대한 모든 점 플롯과 히스토그램의 서식을 지정합니다.
  4. 전방향 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)의 2매개 변수 점 플롯을 플롯하여 셀 분포를 표시합니다. doublet를 제외하려면 FSC 높이(FSC-H) 대 FSC-A의 2매개변수 도트 플롯을 작성합니다. 샘플의 상대 형광 강도를 모니터링하려면 형광 채널 영역(FL-A)에 대한 단일 매개변수 히스토그램을 플롯합니다. 선형 눈금을 사용하여 FSC 및 SSC 데이터와 모든 형광 매개변수에 대한 로그 축척을 묘사합니다.
  5. 낮은 유량으로 처리되지 않은 시료(나노입자 제외)를 획득하여 일치하는 이벤트를 최소화합니다(계측기에서 허용하는 경우). 수집 하는 동안, 광 증식 튜브 (PMT) 전압을 조정 하 고 FSC 대 SSC 플롯에 규모에 처리 되지 않은 인구를 얻을. 필요한 경우 FL 채널의 PMT 전압을 조정하여 히스토그램의 왼쪽 모서리에 얼룩지지 않은 모집단을 배치합니다.
  6. 소프트웨어에서 특정 '게이트 탭'을 선택하고 원하는 모집단 주위에 적절한 게이트를 그립니다. 게이트 내부의 셀은 다음 검사점으로 이동합니다.
  7. 샘플당 10,000개의 이벤트를 기록합니다.
  8. 동일한 계측기 설정으로 모든 샘플을 기록합니다.
  9. 적절한 프로그램을 사용하여 유세포 분석 데이터를 분석합니다.
    참고: 일부 응용 프로그램에는 필터를 사용자 지정해야 할 수 있습니다. 필터 교환의 경우 항상 사용 설명서의 제조 권장 사항을 따르십시오.
    참고: 실험을 저장하고 다시 로드하여 계측기 설정 및 게이팅 전략을 유지할 수 있습니다.
    주: 측면 산란 높이(SSC-H) 대 측면 분산 영역(SSC-A) 플롯을 이중 제외에도 사용할 수 있습니다. 이러한 유형의 게이팅은 FSC 검출기가 일반적으로 PMT가 아니기 때문에 더 민감할 수 있습니다.

6. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법 (CLSM)을 위해 HeLa 세포에 2의 내화

  1. 250,000 셀 / mL (0.5 mL / 챔버)의 밀도에서 4 챔버 유리 바닥 35mm 접시에 세포를 씨앗. 챔버를 5%CO2 분위기로 37°C 인큐베이터에 보관합니다. 목표는 24 시간 후에 ~ 50 % 합류를 달성하는 것입니다.
  2. 24 시간 후 시딩에서 세포가있는 배지 0.5 mL을 포함하는 각 접시 챔버에 2 00 μg (또는 10 mg / mL의 스톡 용액에서 10 μL)을 추가하십시오 (처리 된 샘플용).
  3. 접시를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 세포가 CLSM에 사용하기 전에 24 시간 동안 AuNCs를 내면화시키십시오.
  4. 내재화 기간 이후에 배지를 버리고 미리 데운 신선한 배지로 세포를 5 분 동안 씻습니다. 그런 다음 각 챔버에 800 μL의 신선한 배지를 채웁니다.

7. 2로 표지된 살아있는 헬라 세포의 CLSM 화상 진찰

  1. 현미경 이미징의 경우, Plan-Apochromat를 사용하여 공초점 현미경에서 63x 오일(n = 1.518) 대물 렌즈(NA = 1.4)를 사용하십시오.
  2. 챔버를 37°C로 따뜻하게 하고 가습5%CO2 대기로 공급하여 현미경 반전 스테이지상에 접시를 장착한다.
  3. 내부화된 AuNC를 감지하려면 적절한 빔 스플리터와 함께 2% 전력으로 설정된 405nm 레이저를 사용하십시오. 650에서 760 nm 사이의 검출 파장의 범위를 설정합니다.
  4. 이미지 해상도를 2048 x 2048 픽셀로 설정합니다. 수집 속도 설정에서 픽셀 거주 시간을 약 4μs로 설정합니다. 평균 2배(선 모드, 평균 화 법 평균)로 이미지를 획득합니다. 핀홀을 에어리 유닛 1개(405nm 라이트의 경우)로 설정합니다. 감도가 높은 경우 광자 계수 모드를 사용합니다.
  5. 차동 간섭 콘트라스트(DIC)가 있는 송신 광원의 올바른 조명을 위해 쾰러의 콘덴서 설정 및 필드 스톱을 사용합니다. 투과된 빛을 획득하기 위해 형광 검출기가 할당되지 않은 경우 0.7%의 전력으로 488nm 레이저를 사용하십시오. 레이저 파장에 적합한 빔 스플리터를 설정합니다.
  6. 각 트랙(빨간색 형광 및 DIC)에 대해 두 개의 이미지를 수집합니다. 그들의 적색 형광에 의해 AuNCs를 추적; 셀 경계는 DIC 사진으로 전송된 빛에서 쉽게 결정됩니다.

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Representative Results

NIR PL AuNC는 TA의 존재 속에서 Au3+에서 제조된 후, 티올-종단 PEG(MW 2,000)를 AuNC 표면에 결합하여 도 1에도시된 워크플로우다음에 1 1을 얻었다. 아미딕 커플링 1 및 3-(아미노프로필) 트리페닐포스포늄(TPP) 브로마이드 제공 2. 예상대로, 흡수스펙트럼(도 2a)은AuNCs 1 및 2가 특징적인 표면 플라스몬 밴드를 갖지 않고 550 nm에서 850 nm까지의 광범위한 방출을 나타내고 있음을 나타내고 있다(도2b). 1의표면에 TPP를 부착 한 후 PL이 강하게 증가했습니다. AuNCs로부터의 방출은 또한 UV 광(365 nm, 도 2b 인세트)에서볼 수 있었다. AuNCs에서 방출되는 방출은 안정적이며 방출 파장이 여기 파장과 무관합니다(그림2c). 그러나 UV 광선으로 흥분하면 방출 강도가 최대입니다.

도 2는 유세포계에서 PL을 모니터링하여 HeLa 세포 내부에서 검출되었다. HeLa 세포는 0.5 mg/mL 및 2 mg/mL 사이의 매질 농도에서 2시간 동안 배양하였다. FCM 데이터는 HeLa 세포에 의해 2의 섭취량을 확인하였다. NIR 형광(>720 nm)은 두시간(도 3a)과 2의 농도(도 3b)에의존하였다. 최대 강도는 780/60 대역 통과 필터로 관찰되었다.

세포 내의 AuNCs는 표준 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 비침습적으로 이미지화되었다. 도 4는 2(200 μg/mL)로 염색된 HeLa 세포의 공초점 이미지를 나타낸다. 2 24시간 배양 후 밝은 적색 광발광을 세포 내부 2개 내부에 관찰하였다.

Figure 1
그림 1: 금 나노클러스터의 합성. 1 및 2의준비 워크플로우 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 금 나노클러스터의 광학적 특성. 정규화(a)흡수 스펙트럼 (인세트 : 백색광 하에서 1 및 2의 수성 용액의 사진) 및(b)광 발광 스펙트럼 200 μg / mL 수성 용액 1 및 2 (인세트 : UV 광 하에서 AuNC 용액의 사진 (365 nm)). (c) 2의흥분 방출 PL지도. 여기는 10 nm 단계로 이동됩니다. 약 750 nm의 방출 피크는 매우 안정적이며 (여기로 이동하지 않음) 여기에서 거대한 스토크스 이동을 보여줍니다. 가장 효율적인 여기 약 발생 340 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 유세포에 의한 HeLa 세포 내부의 금 나노클러스터 검출. 2를 헬라 세포내로 내침입하여 FCM을 사용하여 연구하였다. 히스토그램은 HeLa 세포에 의한 AuNCs의 농도 의존적섭취량(a)시간 및(b)농도 의존적 을 나타낸다. 시간 의존적 실험에서, HeLa 세포는 처리되지 않았거나(대조군; 0시간) 또는 2 1.28 mg/mL2로 처리하고 표시된 시간 동안 37°C에서 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 FCM에 의해 분석하였다. 농도 의존적 실험에서, HeLa 세포는 처리되지 않았거나(대조군; 0 mg/mL) 또는 지시된 농도로 처리된 2및 동일한 방식으로 처리하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 금 나노클러스터로 표지된 HeLa 세포의 CLSM 이미징. HeLa 세포는 24 시간 동안 2 (200 μg / mL)로 배양하고 CLSM으로이미지하였다. (a)적색 형광 채널 (650-760 nm)을 나타낸다; (b) 전송된 광 채널(DIC) 및(c)는(a)및(b)의오버레이이다. 배율 표시줄, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 안정성 테스트 1. 광발광 스펙트럼은 0시간 및 72시간 이후의 1 M NaCl에서 1의 광발광 스펙트럼이다. 강도는 최대로 정규화되었다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

NIR 방출 AuNCs는 금 전구체 용액(HAuCl4)을적합한 티올 리간드로 처리한 후Au3+의감소를 초래하는 상향식 접근법을 사용하여 합성하였다. 수성 용액에서 금속 이온의 감소는 응집되는 경향이 있으며 초소형 NCs21보다는큰 나노 입자를 초래합니다. 초소형(≤2 nm) PL AuNCs를 준비하기 위해 합성 조건을 조정하여 큰 입자의 형성을 방지하고 초소형 클러스터의 형성을 촉진했습니다. AuNC 표면을 캡하는 데 사용되는 리간드의 성질은 또한입자(12, 22,22,23,,24,,,25,,26,,27,28,,29,,30)의구조, 전자 및 광학 특성에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 한다., 따라서 초소형 클러스터를 안정화할 수 있는 적합한 리간드를 선택하는 것이 형광성이 높은 AuNCs를 얻는 열쇠입니다. 티올 함유 리간드(ligands)는 티올과 금 사이의 강력한 공유 결합으로 인해 AuNCs 합성에서 가장 일반적으로 사용되는 안정제입니다. 이전보고서(31)는 다중티올 계 리간드가 PL AuNCs의 안정화에서 단티올 리간드보다 훨씬 우수하다는 것을 나타낸다. 다중 티올 리간드는 리간드 표면과 AuNC 표면 사이의 결합 부위 수가 많기 때문에 AuNC에 향상된 콜로이드 안정성을 제공합니다. 비덴테이트 티올 TA는 단티올리간드(32)에비해 광범위한 이상 불리한 조건에 걸쳐 AuNCs에 훨씬 향상된 콜로이드 안정성을 제공하기 때문에 NIR PL AuNCs의 합성에 사용되었다. TA는 또한 이산 크기 제어를 통해 나노입자의 수성상 성장을 제공하며, 가장 중요한 것은, 생물학적으로 관련된분자(33,,34)의활용될 수 있는 나노입자의 표면에 카르복실산군을 제공한다.

TA는표면(35)에있는 탈프로톤화된 카복실레이트 기로 인한 정전기 반발에 의해 AuNCs를 안정화한다. 그러나 산성 용액에서 TA 보호 AuNCs는 카르복실레이트 그룹의 프로토네이션으로 인해 콜로이드가 불안정해집니다. 나노 입자는 순전히 정전기가 아닌 전기적으로 안정화 될 수 있습니다. 이 접근법은 생체 의학 응용에 중요한 높은 염 농도 및 pH 변화의 존재에도 콜로이드 안정화를 제공합니다. TA-AuNCs에 전기 안정화를 부여하기 위해, 클러스터는 TA:PEG의 5:1 몰 비에서 티올-종단 PEG(MW 2,000)로 이후에 기능화되었고, 1을 산출하였다(도1). 티올 종단 PEG의 성공적인 부착을 위해서는 TA-AuNCs를 정제해야 합니다. PEG를 가진 AuNC의 기능화는 산성 pH에서 수성 용해도를 향상시키고 높은 이온 강도 매체에서 콜로이드 안정성의 증가를 향상시켰습니다. 티올 종단 PEG의 부착은 pH 7.0-7.5에서 수행되는 것이 중요합니다. pH가 높을수록 방출 최대값의 청색 시프트가 발생합니다. 언바운드 리간드는 3 kDa의 분자량 차단을 가진 멤브레인 여과 장치를 사용하여 원심분리/여과에 의해 제거되었다. 나노 입자와 연관되는 리간드들은 피크 할당 및통합(36)을모호하게 할 수 있는 자유 리간드에 비해 1HNMR에서 상당한 라인 확대를 경험한다. 티오산 및 티올 변형 폴리에틸렌 글리콜과 관련된 현저하게 넓은 1HNMR 피크는 리간드가 AuNC 표면에 결합되어 자유 리간드(18)를 제거한다는 것을 시사한다.18 생물학적 환경에 발광 AuNCs를 성공적으로 통합하려면 생물학적 매질이 이온을 초과하여 풍부하기 때문에 높은 이온 강도와 같은 조건에 대한 안정성이 필요합니다. 1의 안정성은 72시간의 기간에 걸쳐 1 M NaCl에서 광발광을 모니터링하여 검증되었다. 1 M NaCl에서 광발광 특성의 유의한 변화는 AuNCs의 높은 안정성을나타낸다(보충 도 1). AuNCs는 강수량에 대한 증거없이 1 년 이상 버퍼링 된 솔루션에서 안정적이었다 (데이터는 표시되지 않음).

1은 표면에 카르복실산을 제공합니다. Carbodiimide 계 커플링 시약은 아미드결합(37)의형성을 통해 카르복실산을 아민에 공유하여 연결하는 데 널리 사용된다. 수성 용액에서 가장 일반적으로 사용되는 카보디미드 계 커플링 시약은 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(EDC∙HCl)이다. EDC∙HCl은 TPP 브로마이드의 공유 커플링에 1 1을 획득하여 2를획득하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 형광과 콜로이드 안정성을 손상시키지 않으면서 아미드 결합 형성을 통해 1 차 아민 그룹과 분자의 활용입니다. 고분해능 투과 전자 현미경(HRTEM) 특성은 AuNCs 1 및 2 둘 다 평균 직경이 1.15±0.2 nm인 것으로 나타났으며, 이는 기능적 커플링이 AuNCs18의코어 크기를 변화시키지 않음을 나타낸다. 또는, 무료 카르복실 그룹은 EDC와 설포-NHS38을사용하여 활성화될 수 있다. UV 램프 (365 nm)와 함께 흥분 1 및 2의 솔루션은 밝은 빨간색(그림 1b,인세트)동안 그들은 주변 조명(그림 1a,inset)에서밝은 노란색으로 나타납니다. TPP 컨쥬게이션은 AuNC PL을 증가시키기 때문에 금속-리간드 전하 전달(MLCT)18.

나노 입자는 생물학에서 자신의 응용 프로그램을 제한 할 수있는 불리한 생물학적 효과를 일으킬 수 있습니다. HeLa 세포에 대한 2의 세포 독성을 평가하기 위해, XTT (나트륨 2, 3-비스 (나트륨 2, 3-질소-5-설포페닐)-5-[(페닐아미노)-카보닐]-2H-테트라졸륨 내부 염) 세포 생존성 분석이 수행되었다. 48h에 대해 2(200 μg/mL)로 처리된 HeLa 세포는 대조군 세포에 비해 세포 생존력의 손실을 나타내지 않았다. 이 관측은 AuNCs가 생물학 연구에서 응용을 위한 형광 탐사선으로 유망한 후보를 만드는 생체 적합성이다는 것을 건의합니다.

405 nm 레이저로 흥분할 때, 2는 최대 ~750 nm의 광범위한 방출을 제공한다. 매우 큰 스토크스 시프트(~350 nm)를 통해 방출된 빛이 흥미진진한 광원과 안정적으로 구별될 수 있습니다. 그러나 FCM 필터 설정을 적절하게 구성해야 합니다. 2의 경우 780/60 nm 대역 통과 필터는 필터의 광범위성과 AuNC의 방출 최대가 동일한 영역에 있다는 사실 때문에 이상적입니다. PL,39, 40,41,42의효율적인 검출을 위해 방출 최대의 영역에서 광범위한 대역 통과 필터를 사용하는 것이 매우 중요합니다.,40, 2로 처리된 세포로부터의 시간 및 용량 의존성 형광 신호는 FCM이 AuNCs를 사용하여 세포 연구를 편리하게 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 배양 시간이 24시간으로 증가했을 때, 40 μg/mL 농도2는 FCM에서형광에 의해 AuNCs를 검출하기에 충분하였다(데이터는 도시되지 않음). 그러나 짧은 배양 시간 (1-2 시간)에는 AuNCs의 높은 농도가 필요합니다. 표준 유동 세포계를 사용하여 NIR 형광 신호로 AuNCs를 검출하는 이 방법은 생물 의학 과학에서 AuNCs의 잠재적 응용 을 더욱 넓히는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서 기술된 접근은 세포 수용소의 비율 그리고 기계장치14,나노입자 농도 와 세포 독성 사이 관계, 또는 FCM를 사용하여 나노 클러스터 관양에 표면 화학의 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

HeLa 세포에 의한 2의 세포 세포 섭취는 CLSM에 의해 이미지화되었다. 24시간 배양 후 밝은 적색 방출 2를 405 nm 레이저로 여기시 검출하였습니다. 그러나, 405 nm 레이저는 또한 세포 안쪽에 본질적인 형광단을 흥분시킵니다. AuNC의 신호를 자가형광과 구별하기 위해, AuNC로부터의 방출은 650 nm 이상으로 수집되었다. 밝은 근적외선 발광, 높은 콜로이드 안정성, 양호한 생체 적합성 및 위의 결과와 같은 매력적인 특성은 AuNCs가 생물 의학 및 세포 이미징 응용 분야에서 유망한 이미징 에이전트임을 보여줍니다.

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Disclosures

방법 및 결과의 일부 이전에 Pramanik 등18 여기에 의해 문서에 제시 되었다, 이러한 방법은 실용적인 포인트 별 프로토콜으로 변환 되었습니다. 저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 유세포측정에 대한 그녀의 도움에 대한 알츠베타 마돌레노바에 감사드립니다. 저자는 GACR 프로젝트 Nr. 18-12533S의 재정 지원을 인정합니다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다, 프로젝트 없음. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515, 체코-바이오이미징 대형 RI 프로젝트 LM2015062에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

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Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

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